苗雨田 楊悠悠 王 浩 劉 佟 楊永壇

氣相色譜-質(zhì)譜法測定食用油中3-氯丙醇酯

苗雨田 楊悠悠 王 浩 劉 佟 楊永壇

（中糧營養(yǎng)健康研究院北京市營養(yǎng)健康與食品安全重點實驗室，北京 102209）

采用堿水解方式，基于苯基硼酸（PBA）衍生化方法并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀測定了食用油中3-氯丙醇（3-MCPD）酯的含量。經(jīng)試驗可知，水解時間是堿水解樣品前處理方法的關(guān)鍵因素，經(jīng)優(yōu)化，大豆油等不同品類的食用油的最佳水解時間為1～6 min。另外，以大豆油為基質(zhì)，考察了基于堿水解方式的分離分析方法的回收率、重復(fù)性以及檢出限。其中，在150～1 500μg／kg范圍內(nèi)進(jìn)行3水平加標(biāo)回收試驗，回收率為94%～105%、RSD 為3.7%～10.8%、檢出限為15 μg／kg，定量限為50 μg／kg。本方法能夠滿足日常樣品中3-氯丙醇（3-MCPD）酯的檢測。

3-氯丙醇（3-MCPD）酯 食用油 堿水解 水解時間 氣相色譜-質(zhì)譜

3-氯丙醇（3-MCPD）酯是由甘油酯中1號或者3號位的羥基被氯原子取代而形成的一氯取代物，無色，具有愉快性香味。易溶于乙醇，水，乙醚，丙酮［1］。1980 年Davidek 等［1］在酸水解植物蛋白（HVP）中發(fā)現(xiàn)3-氯丙醇（3-MCPD）酯，此后陸續(xù)有研究者在各類熱加工食品中發(fā)現(xiàn)不同水平的3-MCPD酯［2-6］。3-MCPD酯主要形成于食品的加工過程中，尤其是熱加工過程，如油脂的精煉、氫化、脫臭等［7］。3-MCPD酯目前引起人們的廣泛關(guān)注主要是由于3-MCPD酯被人體攝入后，會被脂肪酸酶水解成游離的3-MCPD，3-MCPD具有潛在的致癌性，并且能抑制雄性激素的分泌，使精子數(shù)減少，精子活性降低，生殖能力減弱，甚至不育［8］。

3-MCPD酯測定方法的研究已經(jīng)成為食品安全檢測的熱點之一［9］，目前對油脂中3-MCPD的測定主要有間接測定和直接測定的方法，間接測定的原理是將3-MCPD酯水解形成游離的3-MCPD，再將3-MCPD進(jìn)行衍生，使用GC-MS進(jìn)行測定，而直接測定是將樣品凈化后經(jīng)液相色譜分離再使用質(zhì)譜測定［10］。直接分析的方法比較難獲得所需要的標(biāo)準(zhǔn)品且費用較高。間接法經(jīng)濟(jì)，所需標(biāo)準(zhǔn)品種類少，且靈敏度較高。間接法測定過程中，衍生化試劑有丙酮、全氟?；溥颍℉FBI）和苯基硼酸（PBA）等［11］。丙酮在衍生時，需要利用甲苯-4-磺酸進(jìn)行催化［12］；HFBI可與許多氯丙醇作用，在羥基上引入七氟丁?；?，HFBI法衍生前需要確保溶液經(jīng)過充分的脫水，此外還要采用硅藻土基質(zhì)固相分散萃取法凈化，操作復(fù)雜、繁瑣，并且HFBI試劑價格很高［13］；PBA只能與二醇類發(fā)生專一性化學(xué)反應(yīng)，可直接在水溶液中與3-MCPD反應(yīng)［14］，所需前處理步驟較少，成本較低，在3-MCPD酯檢測中較為常用。目前間接法測定3-MCPD酯的檢出限為27 ～1 000 μg／kg［15］。

本研究采用間接測定方式，利用堿水解對樣品進(jìn)行樣品前處理，優(yōu)化了不同食用油的水解時間；使用PBA作為衍生化試劑，評價了衍生化時間對測定結(jié)果的影響；最后，使用GC-MS進(jìn)行了目標(biāo)化合物的測定。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆油、花生油、菜籽油等9種食用油：市售；3-MCPD酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%、氘代同位素3-MCPD-d5酯（3-MCPD-1，2-dilaurate-d5）標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲基叔丁基醚（MTBE，色譜純）、苯基硼酸（PBA，分析純）：德國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫GC 7890B-5977MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS色譜柱（30 m ×0.25 mm ×0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；TTL-DCⅡ氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 堿水解

分別稱?。?00±5）mg大豆油等9種食用油樣品，加入氘代同位素內(nèi)標(biāo)3-MCPD-d5酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100μL甲基叔丁基醚（MTBE），漩渦使其充分溶解并混勻。向其中加入200μL 25 g／L NaOH甲醇溶液（25 g NaOH溶解到1 L甲醇中，現(xiàn)用現(xiàn)配），漩渦震蕩0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10 min 后立即加入600 μL NaBr-H2SO4混合溶液（3.5 mL 25%H2SO4溶解在100 mL 600 g／L的NaBr溶液），渦旋充分混勻。其后加入600μL正己烷，充分渦旋后靜置至少5 min，待溶液分層后，棄去上層正己烷溶液，重復(fù)萃取2次。最后加入600μL乙醚-乙酸乙酯混合溶液（3∶2），充分渦旋后靜置，將上層溶液轉(zhuǎn)移至10 mL裝有少量無水MgSO4玻璃試管中，重復(fù)萃取3次。合并萃取液待用。

1.3.2 衍生化

向堿水解萃取液中加入100μL飽和苯基硼酸（PBA）溶液（溶劑為乙醚），渦旋混勻，反應(yīng)時間為1～12 min。

1.3.3 純化

將衍生液用氮氣緩慢吹干，用1 mL正己烷復(fù)溶，渦旋1 min，靜置1 min。將上清液過膜轉(zhuǎn)移至2 mL小瓶中，GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS 分析

色譜條件：進(jìn)樣口溫度：280℃；程序升溫條件：初始溫度85℃，保持12 min，以20℃／min升至165℃，保持10 min，然后再以20℃／min升至300℃，保持8 min；載氣：高純氦氣，流速為1 mL／min；進(jìn)樣方式：脈沖不分流；進(jìn)樣體積：1μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；溶劑延遲6 min；掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 3-MCPD和3-MCPD-d5衍生物定性離子與定量離子的確定

樣品中的3-MCPD酯在水解后會生成游離的3-MCPD，經(jīng)過PBA衍生后形成相應(yīng)的衍生物。m／z＝196，198分別為3-MCPD衍生物氯35和氯37的分子離子峰，m／z＝201，203分別是3-MCPD-d5衍生物氯35和氯37的分子離子峰。m／z＝147，150分別是3-MCPD衍生物和3-MCPD-d5衍生物分子離子峰失去-CH2Cl和-CD2Cl后形成的基峰［16］。因此，選用m／z＝147 和m／z＝150 分別作為3-MCPD衍生物和3-MCPD-d5衍生物的定量離子，具有干擾小，靈敏度高等優(yōu)點。定性離子則分別為：m／z＝91、147、196、198 和m／z 149、150、201、203。另外，如圖1所示，采用SIM模式時，3-MCPD衍生物和3-MCPD-d5衍生物的分離情況較好，且互不干擾，滿足高靈敏度高準(zhǔn)確度的要求。

圖1 3-MCPD和3-MCPD-d5選擇離子圖

2.2 堿水解樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 水解時間

水解時間過短，可能會造成水解反應(yīng)不徹底，不能得到全部的游離3-MCPD，若水解時間過長，3-MCPD酯已經(jīng)被完全水解，在強堿性條件下，3-MCPD會進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，衍生化時間的優(yōu)化至關(guān)重要。

圖2結(jié)果顯示，不同食用油最佳水解時間不相同。以棕櫚油為例，當(dāng)水解時間為2 min時，響應(yīng)值為最大響應(yīng)值的78.6%。當(dāng)水解時間為2.5 min時，響應(yīng)值達(dá)到最大，相應(yīng)值為12 402。水解時間延長后，響應(yīng)值逐漸降低，當(dāng)水解時間為10 min時，響應(yīng)值僅為最大響應(yīng)值的41.9%。因此在0.5～2.5 min，3-MCPD 酯處于水解階段，而在2.5～10 min是3-MCPD的消除階段。因此水解時間選擇為2.5 min。由圖2可知，大豆油的最佳水解時間為1 min?；ㄉ驮谒鈺r間為1.5 min時，響應(yīng)值達(dá)到最大。芝麻油和橄欖油的最佳水解時間分別為2.5 min和1.5 min，而玉米油、葵花籽油和葡萄籽油的最佳水解時間都為2 min。本研究中菜籽油在水解時間為2.5 min時，響應(yīng)值達(dá)到最大，而傅武勝等［17］對菜籽油的水解時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為1 min，與本試驗結(jié)果的2.5 min不相同，這是由于NaOH甲醇溶液的用量或NaOH濃度不同造成。

圖2 水解時間對9種食用油3-MCPD衍生物響應(yīng)值的影響

2.2.2 衍生化時間

3-MCPD是含有2個醇羥基，極性較大，容易造成襯管內(nèi)的吸附。另外，分離時會造成色譜峰的拖尾。因此，測定時需要先將3-MCPD衍生化，本研究采用PBA為衍生化試劑，可與3-氯丙醇反應(yīng)為極性較小的苯基硼酸3-氯丙二醇酯。

以棕櫚油為研究對象，分別衍生1～12 min，重復(fù)試驗3次（圖3）。結(jié)果顯示，3-MCPD衍生物的響應(yīng)與衍生時間并無線性關(guān)系，隨著衍生時間的變化，衍生物響應(yīng)值無明顯變化，因此本試驗衍生時間選用1 min。

圖3 衍生時間對3-MCPD酯衍生物響應(yīng)的影響

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 回歸方程、檢出限和定量限

以內(nèi)標(biāo)3-MCPD-d5衍生物和3-MCPD衍生物面積比值Y和折算后樣品中3-MCPD酯的濃度X（μg／kg）（以3-MCPD 濃度計）計算線性回歸方程。以3倍信噪比（S／N＝3）作為檢出限，10倍信噪比（S／N＝10）作為定量限。在最優(yōu)條件下，線性回歸方程、檢出限和定量限的結(jié)果見表1。

表1 堿水解方法回歸方程

2.3.2 精密度和回收率

以大豆油為基質(zhì)，進(jìn)行3個水平的3-MCPD酯的加標(biāo)回收試驗，各加標(biāo)水平重復(fù)6次，堿水解方法下，3-MCPD的加標(biāo)回收率為94%～105%，3-MCPD酯測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.7%～10.8%。結(jié)果見表2。

表2 3-MCPD酯堿水解前處理方法回收率

通過回歸方程、檢出限、定量限、精密度及回收率等方法學(xué)參數(shù)可知，回收率和精密度均符合GB／T 27404—2008的要求。本方法對食用油中3-MCPD酯的測定具有靈敏度高，特異性好，精密度高的特點，能夠滿足日常檢測的需求。

2.4 實際樣品檢測

采用堿水解樣品前處理方法建立的食用油中3-MCPD酯的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法對市場中常見9種植物油中的3-MCPD酯含量進(jìn)行了檢測分析，如表3所示，大豆油和橄欖油中未檢出3-MCPD酯。而花生油等食用油中3-MCPD酯均有檢出。其中，葵花籽油含量最低，棕櫚油中含量最高，應(yīng)進(jìn)一步加強對食用油中3-MCPD酯的監(jiān)測和管理。植物油脂中3-MCPD酯的形成尚未完全清晰，多數(shù)研究表明是以?；视蜑榍绑w生成3-MCPD酯［18］?？赡苁窃谟椭摮暨^程中甘油三酯直接被氯化生成3-MCPD酯［18-20］，或者甘油三酯先生成了環(huán)酰氧鎓離子再與氯離子反應(yīng)生成3-MCPD酯［21］。

表3 9種食用油中3-MCPD酯的含量（以3-MCPD計）

研究顯示，當(dāng)溫度超過200℃時，3-MCPD酯的形成急劇增加，尤其是超過240℃［22］。在大豆油精煉過程中采用的是水化脫膠，在脫臭過程中酸性物質(zhì)較少，與氯離子的反應(yīng)較少。而在棕櫚油等植物油的精煉過程中采用的是磷酸脫膠和活化白土脫色的工藝［23］，高溫脫臭過程中酸性條件較強，加大了氯離子的取代反應(yīng)，增加了3-MCPD酯的生成。因此，大豆油中未檢測到3-MCPD酯，而在棕櫚油中3-MCPD 酯的含量較高，為7.31 mg／kg。從國內(nèi)外近年來的相關(guān)報道可以知道，油脂精煉過程是產(chǎn)生3-MCPD酯的主要途徑，因此，在油脂精煉工序中，要加強對一些工藝因素如加水量、酸用量、酸種類、脫臭溫度、脫臭時間等的控制和優(yōu)化。

3 結(jié)論

本方法針對不同食用油對堿水解中所需水解時間進(jìn)行了優(yōu)化，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，經(jīng)優(yōu)化的堿水解方法具有定性準(zhǔn)確，精密度高，靈敏度高等特點，能滿足對食用油中3-MCPD酯分析的要求。采用本方法對市場中9種食用油的分析結(jié)果顯示，除大豆油、橄欖油外，均含有不同含量的3-MCPD酯，其中，棕櫚油含量最高，因此應(yīng)加強對食用油中3-MCPD酯的監(jiān)管。

［1］Davidek J，Velisek J，Kubelka V，et al.Glycerol chlorohydrins and their ester as products of the hydrolysis of tripalmitin，tristearin and triolein with hydrochloric acid［J］.Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung，1980，171：14-17

［2］Svejkovska B，Novotny O，Divinova V，et al.Esters of 3-chloropropane-1，2-diol in foodstuffs［J］.Czech Journal of Food Sciences，2004，22：190-196

［3］Dolezal M，Chaloupska M，Divinova V，et al.Occurrence of 3-chloropropane-1，2-diol fatty acid esters in coffee［J］.European Food Research Technology，2005，221：221-225

［4］Zelinkova Z，Svejkovska B，Velisek J，et al.Fatty acid esters of 3-chloropropane-1，2-diol in edible oils［J］.Food Additives and Contaminants，2006，23：1290-1298

［5］Kuntzer J，Weisshaar R.3-MCPD-The smoking process-Apotent source for 3-chloropropane-1，2-diol（3-MCPD）in meat products［J］.Deut Lebensm Rundsch，2006，102：397-400

［6］Larsen J C.3-MCPD esters in food products［M］.Brussels：ILSI Europe，2009：1-25

［7］Hamlety CG，Sadd PA，Crews C.Occurrence of 3-chloropropane-1，2-diol（3-MCPD）and related compounds in foods：a review ［J］.Food Additives and Contaminants，2002，19：619-631

［8］趙丹宇.氯丙醇安全性的最新評價［J］.中國食品法典通訊，2001（4）：19-21

Zhao Danyu.A new evaluation of the safety of chloropropanols［J］.Chinese Food Code Communication，2001，4：19-21

［9］張蕊，謝剛，張艷，等.食用油中3-氯-1，2-丙二醇酯檢測方法的研究進(jìn)展［J］.中國糧油學(xué)報，2012（12）：122-128

Zhang Rui，Xie Gang，Zhang Yan，et al.Research progress on the detection method of 3-chloropropane-1，2-diol（3-MCPD）［J］.Journal of China National Cereals and Oils，2012，12：122-128

［10］王力清，陳洪濤，黃翠莉，等.食用油脂中3-MCPD脂肪酸酯和縮水甘油脂肪酸酯分析方法研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2014（4）：6-9

Wang Liqing，Chen Hongtao，Huang Cuili，et al.Research progress on the analysis method of 3-MCPD esters and glycerol ester fatty in edible oils ［J］.Food and Oil，2014（4）：6-9

［11］Wenzl T，Ulberth F.Proficiency test on the determination of 3-MCPD esters in edible oil［EB／OL］.JRCScientific and Technical Reports，2010，EUR 24356 EN.http：／／irmm.jrc.ec.quropa.eu／html／interlaboratory-comparisons／3-mcpd／index.htm

［12］Weisshaar R.Determination of total 3-chloropropane-1，2-diol in edible oil by GC-MS after ester cleavage with sodium methoxide［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2008，110：183-186

［13］Zelinkova Z，Svejkovska B，Velisek J.Fatty acid esters of 3-chloropropane-1，2-diol in edible oils［J］.Food Additives and Contminants，2006，23：1290-1298

［14］Kuhlmann J.Determination of bound 2，3-epoxy-1-propanol （glycidol） and bound monochloropropanediol（MCPD）in refined oils［J］.Eur J Lipid Sci Technol，2011，113：335-344

［15］王衛(wèi)華，徐銳鋒，劉軍，等.5種食品中氯丙醇測定方法研究進(jìn)展［J］.化學(xué)分析計量，2007，16：74-76

Wang Weihua，Xu Ruifeng，Liu Jun，et al.Research progress on determination method of the chlorine alcohol［J］.Chemical Analysis Measurement，2007，16：74-76

［16］嚴(yán)小波，吳少明，里南，等.油脂性食品中脂肪酸氯丙醇酯檢測方法的研究進(jìn)展［J］.色譜，2013，2：95-101

Yan Xiaobo，Wu Shaoming，Li Nan，et al.Research progress of detection method of chloride isopropyl ester in oils and fats ［J］.Chromatography，2013，2：95-101

［17］傅武勝，嚴(yán)小波，呂華東.氣相色譜-質(zhì)譜法測定植物油中脂肪酸氯丙醇酯［J］.分析化學(xué)，2012，40：1329-1335

Fu Wusheng，Yan Xiaobo，Lü Huadong.Determination of chloride isopropyl ester in vegetable oils by gas chromatography ／mass spectrometry ［J］.Analytical Chemistry，2012，40：1329-1335

［18］Rahn A K K，Yaylayan V A.What do we know about the molecular mechanism of 3-MCPD ester form action？［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2011，113：323-329

［19］Svejkovska B，Dolezal M，Velisek J.Form action and decom position of 3-chloropropane-1，2-diol esters in models simulating processed foods［J］.Czech J Food Science and Technology，2006，24：172-179

［20］Yaylayan V A.Molecular mechanism of 3-MCPD esters form action：facts and hypothesis［R］.Belgium：ILSIWorkshop on 3-MCPD Esters，2009

［21］Hemlet C G，Sadd P A，Gray D A.Generation of mono chloropropaned iol（MCPDs）in model dough systems L.leavened doughs［J］.Agriculture and Food Chemistry，2004，52：2059-2066

［22］楊嬌，金青哲.食用植物油中3-氯丙醇酯的研究進(jìn)展［J］.中國油脂，2011（9）：1-4

Yang Jiao，Jin Jin.Research progress of 3-MCPD esters in edible vegetable oil［J］.China Oils and Fats，2011（9）：1-4

［23］Ramli M R，Siew W L，Ibrahim N A，et al.Effects of degumming and bleaching on 3MCPD esters formation during physical refining ［J］.J Am Oil Chem Soc，2011，88（11）：1839-1844.

Determination of 3-chloropropanol-1，2-diol（3-MCPD）Esters in Edible Oil by Gas Chromatography and Mass Spectrometry

Miao Yutian Yang Youyou Wang Hao Liu Tong Yang Yongtan
（China Oil Nutrition and Health Research Institution，Beijing Nutrition Health and Food Safety Key Laboratory，Beijing 102209）

3-chloropropanol-1，2-diol（3-MCPD）esters in edible oil was determined by alkaline hydrolysis method and gas chromatography／mass spectrometry （GC-MS）based on derivatization with phenylboronic acid（PBA）.The experiment shows that the hydrolysis time was a critical factor in alkaline hydrolysis sample pretreatment procedures.The optimum hydrolysis time of different edible oils ranges from 1min to 6 min upon optimization.The recovery，repeatability and detection limit of the separation and analysis method based on alkaline hydrolysis method were evaluated with soybean oils as the research model.Based on the three levels marking recovery experiment in the range of 150～1 500 μg／kg，the recovery was between 94%and 105%，while the relative standard deviation ranges from 3.7%～10.8%.In addition，the limit of detection （LOD）and the limit of quantification were 15 μg／kg and 50 μg／kg，respectively.This method could meet with requirements of the routine detection of 3-chloropropanol-1，2-diol（3-MCPD）esters in edible oil.

3-chloropropanol-1，2-diol esters，edible oil，alkaline hydrolysis，hydrolysis time，gas chromatography／mass spectrometry

TQ646.4

A

1003-0174（2016）11-0135-05

中糧集團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2013-C2-F007）

2015-03-24

苗雨田，女，1988年出生，碩士，食品質(zhì)量與安全

楊永壇，男，1971年出生，研究員，食品質(zhì)量與安全