李善昌，趙 剛，王飛飛，付雅楠

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

?

小檗堿對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖和成骨活性的影響

李善昌，趙 剛，王飛飛，付雅楠

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究小檗堿對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖和成骨活性的影響。 方法：在中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心購買成骨細(xì)胞MC3T3-E1，進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)一定數(shù)量后應(yīng)用CCK8法檢測(cè)出小檗堿對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用ALP法檢測(cè)出小檗堿對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響，應(yīng)用茜素紅法染色觀察小檗堿對(duì)成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響。結(jié)果：用CCK-8法檢測(cè)出，小檗堿在1×10-5mol/L時(shí)成骨細(xì)胞增殖率最高，其他濃度略有增殖，但程度相對(duì)減少；ALP 活性測(cè)定，小檗堿在1×10-5mol/L時(shí)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶最高，其他濃度略有升高，但程度相對(duì)減少；小檗堿在濃度為1×10-5mol/L培養(yǎng)28d時(shí)鈣化結(jié)節(jié)形成最顯著。結(jié)論：小檗堿對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖和成骨活性均有促進(jìn)作用且在1×10-5mol/L時(shí)促進(jìn)作用最明顯。

小檗堿;成骨細(xì)胞;增殖;成骨活性

成骨細(xì)胞是骨形成過程中十分重要的細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的礦化，分泌和合成[1]。成骨與破骨過程的動(dòng)態(tài)平衡是維持骨量正常的關(guān)鍵[2～4]。成骨細(xì)胞不僅能夠決定骨的形成，同時(shí)也可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞對(duì)骨的吸收，它的增殖在很大程度上決定了最終形成的骨量。牙槽嵴頂下骨密度的變化要先于牙槽骨高度的變化，至少 30%的牙槽骨礦物含量喪失時(shí)才能在X線片上表現(xiàn)出高度的降低[5]。因此在臨床診斷和治療過程中，了解與認(rèn)識(shí)成骨細(xì)胞在骨重建過程中的作用具有重要意義。

小檗堿(berberine)又名黃連素,是從毛茛科植物黃連根莖中提取的異喹啉生物堿,有抗炎、抗腫瘤、抗菌作用、降血糖和調(diào)血脂等作用[6,7]。近年來發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)骨質(zhì)疏松具有預(yù)防作用[8]。為了進(jìn)一步探討小檗堿抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),觀察小檗堿對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖、成骨活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品購買于中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%，成骨細(xì)胞MC3T3-E1購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心、胎牛血清(Gibco公司)、青霉素鏈霉素溶液-雙抗(HyClone海可隆公司)、0.25%胰蛋白酶消化液(HyClone海可隆公司)、PBS(碧云天生物技術(shù)研究所)、二甲基亞砜(Sigma公司)、Cell Counting Kit-8試劑盒(Boster博士德生物) 、ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)、茜素紅(碧云天生物技術(shù)研究所) 。

1.2 主要儀器

電子天平(OHAUS,美國)、Olympus顯微鏡(日本Olympus顯微鏡)、酶標(biāo)儀(TAKARA,日本)、CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

倒置相差顯微鏡下觀察購買的 MC3T3-E1成骨細(xì)胞,在無菌操作臺(tái)下，將原培養(yǎng)基吸去，加入3ML PBS溶液清洗2遍,加入0.25%胰酶1mL,于CO2培養(yǎng)箱中消化1min 后,在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞收縮、變圓，大部分從培養(yǎng)瓶底脫落時(shí),加入完全培養(yǎng)基2mL終止消化,反復(fù)吹打細(xì)胞使其成為均勻的單細(xì)胞懸液,移至15mL離心管,置于離心機(jī)中，1000rpm離心3min,吸去上清液,加入含10%胎牛血清、1%雙抗的α-DMEM培養(yǎng)基2mL,輕輕多次吹打,使其均勻。接種至2個(gè)新培養(yǎng)瓶中,每個(gè)培養(yǎng)瓶再加入4mL完全培養(yǎng)基，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次。

1.3.2 細(xì)胞傳代

培養(yǎng)1～2d,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí),用PBS沖洗，胰蛋白酶消化,懸成 1×105個(gè)/mL的密度備用。

1.3.3 Cck8 法測(cè)定小檗堿對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖影響

取3塊96孔板，每塊板都分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組分為A、B、C、D、E五個(gè)亞組，每組5個(gè)復(fù)孔，用0.25%的胰酶消化成骨細(xì)胞后將其調(diào)整為密度為1×105個(gè)/mL,各組均加入100μL的細(xì)胞懸液。置于CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h至細(xì)胞貼壁，為了保證每孔體積相同，對(duì)照組不加任何試劑，只加100μL完全培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組各加入濃度分別為1×10-4mol/L，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L，1×10-8mol/L小檗堿100μL，置37℃溫箱。細(xì)胞培養(yǎng)，并分別于1d，3d，5d分別取出一塊96孔板，按Cck8測(cè)試盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm時(shí)每孔細(xì)胞OD值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求出其平均值。

1.3.4 ALP活性測(cè)定

取3塊96孔板,每塊板都分為空白對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組分為A、B、C、D、E五個(gè)亞組，方法同Cck8相同，分別于1d、3d、7d取出按堿性磷酸酶ALP測(cè)試盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。用酶標(biāo)儀測(cè)定520nm時(shí)各孔吸光度OD值。按照試劑盒說明書計(jì)算出培養(yǎng)細(xì)胞中的ALP活力。

1.3.5 ME3T3-E1成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)染色

6孔板中每孔接種1×105/mL成骨細(xì)胞1mL，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的小檗堿及含成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基1mL，對(duì)照組只加含成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基1mL，隔天換液,28d后將待測(cè)各孔培養(yǎng)液吸出，每孔加入2mL PBS清洗2遍，用茜素紅法染色并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Cck8法測(cè)定小檗堿對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖影響

結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，1×10-8mol/L實(shí)驗(yàn)組在1d、3d均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1×10-7mol/L實(shí)驗(yàn)組和1×10-4mol/L實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比分別在1d、5d無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間段與對(duì)照組相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較均有意義。說明各實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間段對(duì)成骨細(xì)胞增值均有不同程度的促進(jìn)作用，并在 1×10-5mol/L促進(jìn)增殖效果最明顯，見表1。

表1 小檗堿對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P>0.05)。

2.2 ALP活性測(cè)定

結(jié)果表明：1×10-8mol/L實(shí)驗(yàn)組在1d時(shí)與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1×10-4mol/L實(shí)驗(yàn)組在7d時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明高濃度的小檗堿在1d、3d時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性有促進(jìn)作用，而在7d時(shí)則有抑制作用。其他濃度在各時(shí)間點(diǎn)均有促進(jìn)作用，且隨時(shí)間推移，作用效果越顯著。其中 1×10-5mol/L在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上促進(jìn)效果最明顯。見表2。

表2 小檗堿對(duì)小鼠成骨細(xì)胞ALP活性的影響

注：與對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P>0.05)。

2.3 茜素紅染色

結(jié)果表明：于28d對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的成骨細(xì)胞進(jìn)行染色，1×10-5mol/L實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比鈣化結(jié)節(jié)形成最顯著。見圖1和圖2。

圖1 1×10-5mol/L 實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞茜素紅染色(×10)

圖2 對(duì)照組成骨細(xì)胞茜素紅染色(×10)

3 討論

成骨細(xì)胞在骨代謝過程中起著重要的作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化成熟是防治骨質(zhì)疏松癥的主要方法之一，已有實(shí)驗(yàn)證明復(fù)合材料明顯加速了骨修復(fù)進(jìn)程,具有良好的成骨活性[9]。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞也是進(jìn)行新藥開發(fā)和藥效評(píng)估的重要模型[10～12]。在骨組織形成過程中，成骨細(xì)胞先合無鈣鹽沉積的類骨質(zhì)，由成骨膠纖維和有機(jī)骨基質(zhì)構(gòu)成，內(nèi)含唾液蛋白，類脂等。類骨質(zhì)不斷將成骨細(xì)胞包埋其中，使成骨細(xì)胞成為骨細(xì)胞，類骨質(zhì)經(jīng)鈣鹽沉積變成為骨組織。 近年來研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有通過抑制破骨細(xì)胞的形成分化來抑制骨吸收，提高骨小梁的厚度及減少骨量丟失的作用[13]。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞所分泌的一種酶蛋白，特異性高[14],是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志之一[15],也是很重要的評(píng)價(jià)骨形成的指標(biāo)，是反應(yīng)成骨細(xì)胞活動(dòng)強(qiáng)弱的非常重要的標(biāo)志。鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞成骨活性的重要體現(xiàn)之一。Cck8法和Alp法均顯示1×10-5mol/L的小檗堿有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和成骨活性的作用。不同濃度的小檗堿對(duì)成骨細(xì)胞起作用的時(shí)間點(diǎn)不同，說明此藥物對(duì)細(xì)胞增值和成骨活性的促進(jìn)作用具有時(shí)效性。茜素紅染色顯示1×10-5mol/L小檗堿28d時(shí)能明顯促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)形成。本實(shí)驗(yàn)直接將小檗堿作用于成骨細(xì)胞，其作用機(jī)制需做進(jìn)一步研究。

[1]Owen T A, Aronow M , Shalhoub V, et al.Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitra reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during from ation of the bone extracellular matrix[J].J cell physoil, 1990, 143(3):420

[2]孫昊，王旭東，沈國芳，等.Dlx2在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中的作用[J].中國口腔頜面外科雜志，2011，9：189-194

[3]李萍，余守和，陳迪，等.過表達(dá)RunX2促進(jìn)C2C12細(xì)胞成骨分化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010,26：236-242

[4]Bragdon B, Mosegchuk O,Saldanha S, et al.Bone morpho-genetic proteins:a critical review [J].cellr signal,2011,23:609-620

[5]楊東紅，馮卉姍，趙剛，等. 不同牙周組織狀態(tài)下正畸牙移動(dòng)對(duì)牙槽骨影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36(6)：21-22

[6]Zhu X,Guo X,Mao G,et al. Hepatoprotection of berber-ine against hydrogen peroxide-induced apoptosis by up-regulation of Sirtuin 1[J]. Phytother Res,2013,27(3):417

[7]Potdar D,Hirwani RR,Dhulap S.Phyto-chemical and ph-armacological applications of berberis aristata[J].Fitotera-pia，2012,83(5):817

[8]師凌云,田密,常偉,等.小檗堿對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因PPARα和CPTIA表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(11):1461-1464

[9]鄧慧鑫，關(guān)鍵，張國梁，等.成骨細(xì)胞/CPC復(fù)合材料對(duì)兔下頜骨缺損的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010,33(3):6-7

[10] 宋芹，董小萍，郁小兵．補(bǔ)骨脂提取物對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響[J]．中國中藥雜志，2009，34(10)：1264-1267

[11]翟遠(yuǎn)坤，李志鋒，程國政，等．淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展[J]．中國骨質(zhì)疏松雜志，2009，15(7)：543-545

[12]劉亦恒，臧洪敏，張海英，等．淫羊藿總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞中OPG和RANKL mRNA基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中藥材，2005，28(12)：1076-1078

[13]魏鵬，焦磊，秦路平，等.小檗堿對(duì)大鼠骨髓源性破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能的影[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009,7(4)：342-348

[14]Lian JB,Gunderg CM. Osteocalcin. Biochemical consideration and clinical applications[J]. Clin Orthop Rel Res,1987，226(2):267-270

[15]Scutt A,Bertram P, Brautigam M. The role of glucocorticoids and prostag land in E2 in the recruitment of bone marrow mesenchy malcells to the osteoblastic line age: positive and negative effects[J]. Calcif Tissue Int,1996; 59(3):54-62

The effects of berberine on the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice

LIShan-chang,ZHAOGang,WANGFei-fei，F(xiàn)UYa-nan

(Jiamusi Stomatological Hospital, Jiamusi 154002, China)

Objective: To study the effect of berberine on the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice. Methods: Osteoblasts MC3T3-E1, purchased in the Cell resource center, Shanghai institute of life science, Chinese Academy of Sciences, were needed to be cultivated a certain number. Berberine on bone cell proliferation was detected by using CCK8 method, and bone cell alkaline phosphatase activity was detected by using ALP method. The influence of bone cell calcification nodule formation was detected by using red method dyeing effect. Results: CCK-8 method was used to detect the proliferation rate of osteoblasts, and berberine in 1×10-5mol/L osteoblast proliferation rate is the highest, while other concentration was slightly proliferated, but the degree is relatively reduced. ALP activity determination of berberine in 1×10-5mol/L osteoblast alkaline phosphatase was the highest. The concentration of others slightly increased, but the degree was relatively reduced. Berberine cultivated in the concentration of 1×10-5mol/L 28 d was the most significant in calcified nodules form. Conclusion: Berberine can promote the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice and promote the effect when the concentration is 1×10-5mol/L.

berberine;osteoblast cells;proliferation;osteogenic activity

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12521553。

李善昌( 1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

王飛飛(1991～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。E-mail:532103993@qq.com。

R285.5

A

1008-0104(2016)06-0024-03

2015-12-02)