馬艷，李偉，李小波，鮑冬梅，盧建培

1 廣東藥科大學 基礎學院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006

2 廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006

肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白表達條件的優(yōu)化及活性鑒定

馬艷1，李偉2，李小波1，鮑冬梅1，盧建培1

1 廣東藥科大學 基礎學院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006

2 廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006

馬艷, 李偉 李小波, 等. 肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白表達條件的優(yōu)化及活性鑒定. 生物工程學報, 2016, 32(12): 1715-1726.

Ma Y, Li W, Li XB, et al. Optimization of expression conditions and activity identification of hepatocyte-targeting peptide-human endostatin. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1715-1726.

為了獲得足夠多純度高且有活性的肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白（HTP-rES），首先研究了BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株的生長曲線和最佳誘導時機；單因素分析不同pH值、不同誘導時間、不同誘導劑濃度、不同誘導溫度時融合蛋白表達量；通過包涵體洗滌、復性、純化，以獲得高純度的肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白；最后采用流式細胞儀和MTT對融合蛋白進行活性鑒定。結果表明，BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株在1.5-3.5 h處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)基pH 8.0、IPTG終濃度0.06 mmol/L、42 ℃、誘導表達5 h為最佳表達條件。包涵體洗滌后純度達60%，經(jīng)復性、純化后獲得的目的蛋白純度達到95%以上，對人肝癌細胞具有靶向性，能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖。研究確立了融合蛋白最佳表達條件以及復性、純化條件，為進一步研究其生物學活性及藥物開發(fā)奠定基礎。

肝靶向肽，人內(nèi)皮抑制素，表達條件優(yōu)化，活性鑒定

國家自然科學基金 (No. 81502520)，廣東省自然科學基金 (No. 2016A030310299) 資助。

內(nèi)皮抑制素 (Endostatin，ES) 是由細胞外基質(zhì)成分膠原ⅩⅧ的羧基末端水解而來的一種動物體內(nèi)天然存在的蛋白，是一種內(nèi)源性血管形成抑制因子，能選擇性地靶向微血管內(nèi)皮細胞，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和黏附，負性調(diào)節(jié)血管形成過程，具有廣譜的抗腫瘤作用[1-4]。另外，ES對一些腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等也具有明顯的抑制作用[5-6]。但ES用藥劑量大、療效不夠理想等缺點，限制了其在臨床中的應用。肝靶向肽 (Hepatocyte-targeting peptide) 能與肝細胞表面上的受體特異性結合，將具有藥物活性的物質(zhì) (如放射性核素、化療藥物、毒素、酶和生物反應調(diào)節(jié)劑等) 盡量集中于肝臟部位，發(fā)揮其生物學功能[7-8]。本課題組提出將肝靶向肽與人內(nèi)皮抑制素進行融合，制備肝靶向人內(nèi)皮抑制素 (HTP-rES)，提高藥物在病灶部位的局部濃度，從而可提高藥物的治療指數(shù)。

前期工作中，我們利用SOE-PCR重組了肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合基因，并成功構建了大腸桿菌表達系統(tǒng)BL21/pET21b-HTP-rES。本研究通過優(yōu)化目的蛋白在大腸桿菌中的表達條件、目的蛋白包涵體復性條件以及目的蛋白的純化條件，以期確立目的蛋白最佳表達條件，獲得足夠多的純度高且有活性的目的蛋白，為進一步研究肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素的生物學活性及藥物開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 表達菌株和細胞株

BL21/pET21b-HTP-rES由廣東藥科大學廣東省生物活性藥物研究重點實驗室保存，人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVECs) 購自美國ScienCell公司，人肝癌細胞HepG2、人正常肝細胞Chang's購自上海科學院細胞所。

1.1.2 主要試劑

酵母提取物、胰蛋白胨 (OXOID公司)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、還原型谷胱甘肽 (GSH)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG) (Sigma公司)，His Trap HP 親和層析柱 (GE公司)，Endothelial cell medium (ECM，ScienCell公司)，Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)、FBS (Gibco公司)。

1.1.3 主要儀器

蛋白垂直電泳儀、Gel100凝膠成像系統(tǒng)、全波長掃描分光光度計 (BIO-RAD公司)；大型高速冷凍離心機 (Backman公司)；超聲波細胞破碎儀 (Sonics公司)：蛋白質(zhì)層析純化設備(GE公司)、超低溫冷凍干燥儀 (Labconco公司)、制備型高效液相 (Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線的測定

將構建好的表達菌株BL21/pET21b-HTP-rES接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。按1∶100 (V/V) 接入到20 mL LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，此時開始計時，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9和10 h各取1 mL菌液進行OD600值測量，繪制出BL21/pET21b-HTP-rES生長曲線，確定其生長規(guī)律。

1.2.2 最佳誘導時機試驗

將過夜培養(yǎng)的BL21/pET21b-HTP-rES按1∶100 (V/V)接入到35 mL LB培養(yǎng)基中，當菌體達到對數(shù)生長期即OD600≈0.5后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導劑，開始計時，分別于0、1.5、2、2.25、2.5、2.75、3和3.5 h，取1 mL菌液進行SDS-PAGE，分析表達菌株的最佳誘導時機。

1.2.3 表達條件的優(yōu)化

在最佳誘導時機，單因素分析不同培養(yǎng)溫度 (17 ℃、25 ℃、32 ℃、37 ℃、42 )℃、不同誘導時間 (0、1.5、2、3、4、5、6、7、8 h)、不同IPTG濃度 (0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、3.84 mmol/L)、不同pH培養(yǎng)基 (4、5、6、7、8、9、10) 時目的蛋白的表達量，確定最佳誘導表達條件。

1.2.4 目的蛋白包涵體的洗滌分離

在優(yōu)化的表達條件下，大量誘導表達蛋白，8 000 r/min離心15 min收集菌體。將菌體用1×PBS洗滌1次，裂解緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0) 重懸，冰上超聲裂解，超聲條件：300 W超聲10 s，間隔15 s，25 min，菌體變澄清。8 000 r/min離心15 min去上清，沉淀用洗滌液A (50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1% TritonX-100，pH 8.0) 洗3次，或者用洗滌液B (50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，2 mol/L尿素，pH 8.0) 洗3次，洗滌上清和沉淀分別取樣進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 目的蛋白包涵體的復性

對所得包涵體稱重，每0.1 g包涵體加入10 mL變性液 (6 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，室溫下攪拌至液體澄清，8 000 r/min離心15 min收集上清。將變性液按1∶10稀釋到稀釋液 (3 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，4 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，pH 8.0)，然后進行梯度鹽酸胍透析復性。透析液分別為A (2.0 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)；B (1.0 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)；C (0.5 mol/L鹽酸胍，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)；D (0.25 mol/L鹽酸胍，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)和E (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)，每種透析液透析12 h。8 000 r/min離心15 min收集透析液E上清，獲得復性后融合蛋白，BCA法測定復性后蛋白濃度。

1.2.6 目的蛋白的純化

復性重折疊的上清液用Ni-NTA (30 mL，GE公司) 親和層析柱進行純化。首先對AKTA純化儀進行沖洗、平衡。設置程序，用5 mL/min的速度上樣復性后的蛋白液，緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，0.4 mol/L NaCl，0.5% TritonX-100，10 mmol/L咪唑，pH 7.4) 平衡柱子，在5個柱體積內(nèi)用緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，0.4 mol/L NaCl，0.5% TritonX-100，1.0 mol/L咪唑) 從0%?100%梯度洗脫吸附在柱子上的蛋白；分階段收集洗脫的蛋白溶液，SDS-PAGE分析，將雜蛋白少融合蛋白含量高的蛋白液進行脫鹽，冷凍干燥，并儲存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 目的蛋白RP-HPLC檢測

用C18型HPLC進行蛋白純度分析。流動相為CH3OH∶0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液=40∶60 (V/V)，pH 5.5，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm，目標物濃度以色譜峰面積計算。

1.2.8 融合蛋白的活性鑒定

融合蛋白對肝癌細胞的靶向作用：用分別含20 μg/mL內(nèi)皮抑素、10 μg/mL HTP-rES的培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2，37 ℃、30 min后收集細胞，依次加入Anti-ES與PE標記的二抗，采用流式細胞儀檢測細胞表面的熒光強度，即HTP-rES與人肝癌細胞HepG2的結合活性。HTP-rES對細胞的抑制作用：取對數(shù)生長期的細胞，細胞計數(shù)后加入96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，加入10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312、0.0 μg/mL HTP-rES，6個復孔，培養(yǎng)48 h，MTT法測定OD490的值，計算細胞的生長抑制率。

2 結果與分析

2.1 BL21/pET21b-rhES重組菌株的生長曲線分析

生長曲線反映了重組菌株的生長變化趨勢，從曲線中可以確定工程菌在某一時刻所處的生長階段。依此為依據(jù)，選擇合適的誘導條件進行誘導。由BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株的生長曲線 (圖1) 可見，在1.5?3.5 h之間，菌株處于對數(shù)生長期。

2.2 誘導時機考察

根據(jù)文獻報道，基因工程菌選擇在對數(shù)生長期進行誘導，此時工程菌生長速度較快，蛋白積累速度加快，表達水平較高。根據(jù)菌株生長曲線，本實驗考察了0 h、1.5 h、2 h、2.25 h、2.5 h、2.75 h、3 h、3.5 h七個誘導時機對融合蛋白表達水平的影響。SDS-PAGE結果分析表明(圖2)，在2.5 h進行誘導，目的蛋白表達量和目的蛋白在總蛋白中比例都較高。因此選擇2.5 h為最佳誘導時機。

圖1 BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株的生長曲線Fig. 1 The growth curve of BL21/pET21b-HTP-rES.

2.3 表達條件的優(yōu)化

在最佳誘導時機，不同誘導時間表明 (圖3)，隨著時間的延長目的蛋白表達量隨之增加，在5 h時達到高峰，并持續(xù)到7 h，但雜蛋白也有所增加，所以最佳誘導時間為5 h。以最佳的誘導時間，在不同溫度、不同pH值和不同IPTG濃度下進行誘導表達，SDS-PAGE分析表明 (圖4、5、6)，42 ℃表達量最高，pH 8.0表達量最高，IPTG濃度為0.06、0.48、0.96 mmol/L時表達量相當。因為IPTG對菌株有毒性，本實驗選擇42 ℃、pH 8.0、IPTG終濃度為0.06 mmol/L、誘導5 h是最佳表達條件。

圖2 BL21/ pET21b-HTP-rES重組菌株的不同誘導時機的表達量Fig. 2 The expression of pET21b-HTP-rES at different induction time. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different induction timing by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The percent of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis software.

圖3 不同誘導表達時間的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE of expression level at differient induction times. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at differient induction times by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

圖4 不同溫度誘導表達的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of induced expression at different temperature. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different temperature by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

圖5 不同pH值誘導表達的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE of induced expression at different pH. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different pH by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

2.4 目的蛋白包涵體的洗滌、溶解和復性

包涵體經(jīng)洗滌液洗滌的電泳結果 (圖7)，洗滌液粗略洗滌后，包涵體中的細菌雜蛋白有了明顯減少。為獲得有生物活性的蛋白，需將溶解后的蛋白進行復性。本實驗選用稀釋梯度透析復性。多次實驗發(fā)現(xiàn)，溶解稀釋后的蛋白濃度在0.5 mg/mL時有利于后續(xù)的復性實驗；當透析液中鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時有少量沉淀產(chǎn)生，說明融合蛋白在鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時開始復性。在鹽酸胍濃度為0.5 mol/L和0.25 mol/L復性液中添加GSH和GSSG，蛋白復性率大大提高 (表1)。

圖6 不同IPTG濃度誘導表達的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE of induced expression at different IPTG. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different IPTG by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

表1 HTP-rES蛋白復性率Table 1 Refolding yield of HTP-rES

圖7 不同洗滌液洗滌包涵體后的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE of the inclusion body after washed by the different washing buffer. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different induction timing by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. 1: whole cells after induction; 2: supernatant of lysate; 3: precipitation of lysate; 4: supernatant after first washing; 5: precipitate after first washing; 6: supernatant after second washing; 7: precipitate after second washing; 8: supernatant after third washing; 9: precipitate after third washing; M: protein marker. (B) The percent of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis software.

2.5 目的蛋白的純化及RP-HPLC

融合蛋白N端有6×His標簽，復性后的融合蛋白經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱純化后，在咪唑濃度為150 mmol/L時出現(xiàn)目的蛋白洗脫峰，SDS-PAGE和RP-HPLC結果表明：得到純度高達95%的融合蛋白 (圖8和圖9)。

2.6 目的蛋白的活性鑒定

圖8 融合蛋白純化的洗脫條件和SDS-PAGE分析Fig.8 Elution conditions of fusion protein purification and SDS-PAGE analysis. 1-7: elution buffer of collection tube 1 to 7 with different imidazole; M: protein marker.

圖9 純化后融合蛋白的RP-HPLC結果Fig. 9 RP-HPLC of the fusion protein after purified.

流式細胞術檢測HTP-rES與HepG2結合活性 (圖10)，可見含有HTP-rES融合蛋白處理過的HepG2細胞熒光強度明顯高于無肝靶向肽的人內(nèi)皮抑制素和空白對照。表明HTP-rES對人肝癌細胞HepG2細胞具有靶向性。

MTT實驗結果 (圖11) 表明HTP-rES可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，并具有一定的劑量依賴性。在10 μg/mL時，對細胞增殖的抑制效果最好，達到48.75%；而HTP-rES對正常肝細胞Chang's作用不明顯。

圖10 融合蛋白對人肝癌細胞HepG2的結合活性Fig. 10 The binding of the fusion protein to HepG2.

圖11 融合蛋白對細胞的抑制作用Fig. 11 Inhibition of the fusion protein to different cells.

3 討論

蛋白質(zhì)藥物因為具有高活性、強特異性、低毒性、生物功能明確和有利于臨床應用等特點，已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分。利用DNA重組技術生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)藥物成本低、成功率高、安全可靠，越來越受到研究者的青睞。原核表達系統(tǒng)因為其易于培養(yǎng)、繁殖快、表達量高、成本低、易純化和遺傳背景清楚等優(yōu)點，成為表達重組蛋白藥物的首選體系[9-11]。原核表達時，不同誘導條件在很大程度上影響目的蛋白得率[12-15]。為提高目的蛋白的表達效率，本實驗測定了重組菌株的生長曲線，進一步對蛋白表達條件進行優(yōu)化，最終確定最佳誘導時機、最適pH、最適IPTG濃度、最適誘導時間和最適溫度；通過包涵體的洗滌、溶解、復性和純化獲得了既能靶向于肝癌細胞又能抑制內(nèi)皮細胞增殖的融合蛋白。在本實驗中，通過考察不同時機發(fā)現(xiàn)，在2.5 h進行誘導，目的蛋白表達量和目的蛋白在總蛋白中比例都較高，為最佳誘導時機。單因素優(yōu)化表達條件結果表明，融合蛋白的表達最佳條件為42 ℃、pH 8.0、IPTG濃度0.06 mmol/L和誘導5 h，占細胞總蛋白的30%。由于包涵體中的融合蛋白與部分破碎的細胞膜膜蛋白及脂體粘連在一起，影響后續(xù)復性效率，所以在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用去污劑如1% TritonX-100或低濃度的變性劑 (如2 mol/L尿素) 在50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA中洗滌，通過洗滌包涵體沉淀得到粗制的融合蛋白，高濃度的變性劑能使包涵體溶解，如6 mol/L鹽酸胍或8 mol/L尿素，通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而使大部分包涵體蛋白溶解。本實驗分別或先后使用1% TritonX-100或2 mol/L尿素洗滌，發(fā)現(xiàn)用2 mol/L尿素洗滌時會有部分目的蛋白被洗下來，另外2 mol/L尿素洗滌后包涵體在6 mol/L鹽酸胍中的溶解率降低，最后確定用洗滌液A (1% TritonX-100，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗滌3次，用6 mol/L鹽酸胍溶解。為獲得有生物活性的蛋白，需將溶解后的蛋白進行復性。本實驗選用稀釋透析復性。多次實驗發(fā)現(xiàn)，當透析液中鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時有少量沉淀產(chǎn)生，當透析液中不含鹽酸胍時產(chǎn)生大量沉淀，說明融合蛋白在鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時開始復性。增加鹽酸胍濃度為0.25 mol/L透析液，緩慢去除變性劑，添加GSH和GSSG，有利于二硫鍵的緩慢形成，蛋白復性率大大提高。

肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)是血管豐富的實體性腫瘤，腫瘤血管生成在其發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮了重要作用[16-18]。因此，HCC的抗腫瘤血管生成治療具有巨大的科學意義和重要的實用價值。ES與血管內(nèi)皮細胞膜上的肝素/硫酸肝素 (HS)、Integrin和VEGF等多種受體結合，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和黏附；另外，ES還能與一些腫瘤細胞上的Integrin α5β1結合影響增殖、遷移、黏附等。美國EntreMed公司采用畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)了人內(nèi)皮抑制素，因為產(chǎn)量低且半衰期短而限制了其在臨床上的應用[19-20]。大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)了新型重組人內(nèi)皮抑制素 (Recombinant human endostatin，rES，商品名Endostar，恩度)，其氨基末端經(jīng)過基因修飾加上了9個氨基酸序列 (MGGSHHHHH)，形成6個組氨酸標簽，從而提高了產(chǎn)量，簡化了純化工藝，蛋白質(zhì)活性和穩(wěn)定性也有了明顯提高，目前已用于治療多種腫瘤[21-24]。但治療時ES在體內(nèi)各組織分布相對平均，在病灶部位形成有效濃度較低，為了達到臨床效果，只有加大藥物劑量，或增加給藥次數(shù)，或聯(lián)合化療藥物用藥；因此，提高治療成本，引起較嚴重的毒副作用。提高ES的靶向性，可將藥物有效地輸送至病變部位，可提高藥物的治療指數(shù)，減少其毒副作用[25-27]。本研究構建的肝靶向肽-重組人內(nèi)皮抑制素融合蛋白，經(jīng)原核系統(tǒng)誘導表達、復性和親和層析純化后，獲得純度高達95%的融合蛋白。該融合蛋白與肝癌細胞HepG2的結合能力明顯高于無靶向性的重組人內(nèi)皮抑制素Endostar具有良好的肝細胞靶向性；同時還能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的增殖，可能成為肝癌靶向治療一種新型、有效的治療手段。該研究確定了融合蛋白最佳表達條件，獲得了純度高且有活性的目的蛋白，為進一步研究其生物學活性及藥物開發(fā)奠定基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

Yan Ma. Tel: +86-20-39352552; E-mail: mayan820901@126.com

Optimization of expression conditions and activity identification of hepatocyte-targeting peptide-human endostatin

Yan Ma1, Wei Li2, Xiaobo Li1, Dongmei Bao1, and Jianpei Lu1
1 Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, School of Basic Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China
2 School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

To obtain sufficient purified and active fusion protein-hepatocyte-targeting peptide-human endostatin (HTP-rES), we studied the growth curve and the optimal induction timing of BL21/pET21b-HTP-rES. Different conditions of pH value, induction time, induction concentration and induction temperature were optimized by univariate analysis. After washing, refolding and purifying, the activity of fusion protein was identified by flow cytometry and 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT). Results show that the logarithmic growth phase of BL21/pET21b-HTP-rES was from 1.5 h to 3.5 h, the optimum expression conditions were pH 8.0, 0.06 mmol/L IPTG, at 42 ℃ for 5 h. The purity of inclusion bodies was up to 60% after washing. The purity of target protein was more than 95% after refolding and purification. Our findings provide the foundation for further biological activity and drug development.

hepatocyte-targeting peptide, human endostatin, expression conditions, activity identification

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81502520), Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2016A030310299).

Received:April 28, 2016;Accepted:August 8, 2016