郁川，翟崇凱，廖成水，余祖華，何雷，賈艷艷，李靜，張春杰，程相朝,2

1 河南科技大學 動物科技學院 動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南 洛陽 471003

2 洛陽職業(yè)技術學院，河南 洛陽 471003

減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌表達系統(tǒng)的構建及其特性

郁川1*，翟崇凱1*，廖成水1，余祖華1，何雷1，賈艷艷1，李靜1，張春杰1，程相朝1,2

1 河南科技大學 動物科技學院 動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南 洛陽 471003

2 洛陽職業(yè)技術學院，河南 洛陽 471003

郁川, 翟崇凱, 廖成水, 等. 減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌表達系統(tǒng)的構建及其特性. 生物工程學報, 2016, 32(12): 1664-1675.

Yu C, Zhai CK, Liao CS, et al. Construction and characterization of type III secretion system of attenuatedSalmonella typhimurium.Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1664-1675.

為開發(fā)新型重組減毒鼠傷寒沙門菌口服活疫苗載體，本研究以pYA3493質粒為基礎，用鼠傷寒沙門菌sopENt100基因及其啟動子替代原有的Ptrc啟動子，構建沙門菌三型分泌表達載體pYA-sopENt100；再將質粒pYA-sopENt100電轉入沙門菌ΔcrpΔasdSL1344，構建減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表達系統(tǒng)，研究其生物學特性，進一步將報告基因egfp克隆入sopE基因下游，構建重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)，感染Vero細胞，用Western blotting分析該系統(tǒng)遞呈外源抗原的能力。PCR、酶切及測序結果表明，減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表達系統(tǒng)構建成功；生物學特性鑒定結果表明，其血清型與親本株ΔcrpSL1344及野生株SL1344保持一致；其生化特性與親本株基本相近，但與野毒株相比發(fā)生明顯變化；生長速度也更為緩慢；重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 的LD50較野生株SL1344降低了7.0×104倍；Western blotting結果發(fā)現(xiàn)，重組菌培養(yǎng)上清中能檢測到SopENt100-egfp融合蛋白(37 kDa)；重組菌株感染Vero細胞后，可以同時檢測到SopENt100-egfp融合蛋白 (37 kDa) 和EGFP蛋白 (27 kDa)。以上結果證實，本研究成功構建了新型減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasd(pYA-sopENt100) 三型分泌表達系統(tǒng)，其能夠有效遞呈外源抗原，該重組菌株有潛力作為安全、穩(wěn)定、高效表達外源基因的口服重組活疫苗載體。

減毒鼠傷寒沙門菌，三型分泌系統(tǒng)，sopE基因，平衡致死系統(tǒng)，活疫苗載體

鼠傷寒沙門菌屬腸桿菌科沙門菌屬的B血清群成員，具有廣泛感染的宿主譜，也是一種重要的人畜共患病原菌，在醫(yī)學、獸醫(yī)學和公共衛(wèi)生上均具有十分重要的意義[1-2]。通過基因工程減毒的鼠傷寒沙門菌毒力降低，但能保持良好的免疫原性，能有效地刺激機體產(chǎn)生粘膜、細胞和體液免疫應答[3-4]。另外，減毒沙門菌LPS作為內(nèi)在佐劑，可以刺激宿主細胞釋放各種細胞因子以及增強樹突狀細胞捕獲和加工MHC-I類抗原的能力，有利于將重組沙門菌的抗原呈遞給特異性的B、T細胞[5-6]。因此，減毒鼠傷寒沙門菌是攜帶抗原的良好載體和天然粘膜免疫佐劑，這已受到醫(yī)學與獸醫(yī)學的廣泛關注[7-8]。

沙門菌質粒平衡致死載體系統(tǒng)的建立有效解決了外源質粒的不穩(wěn)定攜帶和表達以及耐藥基因潛在的生物安全性問題[9-10]。asd質粒平衡致死系統(tǒng)是基于缺失載體菌的編碼二氨基庚二酸 (DL-α，ε-Diaminopimelicacid，DAP) 合成酶的基因而開發(fā)的載體表達系統(tǒng)。asd基因(Aspartic semialdehyde dehydrogenase) 編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必需酶，asd突變株在無外源DAP條件下不能形成完好的細胞壁，最終溶菌死亡。然而外源的抗原基因可被克隆至asd+的質粒中與突變菌形成互補，使重組菌在無外源DAP 存在的條件下仍能存活[11-12]。本實驗室為開發(fā)新型鼠傷寒沙門菌口服活疫苗載體，在缺失編碼cAMP受體蛋白 (cAMP receptor protein，crp) 基因[13]的沙門菌基礎上成功構建出減毒鼠傷寒沙門菌平衡致死系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-3493)[14]。

鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng) (type Ⅲsecretion system，T3SS) 與細菌的定殖、侵染以及在宿主細胞內(nèi)的存活有著密切的關系[15]。T3SS通過一個復雜的針頭復合物將外源蛋白注入宿主細胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細胞的功能。沙門菌外膜蛋白E (Salmonella outer protein E，sopE)是T3SS的一種重要的功能蛋白，它通過與Cdc42 和 Rac1相互作用，激活Rho GTPase，從而導致膜波動和肌動蛋白細胞骨架重組，促進沙門菌內(nèi)化到宿主細胞[16]。此外，已經(jīng)證實SopE氨基末端100個氨基酸 (sopENt100) 是分泌和轉位區(qū)域，能夠作為一種外源蛋白運輸工具，可以高效輸送異源蛋白到真核細胞胞質[17]。另外，在真核細胞內(nèi)SopE蛋白能夠迅速地被泛素化處理和被蛋白酶體降解，不僅有利于外源抗原的遞呈，而且對宿主細胞自身的毒性較小[18]。

綜上所述，本試驗在減毒鼠沙門菌平衡致死系統(tǒng)的基礎上，利用鼠傷寒沙門菌III型分泌系統(tǒng)高效遞呈外源抗原的優(yōu)勢，構建減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表達系統(tǒng)，進一步研究該系統(tǒng)遞呈外源抗原的能力及其生物學特性，進而為研發(fā)更加安全、有效、穩(wěn)定的新型重組減毒鼠傷寒沙門菌口服活疫苗載體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、細胞及培養(yǎng)條件

鼠傷寒沙門菌SL1344強毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所，質粒pEGFP-N1購自Invitrogen公司，無抗性原核表達載體pYA3493 (asd+，pBRori，β-lactamase signal sequence) 及其宿主菌χ6097 (araΔ(lac-pro) rPslΔasdA4Δ[zhf-2:: Tn10] thiф80d/lacZΔM15) 由美國華盛頓大學Dr. Roy Curtiss Ⅲ教授惠贈，鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344由本室構建保存[14]，大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌在各種培養(yǎng)基中37 ℃靜置或振搖培養(yǎng)，各培養(yǎng)基根據(jù)需要加入終濃度為50 μg/mL DAP、50 μg/mL的慶大霉素。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實驗動物

沙門菌屬診斷血清及各種單因子血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；DAP購自Sigma-Aldrich 公司；TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、dNTPs、DNA marker、T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司；鼠抗EGFP單抗及HPR標記兔抗鼠IgG購自Abcam；質粒小量提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；凝膠回收試劑盒購自生工生物工程有限公司；麥康凱瓊脂和生化鑒定試劑均購自杭州天和微生物試劑有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；1日齡健康羅曼雛雞，按常規(guī)方法檢測均為沙門菌抗體陰性[19]。

1.3 引物設計與合成

根據(jù)鼠傷寒沙門菌 (GenBank Accession No. AE008859)sopE基因的啟動子和分泌信號序列以及質粒pEGFP-N1中EGFP的全基因序列，運用Primer 5.0引物設計軟件設計引物并由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成(表1，引物中的斜體部分為酶切位點)。

1.4 沙門菌三型分泌表達載體的構建及鑒定

以質粒pYA3493為基礎，用鼠傷寒沙門菌sopE基因的啟動子及分泌信號序列替代原有的Ptrc啟動子，構建沙門菌三型分泌表達載體pYA-sopENt100(圖1)；將egfp報告基因插入pYA-sopENt100下游，構建重組標記載體pYA-sopENt100-egfp。然后分別將質粒pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp轉化大腸桿菌χ6097，取100 μL涂布于LB平板上。15?18 h后挑取無色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質粒進行PCR、酶切和測序鑒定。

表1 PCR擴增所用的引物序列Table 1 The primer sets for PCR in this study

圖1 重組質粒pYA-sopENt100構建示意圖Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid pYA-sopENt100.

1.5 重組菌株的構建及鑒定

10 μL pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp質粒加入100 μL Δcrp?asdSL1344的電轉化感受態(tài)中混合均勻，冰浴30 min，將混合物迅速轉移至電極杯中，然后進行電擊；電擊后迅速加入400 μL預熱的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、180×g振蕩培養(yǎng)3 h，取出100 μL涂布于不含DAP的LB平板上。15?24 h后挑取無色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，用堿裂解法提取質粒進行PCR和酶切鑒定。

1.6 重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 生物學特性

1.6.1 重組菌株的表型及生化鑒定

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 及其親本株?crpSL1344、雙缺失株Δcrp?asdSL1344和野生株SL1344分別劃線接種于含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h后進行O和H抗原等血清型鑒定，然后將各菌株分別轉接于各生化管中培養(yǎng)研究其生化特性。

1.6.2 重組質粒在菌株中的穩(wěn)定性檢測

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 在LB固體板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按1∶100的比例轉接到LB±DAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)50代。培養(yǎng)產(chǎn)物每10代挑取50個單菌落提取質粒，并進行PCR擴增鑒定和計算質粒丟失率[20]，以研究重組質粒在菌株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.6.3 重組菌株的生長特性鑒定

分別挑取重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 及其親本株?crpSL1344、雙缺失株Δcrp?asdSL1344和野生株SL1344單菌落培養(yǎng)過夜，菌液用無菌PBS連續(xù)10倍稀釋，選取合適稀釋度涂板計數(shù)，計算母液細菌濃度。然后菌液以終濃度均為1×106CFU/mL進行轉接，連續(xù)培養(yǎng)18 h，每隔1 h測定波長 600 nm的光密度 (OD600) 值，繪制4種菌株的生長曲線。

1.6.4 重組菌株對雛雞的毒力試驗

無菌挑取重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 及其親本株ΔcrpSL1344和野生株SL1344單菌落，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時選擇合適稀釋度，每個稀釋度口服10只雞，每只200 μL，另設PBS對照組，觀察30 d，記錄雞死亡情況，運用生物軟件 (Bliss) 計算各組LD50。

1.7 SopENt100-egfp融合基因在重組菌株中的表達情況鑒定

挑取減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h；然后按1∶100的體積比轉接LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h，8 000×g離心10 min收集沉淀和上清。沉淀用超聲波進行破碎，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，加等體積預冷的20%三氯乙酸冰浴20 min，8 000×g離心30 min；然后將濃縮后上清用1 mL無水乙醇洗滌，12 000×g離心5 min；重復洗滌2次，向上清和沉淀中加入5×SDS上樣緩沖液進行SDS-PAGE分析，并進一步進行Western blotting分析。第一抗體為鼠抗EGFP單抗 (1∶1 000稀釋)，第二抗體為HPR標記兔抗鼠IgG (1∶3 000稀釋)，同時設對照組Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100)。

1.8 重組減毒沙門菌侵染Vero細胞及表達蛋白的Western blotting分析

培養(yǎng)Vero細胞生長至80%?90%時，按細菌/細胞感染比500∶1分別將重組減毒鼠傷寒沙門菌Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)和Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100) 加入六孔板中，培養(yǎng)4 h后，用無菌PBS洗滌3次，加入含有10%胎牛血清及50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞，用細胞裂解液裂解細胞，4 ℃、12 000×g離心5 min收集上清液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min進行SDS-PAGE，并進一步進行Western blotting分析，其中一抗為鼠抗EGFP單抗 (1∶1 000稀釋)，二抗為HPR標記的兔抗鼠IgG (1∶3 000稀釋)。

2 結果與分析

2.1 沙門菌三型分泌表達載體的構建及鑒定

對pYA-sopENt100進行PCR和酶切鑒定，PCR擴增出大小約為500 bp的目的條帶 (圖2A)；經(jīng)AccⅢ和EcoRⅠ雙酶切后出現(xiàn)大小分別為500 bp和2 900 bp的兩條目的條帶 (圖2B)；pYA-sopENt100-egfp可擴增出約800 bp的egfp片段 (圖2C)，經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)大小分別約800 bp和3 400 bp兩條帶 (圖2D)。測序結果表明，PsopE-sopENt100和egfp基因序列與預期標準核酸序列的同源性均為100%。重組質?？稍诖竽c桿菌χ6097 (asd-) 菌株中穩(wěn)定存在，以上結果表明，鼠傷寒沙門菌三型分泌表達載體pYA-sopENt100及其重組載體pYA-sopENt100-egfp構建成功。

圖2 重組質粒的鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant plasmid. (A) PCR identification of recombinant plasmid pYA-sopENt100.M: DNA marker ladder (DL 5 000); 1: recombinant plasmid pYA-sopENt100; 2: ddH2O control. (B) Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pYA-sopENt100. M: DNA marker ladder (DL 5 000); 1: pYA-sopENt100. (C) PCR identification of recombinant plasmid pYA-sopENt100-egfp. M: DNA marker ladder (DL 2 000); 1: pYA-sopENt100-egfp; 2: ddH2O control. (D) Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pYA-sopENt100-egfp. M: DNA marker ladder (DL 5 000); 1: recombinant plasmid pYA-sopENt100-egfp.

2.2 重組菌株的構建及鑒定

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100)和Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 能夠在不含DAP的LB固體培養(yǎng)基上生長，初步說明重組質粒pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp導入了宿主菌Δcrp?asdSL1344。重組質粒pYA-sopENt100經(jīng)PCR可以擴增出500 bp的目的條帶，經(jīng)AccⅢ和EcoR Ⅰ雙酶切后出現(xiàn)大小分別為500 bp和2 900 bp的兩條帶，而重組質粒pYA-sopENt100-egfpPCR可以擴增出800 bp的目的條帶，經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)大小分別約為800 bp和3 400 bp的兩條帶。以上結果可說明重組質粒pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp被成功導入了宿主菌株Δcrp?asdSL1344。

2.3 ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)重組菌株的生物學特性

2.3.1 重組菌株的表型及生化鑒定

血清型鑒定表明，重組菌Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 的血清型同親本株和野生株相比沒有發(fā)生變化，血清型仍為O1,4,5,12:Hi1,2。野生株SL1344能夠利用麥芽糖，在含有麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈紅色菌落；而重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 不能利用麥芽糖，因此在含麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈無色菌落，這與親本株ΔcrpSL1344保持一致。生化鑒定結果顯示，重組菌株的生化特性與野生株SL1344相比發(fā)生了明顯改變，其失去了利用丙三醇、阿拉伯糖、麥芽糖、山梨醇和木糖碳源的能力，也不能分解H2S，但仍保留了利用葡萄糖、甘露醇的能力，這些都與親本株ΔcrpSL1344基本保持一致。

2.3.2 重組質粒在菌株中的穩(wěn)定性檢測

將重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 在LB±DAP液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)50代，培養(yǎng)產(chǎn)物每隔10代挑取50個單菌落進行PCR擴增鑒定并計算質粒丟失率。質粒穩(wěn)定性結果表明，重組菌株連續(xù)培養(yǎng)50代后，LB組菌株均可擴增出約800 bp的egfp目的條帶 (圖3)，質粒保存率為100%，而LB+DAP組菌株的質粒丟失率為48% (圖4)。

圖3 重組沙門菌體外穩(wěn)定性PCR鑒定結果Fig. 3 PCR identification of the stabilities of recombinant plasmid in recombinant strains. M: DNA marker ladder (DL 2 000); 1: ddH2O control; 2?6: the 10th, 20th, 30th, 40th and 50th generation of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp).

圖4 重組質粒在沙門菌中的穩(wěn)定性鑒定結果Fig. 4 The plasmid stabilities in recombinant strains.

2.3.3 重組菌株的生長特性鑒定

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)、缺失菌Δcrp?asdSL1344和親本株ΔcrpSL1344的菌落大小明顯小于野生株SL1344，其平均菌落直徑大小分別為0.39 mm、0.36 mm、0.42 mm和0.79 mm。以取樣時間為橫坐標，以每小時所測菌液OD600值為縱坐標，繪制4種細菌的生長曲線 (圖5)。結果表明，重組菌株的生長速度低于強毒株，而與缺失菌株和親本株相比沒有明顯變化。

2.3.4 重組菌株對雛雞的毒力試驗

各試驗組1日齡雛雞接種后連續(xù)觀察30 d，計算各組死亡情況和半數(shù)致死量(LD50)。由表2可知，口服感染?crp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 的LD50是2.28×1010CFU，ΔcrpSL1344的LD50是1.14×1010CFU，野生菌株SL1344的LD50是3.25×105CFU，重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)的LD50較野生株 SL1344降低了7.0×104倍，與?crpSL1344保持相當。試驗結果表明重組菌?crp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 毒力明顯減弱，作為疫苗載體安全性較好。

圖5 ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)、ΔcrpΔasdSL1344、ΔcrpSL1344和SL1344生長曲線Fig. 5 Growth curves of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp), ΔcrpΔasdSL1344, ΔcrpSL1344 and SL1344.

表2 各實驗組口服感染結果Table 2 Oral infection results of each experimental group

2.4 重組菌株的表達產(chǎn)物鑒定

重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 經(jīng)過培養(yǎng)后，Western blotting分析顯示，在約37 kDa處有SopENt100-egfp融合蛋白條帶，并且存在于過濾的上清和沉淀中(圖6)，表明SopENt100-egfp融合蛋白能夠在減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344中獲得分泌表達。

圖6 重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)表達產(chǎn)物的Western blotting鑒定Fig. 6 Western blotting identification of the expressed protein from recombinant attenuated strain ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp). M: protein marker; 1: supernatant of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100); 2: supernatant of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp); 3: precipitation of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100); 4: precipitation of ΔcrpΔasdSL1344(pYA-sopENt100-egfp).

2.5 重組減毒沙門菌侵染Vero細胞及Western blotting分析

重組減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 感染Vero細胞24 h后，收集細胞經(jīng)處理后進行Western blotting反應。結果顯示，在約37 kDa處有SopENt100-egfp融合蛋白條帶，約27 kDa處出現(xiàn)EGFP蛋白條帶，而空載體菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 在對應位置并未出現(xiàn)條帶，表明該重組三型分泌表達系統(tǒng)能夠有效地將SopENt100-egfp融合蛋白遞呈Vero細胞，并且SopENt100-egfp融合蛋白能夠被Vero細胞加工處理，其分泌相關蛋白SopENt100能夠被進一步切除 (圖7)。

圖7 重組菌株感染Vero細胞后EGFP蛋白的Western blotting鑒定Fig. 7 Western blotting identification of the expressed EGFP protein from Vero cells infected by recombinant attenuated strain. M: protein marker; 1: ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100); 2: ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp).

3 討論

減毒鼠傷寒沙門菌可通過自然感染途徑如口服或鼻內(nèi)接種，引起動物較強的黏膜、細胞和體液免疫應答，具有培養(yǎng)條件簡單、繁殖速度較快、免疫原性良好、制備及使用方便、經(jīng)濟等多種優(yōu)點，可以作為攜帶外源基因的良好載體，具有廣泛應用前景[12,17]。減毒沙門菌的生物安全性和穩(wěn)定性直接決定著疫苗的安全性和適用性。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，口服1.0×109CFU的減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA3493) 對雞只沒有明顯的毒性[14]。這表明減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344具有作為疫苗活載體的潛能。

利用減毒沙門菌作為活載體表達外源抗原，研制多價疫苗時，常常出現(xiàn)減毒沙門菌在體內(nèi)惡劣環(huán)境壓力下質粒丟失或表達不穩(wěn)定的現(xiàn)象。目前，已報道多種方法來提高外源基因的穩(wěn)定表達，其中，效果最穩(wěn)定且應用最多的是asd+質粒平衡表達系統(tǒng)。asd+質粒平衡表達系統(tǒng)由缺失其生存所必需的asd基因的親本菌株和含有asd基因的互補質粒組成。asd基因表達產(chǎn)物天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶，是DAP合成的必需酶，而DAP又是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分。因此，asd基因的缺失將導致突變菌株無法在DAP-條件下生存。沙門菌質粒平衡致死載體系統(tǒng)的建立有效解決了外源質粒的不穩(wěn)定攜帶和表達以及耐藥基因潛在生物安全性問題[11-12]。為保證該系統(tǒng)的穩(wěn)定性，重組質粒pYA-sopENt100上的SD-asd基因為asd基因的部分片段，其缺少相應的啟動子元件 (-10區(qū)和-35區(qū))，僅保留了SD序列。同時，重組質粒pYA-sopENt100采用pBR ori低水平復制起始位點，這樣一方面大大降低了Asd蛋白的表達水平，減少了Asd蛋白對宿主菌的毒性作用。另一方面能夠適量增加質粒的拷貝數(shù)，從而提高外源蛋白的表達量[21]。質粒穩(wěn)定性結果顯示，重組菌株連續(xù)培養(yǎng)50代，LB組菌株均可擴增出約800 bp的egfp目的條帶，質粒保存率為100%，而LB+DAP組菌株的質粒丟失率為48%。這初步表明該分泌表達系統(tǒng)在DAP-環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性。

減毒沙門菌通過利用細菌的分泌系統(tǒng)將外源抗原遞呈給抗原遞呈細胞。在疫苗載體設計的過程中，外源抗原的表達和遞呈能力直接關系著疫苗的功效。鼠傷寒沙門菌進入宿主細胞后形成內(nèi)化空泡而不能有效地將外源抗原呈遞給MHC分子，從而直接影響著鼠傷寒沙門菌的抗原遞呈能力[22]。T3SS通過一個復雜的針頭復合物將外源蛋白注入宿主細胞內(nèi)，從而發(fā)揮相應的生物學功能[23]。許多學者已經(jīng)證實，利用鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)來遞呈外源抗原能夠有效的解決上述問題，具有更大的優(yōu)越性和廣泛的應用價值。將外源抗原與鼠傷寒沙門菌三型分泌蛋白SopE的分泌和轉位信號進行融合，從而利用沙門菌三型分泌系統(tǒng)來實現(xiàn)外源蛋白的定向運輸[17]。另外，在真核細胞內(nèi)SopE蛋白能夠迅速地被蛋白酶體降解，有利于外源抗原的遞呈[18]。2011年Chen等[24]通過構建sopE-Sj23LHD-GST表達載體來預防日本血吸蟲，試驗結果表明該載體能夠有效地遞呈sopE-Sj23LHD-GST，對日本血吸蟲具有良好的免疫保護力；2012年Juárez等[25]構建sopE-ESAT-6等表達載體來預防結核分枝桿菌，結果表明該載體可以誘使機體產(chǎn)生較高的特異性抗體，可以有效地預防結核病。鑒于此，本研究將標記基因egfp插入sopE信號序列下游，初步探究構建的三型分泌表達載體pYA-sopENt100抗原遞呈能力。結果顯示，重組減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 成功表達了融合蛋白SopENt100-egfp。此外，重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 感染Vero細胞后，Western blotting結果發(fā)現(xiàn)，在約37 kDa處有SopENt100-egfp融合蛋白條帶，而在約27 kDa處出現(xiàn)EGFP蛋白條帶。上述結果表明，本研究構建的減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 能夠有效地遞呈外源抗原，并且融合蛋白中的信號蛋白SopENt100能夠被宿主細胞進一步切除。

本研究通過對重組減毒鼠傷寒沙門菌的生物學特性研究發(fā)現(xiàn)，該重組菌株與強毒株相比生長速度明顯減慢，毒力明顯降低，具有良好的安全性，且遺傳穩(wěn)定。這說明sopE基因的表達對重組菌株的生物學特性沒有明顯的影響。同時，重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 表達的SopENt100-egfp融合蛋白可存在于過濾的上清中，說明重組菌株可分泌性表達該蛋白，避免了被胞內(nèi)蛋白酶降解，利于表達蛋白的正確折疊及保持良好的生物學活性。以上結果表明將鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)引入沙門菌平衡致死系統(tǒng)可以作為安全、穩(wěn)定、高效表達外源基因的口服重組活疫苗載體，具有廣闊的應用前景。

綜上，本研究利用減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)以及平衡致死系統(tǒng)成功構建了能穩(wěn)定攜帶外源抗原的新型減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌表達系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100)；重組菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 毒力降低，遺傳穩(wěn)定，能分泌性表達SopENt100-egfp融合蛋白，且能有效地向Vero細胞遞呈EGFP蛋白，為開發(fā)減毒鼠傷寒沙門菌新型口服活疫苗載體奠定基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

Construction and characterization of type III secretion system of attenuated Salmonella typhimurium

Chuan Yu1＊, Chongkai Zhai1＊, Chengshui Liao1, Zuhua Yu1, Lei He1, Yanyan Jia1, Jing Li1, Chunjie Zhang1, and Xiangchao Cheng1,2
1 The Key Laborary of Animal Disease and Public Health, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China
2 Luoyang Vocational & Technical College, Luoyang 471003, Henan, China

In order to develop a recombinant attenuatedSalmonella typhimuriumas oral live vaccine vector, we constructed recombinant plasmid pYA-sopENt100by replacing thetrcpromoter with thesopEpromoter and secretion signal sequencesopENt100ofSalmonella typhimuriumon the basis of plasmid pYA3493. Then, the complementary plasmid pYA-sopENt100was transformed into ΔcrpΔasdSL1344 by electroporation to generate attenuatedSalmonella typhimuriumtype III secretion system ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100). We further characterized ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100). We also constructed a recombinant strain ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) that harbored the reporter gene-enhanced green fluorescent protein (egfp) gene. Vero cells were infected with ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) and the ability of delivery foreign antigens was testedviaWestern blotting analysis. The results of PCR, enzyme digestion and sequencing showed that the ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) type III secretion system was constructed successfully. The serotype of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) was identical to ΔcrpΔasdSL1344 and SL1344. Compared with wild strain SL1344, the biochemical characteristics of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) had obvious change, but it was basically the same with ΔcrpΔasdSL1344. The growth speed was much slower than that of the wild strain SL1344. The chicken virulence test (LD50) showed that the virulence of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) was 7×104times lower than SL1344. In addition, we observed the 37 kDa SopENt100-egfp protein in the cultured supernatant of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) strain by Western blotting analysis. However, both the 37 kDa SopENt100-egfp protein and 27 kDa EGFP protein were detected in ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)-infected Vero cells. These results demonstrated that the recombinantSalmonella typhimuriumtype III secretion system ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) was successfully constructed, and it should be used as a live vaccine vector for expressing foreign genes.

attenuatedSalmonella typhimurium, type III secretion system,sopEgene, balance-lethal system, live vaccine vector

Xiangchao Cheng. Tel/Fax: +86-379-64179396; E-mail: chengxch@126.com

Received:April 7, 2016;Accepted:June 28, 2016

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31302059, 31572489), Scientific and Technological Project of Henan Province (No. 152102110078), Doctor Foundation of Henan University of Science and Technology (No. 4025-13480064).

*These authors contributed equally to this study.

國家自然科學基金 (Nos. 31302059, 31572489)，河南省科技攻關項目 (No. 152102110078)，河南科技大學博士啟動基金 (No. 4025-13480064) 資助。

時間：2016-09-12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160912.1112.001.html