吳琴燕,陳 露,張文文,馬圣洲,趙 飛,莊義慶

(1. 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容212400; 2. 鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇鎮(zhèn)江212009)

高效液相色譜法測定茶鮮葉中游離多胺含量

吳琴燕1,陳 露1,張文文2,馬圣洲1,趙 飛1,莊義慶1

(1. 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容212400; 2. 鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇鎮(zhèn)江212009)

建立高效液相色譜測定茶鮮葉中腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)3種游離多胺的方法。樣品經(jīng)過67 g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)吸附茶多酚，5%(體積分?jǐn)?shù))高氯酸低溫提取，苯甲酰氯衍生后進(jìn)行色譜分析，采用Wondasil C18(4.6 mm×150 mm)色譜柱，以甲醇和水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min。結(jié)果表明：3種多胺在5～60 nmol/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.980,檢出限為0.11～0.41 nmol/L，定量限0.55～2.05 nmol/L，加標(biāo)回收率為88.5%～105.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.99%～7.20%。利用此方法分別對茶鮮葉中芽、葉和莖的多胺含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)3種樣品中多胺均有檢出。該方法準(zhǔn)確、靈敏度高且重現(xiàn)性好，為茶鮮葉中多胺含量的研究提供檢測手段。

茶鮮葉；腐胺；亞精胺；精胺；高效液相色譜

多胺是生物代謝過程中具有生理活性的一類有機(jī)小分子物質(zhì)，植物體內(nèi)主要有腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)等，它們與植物的生長發(fā)育關(guān)系密切[1]。在環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)積累大量的多胺物質(zhì)，對穩(wěn)定細(xì)胞膜、核酸及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的構(gòu)象有重要作用[2-3]。茶葉是我國傳統(tǒng)飲品之一，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和藥理成分，如茶多酚、氨基酸、蛋白質(zhì)、芳香物質(zhì)、糖、有機(jī)酸和維生素等，這些成分對茶葉的香氣、滋味、顏色以及營養(yǎng)、保健起著重要作用[4]，多胺在茶葉生長發(fā)育及品質(zhì)形成中的作用暫未見報道，因此檢測茶葉中多胺含量，探討多胺含量對茶葉生理代謝及品質(zhì)形成的影響是非常有意義的。

目前,大豆[5]、棉花[6]、蘋果[7]等植物中生物胺的檢測方法均有報道，主要采用化學(xué)衍生-高效液相色譜法[8]進(jìn)行檢測，由于多胺在植物組織中含量極低，干擾物質(zhì)較多，不同植物中提取檢測條件均有差異，該方法在茶葉上的使用是否滿足檢測方法的一般要求，準(zhǔn)確度和精密度是否滿足實際應(yīng)用要求都不明確。

本文針對茶葉富含茶多酚的特點，對傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，并用該法測定了茶鮮葉中芽、莖和葉3個部位游離多胺的含量，以期為茶葉中多胺的檢測建立新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

茶鮮葉采摘于2015年10月句容市龍山茶場，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽一葉，品種為龍井43號，采摘后將茶鮮葉分為芽、莖和葉3部分，采用干燥失質(zhì)量法(DB13/T 1236—2010)檢測茶鮮葉中的水分含量，按干基質(zhì)量為2 g一袋分裝，立即放入液氮預(yù)冷，之后于-18 ℃冰箱保存。

聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、石英砂、高氯酸(HClO4)、NaOH、苯甲酰氯、NaCl、乙醚、甲醇(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腐胺、亞精胺、精胺(標(biāo)準(zhǔn)品)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPD-15C型高效液相色譜儀(配有SPD-15C UV-VIS Spectrophotometric 檢測器(190～700 nm)，色譜柱為Wondasil C18(4.6 mm×150mm))，日本島津公司；PTFE針式過濾器0.45 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；pH計，Metrohm公司；Milli-Q超純水一體機(jī)，Milli-Q公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取干基質(zhì)量為2 g的茶樣品，加入PVPP 1 g，石英砂2 g和15 mL預(yù)冷體積比為5%的HClO4溶液碾磨至勻漿，冰浴中浸提1 h之后于4 ℃下10 000 r/min離心20 min；取上清液1 mL，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液，20 μL苯甲酰氯，充分混合后在37 ℃下反應(yīng)40 min。加入2 mL飽和 NaCl終止反應(yīng)，用3 mL乙醚萃取，取1.5 mL乙醚相，于40 ℃水浴干燥，用500 μL甲醇溶解后過0.22 μm微孔濾膜，取20 μL進(jìn)樣檢測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系及回收率

本實驗選擇較低的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度范圍進(jìn)行檢測，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別精密稱取腐胺、亞精胺和精胺對照品0.035 3、0.058 1和0.080 9 g，分別定容于10 mL容量瓶，得到40 mmol/L的單一對照品貯備液。精密量取3種對照品1 mL定容于100 mL容量瓶得到0.4 mmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋一定倍數(shù)，得到腐胺、亞精胺和精胺均為5、10、20、40和60 nmol/L的對照品溶液，根據(jù)樣品的前處理方法進(jìn)行衍生反應(yīng)，進(jìn)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

同一茶樣取12份，其中9份平均分為3組，每組樣品分別加入60、40和10 nmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液7.5 mL和提取劑7.5 mL，剩余3份加入與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液等體積的去離子水作為對照；按照所建立的方法對樣品進(jìn)行前處理及測定，考察茶葉中3種多胺的加標(biāo)回收率。

1.3.3 色譜條件

流動相A為水，流動相B為甲醇，柱溫為25 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測器波長為254 nm，梯度洗脫，洗脫程序：0～15 min，60%～65% B；15～20 min，65%B；20～25 min，65%～60%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件Duncan多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性水平為0.05，制圖通過Excel 2010完成，數(shù)據(jù)均為3次試驗的算術(shù)平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法條件的研究

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[8]報道，在堿性條件下，苯甲酰氯基團(tuán)鏈接到多胺的一級或二級胺基上，因而可以采用紫外檢測器。苯甲酰氯的保留時間和亞精胺非常接近且在用乙醚萃取時僅部分被萃取出來，以64%甲醇為流動性，流速0.5 mL/min，發(fā)現(xiàn)亞精胺峰與苯甲酰氯峰重疊且分離時間較長。

為了獲得更好的峰型，并盡量減少雜峰干擾，縮短出峰時間，本實驗增加流速至1.0 mL/min，采用梯度洗脫方法進(jìn)行分離，結(jié)果見圖1。由圖1可知：梯度選擇過大，各組分的保留時間均縮短，分離度降低，基線漂移嚴(yán)重，峰圖重疊；梯度斜率較小，出峰時間延長；而0～20 min內(nèi)，B相的濃度由60%上升至65%，有效分離了3種多胺，未出現(xiàn)重疊峰。

圖1 3種多胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 nmol/L)的色譜Fig.1 Chromatographic separation of the 3polyamines solution(20 nmol/L)

文獻(xiàn)[7-9]報道，苯甲酰化反應(yīng)的溫度在25～37 ℃、時間在20～120 min范圍內(nèi)可獲得較好的分離度。本實驗在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)溫度為37 ℃，時間為40 min，峰面積最大，且副反應(yīng)少。

2.1.2 前處理方法的確定

對植物組織一般采用0～4 ℃低溫研磨提取，苯甲酰氯衍生，檢測多胺含量[10-12]。多胺在生物體內(nèi)含量極低，茶葉中富含蛋白質(zhì)、纖維及酚類物質(zhì)[13-14]，很大程度上影響了多胺的提取分離，以高氯酸為提取劑，可沉淀蛋白質(zhì)和溶解多胺[15]，考察PVPP對茶多酚的吸附作用提取多胺，結(jié)果見圖2。由圖2可知：添加PVPP后，3種多胺檢出量變化顯著性提高,茶鮮葉腐胺、亞精胺和精胺檢出量分別約為0.016、0.031和0.101 mg/g。茶鮮葉中3種多胺的色譜峰如圖3所示。由圖3可知，3種多胺都得到了較好的分離，峰形良好。

圖2 添加PVPP對茶鮮葉多胺檢出量的影響Fig.2 Effects of adding PVPP on detectable amount of polyamines in fresh tea leaves

圖3 茶鮮葉中3種多胺的色譜Fig.3 Chromatogram of the 3 polyaminesin fresh tea (added PVPP)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

對配制的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行衍生并測定，以多胺溶液的濃度X(nmol/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得到3種多胺的回歸方程，結(jié)果見表1。由表1可知：在5～60 nmol/L范圍內(nèi)，方程線性良好。以3倍信噪比(S/N>3)計算出檢出限，10倍信噪比(S/N>10)計算出定量限，結(jié)果表1。

由表1可知：3種多按的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)都在0.980以上，說明該方法可以用于多胺的提取測定，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于后續(xù)樣品測定的數(shù)據(jù)計算。

2.2.2 回收率和精密度

取茶鮮葉2 g，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入樣品中，進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。由表2可知：樣品的回收率為88.4%～105.5%，滿足檢測要求。

2.3 實際樣品檢測

利用本研究建立的分析方法，分別對茶鮮葉中芽、葉和莖的多胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。由圖4可知：發(fā)現(xiàn)3種多胺均有檢出，其含量由高到低均為精胺、亞精胺和腐胺。精胺在茶鮮葉不同部位含量由高到低分別為芽、莖、葉，分別為0.12 、0.10和0.045 mg/g，亞精胺和腐胺含量在茶鮮葉不同部位無顯著性差異，分別約為0.029和0.018 mg/g。

表1 3種多胺的線性關(guān)系、檢出限及定量限Table 1 Linear regression equations,limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) for the three polyamines

表2 樣品測定值與回收率(n=3)Table 2 Recovery and precisions of the 3 free-polyamines in fresh tea leaves(n=3)

圖4 茶鮮葉中不同部位多胺含量Fig.4 Polyamines contents in different parts of fresh tea

3 結(jié)論

本文采用PVPP吸附茶多酚，高氯酸提取溶解多胺，建立了高效液相色譜法測定茶鮮葉中腐胺、亞精胺和精胺的分析方法。利用該方法對茶鮮葉中不同部位多胺含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3種多胺均有檢出，其含量由高到低均為精胺、亞精胺和腐胺。精胺在茶鮮葉不同部位含量由高到低分別為芽、莖、葉，分別為0.12、0.10 和0.045 mg/g，亞精胺和腐胺含量在茶鮮葉不同部位無顯著性差異，分別約為0.029和0.018 mg/g。該方法具有較好的靈敏度、回收率和重復(fù)性，可用于茶鮮葉中多胺含量檢測。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Determination of free polyamines in fresh tea leaves by highperformance liquid chromatography

WU Qinyan1,CHEN Lu1,ZHANG Wenwen2,MA Shengzhou1,ZHAO Fei1,ZHUANG Yiqing1

(1. Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hill Area of Jiangsu Province,Jurong 212400,China;2. Agricultural Committee of Zhenjiang City,Zhenjiang 212009,China )

We determined putrescine (Put),spermidine (Spd) and spermine (Spm) in fresh tea leaves by high performance liquid chromatography.The samples were extracted with 5% (V/V) perchloric acid (HClO4) containing 67 g/L PVPP (w/V),and then the three free-polyamines were derivatized with benzoyl chloride as derivatization agent.The polyamine derivatives were separated on a C18 column by HPLC with ultrapure water and methanol as mobile phases at a flow rate of 1.0 mL/min.The linearity was excellent in the range between 5 and 60 nmol/L with the correlation coefficients above 0.980.The limits of detection(S/N=3) were between 0.11 and 0.41 nmol/L,and the limits of quantification (S/N=10) were between 0.55 and 2.05 nmol/L.The recovery of standard addition was between 88.5% and 105.5% with the relative standard deviations (n=3) between 0.99% and 7.20%.Based on this method,the 3 free polyamines were checked out in bud,leaf and stem of fresh tea leaves.The results indicated that the method is sensitive,efficient and accurate.It is suitable for the simultaneous determination of the 3 free polyamines in fresh tea leaves.

fresh tea leaves; putrescine (Put); spermidine (Spd); spermine (Spm); high performance liquid chromatography (HPLC)

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.012

2016-00-00

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金(CX(14)2122)

吳琴燕(1981—)，女，湖北咸寧人，副研究員，研究方向：茶葉加工；莊義慶(聯(lián)系人)，研究員，E-mail：314344170@qq.com

O657.63

A

1672-3678(2016)06-0066-05