焦 倩，楊玉紅 ，于 萍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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TCF7L2基因多態(tài)性與2型糖尿病及胰島素抵抗的相關(guān)性研究

焦 倩，楊玉紅 ，于 萍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討黑龍江省東部地區(qū)漢族人群中轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)基因rs12255372-G/T和rs7903146-C/T單核苷酸多態(tài)性(SNP)與2型糖尿病(T2DM)及胰島素抵抗(IR)的相關(guān)性。方法:選取黑龍江省東部地區(qū)漢族人群T2DM患者180例(T2DM組)及健康體檢者150例(對(duì)照組)，提取其血液樣本DNA,PCR擴(kuò)增目的基因后應(yīng)用直接測(cè)序法對(duì)兩組rs12255372、rs7903146多態(tài)位點(diǎn)分別進(jìn)行基因分型，分析其與T2DM的相關(guān)性，同時(shí)檢測(cè)臨床指標(biāo)，分析rs12255372-G/T和rs7903146-C/T多態(tài)性與T2DM、IR、脂代謝的相關(guān)性。結(jié)果:(1) 兩組rs7903146基因型及等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；兩組rs12255372基因型及等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)T2DM組 rs12255372 位點(diǎn)及rs7903146位點(diǎn)不同基因型間比較FPG、FINS、HOMA-IR及HOMA-IS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:在黑龍江省東部地區(qū)漢族人群中TCF7L2基因rs7903146-C/T多態(tài)性與T2DM有相關(guān)性；而rs12255372-G/T多態(tài)性與T2DM無(wú)相關(guān)性；TCF7L2 基因rs12255372-G/T多態(tài)性和rs7903146-C/T多態(tài)性均與胰島素抵抗相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄因子7類似物2；rs12255372-G/T；rs7903146-C/T ；多態(tài)性；2型糖尿??；胰島素抵抗

糖尿病目前在我國(guó)呈暴發(fā)上升趨勢(shì)，現(xiàn)成人發(fā)病率達(dá)9.7%，與遺傳因素和環(huán)境因素及其共同作用有關(guān)，其中2型糖尿病(T2DM)占90%以上，主要病理改變?yōu)棣录?xì)胞功能減退及對(duì)胰島素的敏感性差,即胰島素抵抗(IR)。TCF7L-2基因位于人類10號(hào)染色體長(zhǎng)臂25區(qū),共有2159個(gè)堿基對(duì)。包含17個(gè)外顯子,其中有4個(gè)選擇剪接位點(diǎn),且3個(gè)連續(xù)位于TCF7L-2基因的起始端,其大量表達(dá)于人的胰島B細(xì)胞和脂肪組織中。有研究證實(shí)，TCF7L2基因單核甘酸多態(tài)性與T2DM[1]及IR相關(guān)。本課題選擇佳木斯附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院部患者及健康體檢者進(jìn)行TCF7L2基因SNPrs12255372-G/T和rs7983146-C/T變異多態(tài)性檢測(cè)，探討其與黑龍江東部地區(qū)漢族人群 T2DM 發(fā)病及胰島素抵抗的關(guān)系，為T2DM的預(yù)防和探索臨床診治新途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015-01～2015-08在我院(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院)內(nèi)分泌科門診或住院的2型糖尿病患者180例，男91例，女89例，平均年齡(56.07±4.96)歲，為長(zhǎng)期居住本地、漢族、彼此間無(wú)血緣關(guān)系，作為T2DM組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①均符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)[2]；②起病年齡30～65歲；③排除急性感染期、應(yīng)激、極度衰弱、嚴(yán)重心腦肝腎等重要器官疾病導(dǎo)致的血糖升高；④無(wú)其他免疫性疾病。

對(duì)照組：另選長(zhǎng)期居住本地、漢族、同期健康體檢者150例，男73例，女77例，平均年齡(55.75±5.38)歲，作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①空腹血糖及餐后血糖正常；②無(wú)服用影響糖脂代謝的藥物史；③無(wú)糖尿病家族史；④無(wú)各種應(yīng)激狀態(tài)，肝腎功能正常。

1.2 資料收集、所需的觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

所有研究對(duì)象均記錄病史、年齡、性別，測(cè)量身高、體重等指標(biāo)，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)?？崭?h以上，晨起用真空負(fù)壓采血管(EDTA抗凝真空采血管)采集血樣，2mL檢測(cè)基因多態(tài)性，2mL檢測(cè)血脂、血糖、糖化血紅蛋白(HbA1C)，2mL檢測(cè)胰島素、C肽水平。采用全自動(dòng)生化分析儀酶學(xué)法測(cè)空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)、HbA1C、甘油三酯(TG)、總膽固醇 (TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C))?？崭挂葝u素(FINS)和C肽(CP)采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)及胰島素敏感性指數(shù)(ISI)。公式如下：HOMA-IR= FPG×FIns/22.5；HOMA-β=Fins×20/(FPG-3.5)；ISI=1/[Log(FPG)+Log(FINS)]。

1.3 提取DNA、引物設(shè)計(jì)和合成、目的基因的擴(kuò)增及基因測(cè)序

使用上海天根公司的基因組抽提試劑盒對(duì)血液樣本進(jìn)行抽提DNA。

應(yīng)用Primer 3 online軟件設(shè)計(jì)引物，將所設(shè)計(jì)的的引物對(duì)所有研究對(duì)象的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以切膠純化的方式回收，用分光光度計(jì)檢測(cè)回收是否成功，然后進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)Sanger雙脫氧法測(cè)序原理，采用ABI3730測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序后所得序列用ChromaS、DNASTAR軟件核對(duì)、分析，并人工核對(duì)堿基判讀結(jié)果，減少測(cè)序儀誤差。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料兩組間的比較用卡方檢驗(yàn)。應(yīng)用Hardy- weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)軟件計(jì)算兩等位基因在兩組中的遺傳平衡性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料的比較

兩組比較性別構(gòu)成比、年齡、C肽差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而BMI、TG、TC、HDL-C、LDL-C、 FPG 、HbA1C、 FINS 、HOMA-IR、HOMA-β、ISI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組受檢者臨床資料比較

注：BMI:體重指重、TG:甘油三酯、TC:總膽固醇、HDL-C高密度脂蛋白膽固醇、LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇、HbA1C::糖化血紅蛋白、FPG：空腹血糖、FINS:空腹胰島素、HOMA-IR：胰島素抵抗指數(shù)、HOMA-β：β細(xì)胞功能指數(shù)、ISI：胰島素敏感性指數(shù)。

2.2 rs12255372位點(diǎn)及rs7903146位點(diǎn)基因測(cè)序

rs12255372及rs7903146位點(diǎn)基因型在兩組中均符Hardy -weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，具有群眾代表性。兩組相比，rs12255372位點(diǎn)基因型及等位基因頻次差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2，提示該等位基因與T2DM不相關(guān)，等位基因T非T2DM發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因；rs7903146位點(diǎn)基因型及等位基因頻次差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3，提示該等位基因與T2DM相關(guān)，等位基因T為T2DM發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。

表2 兩組rs12255372基因型及等位基因頻率分布

表3 兩組rs7903146基因型及等位基因頻率分布

rs12255372GGGTPrs7903146CCCTPBMI(kg/m2)25．01±2．8025．94±2．99>0．0524．96±2．8325．71±2．73>0．05TG(mmol/L)2．12±0．312．26±0．29>0．052．13±0．302．11±0．40>0．05TC(mmol/L)4．76±0．564．77±0．52>0．054．76±0．554．78±0．58>0．05HDL-C(mmol/L)1．27±0．301．22±0．28>0．051．27±0．291．24±0．32>0．05LDL-C(mmol/L)3．02±0．422．97±0．31>0．053．03±0．432．95±0．36>0．05HbA1C(%)8．92±1．899．19±1．87>0．058．85±1．899．37±1．87>0．05FPG(mmol/L)10．74±2．0112．71±1．11<0．0110．62±2．0112．27±1．49<0．01FINS(mU/L)13．08±3．5918．26±2．03<0．0112．56±3．3418．09±1．91<0．01C肽(ug/L)2．29±0．332．27±0．35>0．052．27±0．332．33±0．30>0．05HOMA-IR6．28±2．2110．31±1．48<0．015．94±1．999．86±1．56<0．01HOMA-β38．78±14．2440．30±6．83>0．0538．12±14．4442．56±9．20>0．05ISI0．47±0．040．42±0．01<0．010．48±0．040．43±0．01<0．01

2.3 T2DM組 rs12255372和rs7903146不同基因型臨床資料的比較

T2DM組 rs12255372 位點(diǎn)及rs7903146位點(diǎn)不同基因型比較FPG、FINS、HOMA-IR及ISI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

3 討論

糖尿病是由多種基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[3]，有學(xué)者認(rèn)為TCF7L2與胰島β細(xì)胞功能缺陷相關(guān)，如位點(diǎn)突變則影響胰島素相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制胰島素的釋放[4]，通過(guò)直接或間接途徑導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)量下降及胰島素分泌不足可能是TCF7L2變異引起T2DM的機(jī)制[5]。胰島素抵抗(IR)與糖尿病等多種代謝疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。多種族研究顯示，TCF7L2單核苷酸多態(tài)性會(huì)影響胰島β細(xì)胞功能及胰島素抵抗[7]。研究TCF7L2風(fēng)險(xiǎn)等位基因攜帶者在臺(tái)灣青少年人群中的胰島素敏感性有所下降[8]。而同樣研究歐洲裔和非洲裔美國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)，TCF7L2 基因變異可使胰島素敏感性下降。

Wnt信號(hào)通路參與體內(nèi)多種病理及生理代謝過(guò)程，其可抑制小腸內(nèi)分泌細(xì)胞胰高血糖素原基因的表達(dá)，進(jìn)而影響餐后胰島素的分泌和β細(xì)胞增殖分化[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)分泌減少及功能障礙亦為2型糖尿病患者發(fā)病的重要機(jī)制[10]，如TCF7L2變異，可能影響Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而抑制胰高血糖素原基因的表達(dá)，相應(yīng)的GLP-1減少[11]，促使糖尿病發(fā)生。有學(xué)者等認(rèn)為TCF7L2基因變異攜帶者T2DM的患病率增加的原因可能與β細(xì)胞中有活性的TCF7L2水平下降有關(guān)[12]。而通過(guò)Gulcher等通過(guò)衛(wèi)星標(biāo)記連鎖及關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)，TCF7L2基因及多態(tài)性與T2DM相關(guān)[13]。

本研究顯示：兩組rs12255372位點(diǎn)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組rs7903146位點(diǎn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。T2DM組rs12255372位點(diǎn)及rs7903146位點(diǎn)不同基因型比較HOMA-IR、FINS 、FPG、ISI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，提示在黑龍江省東部地區(qū)漢族人群中，rs7903146-C/T變異多態(tài)性與T2DM相關(guān),T等位基因?yàn)門2DM發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因；rs12255372-G/T變異及rs7903146-C/T變異可導(dǎo)致胰島素抵抗及胰島素敏感性下降；而rs12255372-G/T變異多態(tài)性與T2DM不相關(guān)，T等位基因非T2DM的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。本研究為T2DM的預(yù)防和探索臨床診治新途徑提供了科學(xué)依據(jù)。由于基因的分布受地區(qū)、種族、人群、飲食習(xí)慣等多因素影響，在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)多個(gè)基因、多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)、分析，會(huì)獲得更具代表性的結(jié)果。

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焦倩(1990～)女，湖北咸寧人，在讀碩士研究生。

楊玉紅(1970～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：jdyangyuhong@163.com。

7.1

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1008-0104(2016)06-0115-03

2015-11-02)