陳全剛,陳仁金,袁紅花

(1.徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學神經生物研究中心,江蘇 徐州 221000)

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細胞自噬促進脂肪干細胞向軟骨細胞分化

陳全剛1,陳仁金1,袁紅花2

(1.徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學神經生物研究中心,江蘇 徐州 221000)

目的：探討細胞自噬對ADSCs分化的影響。方法：無菌條件下取大鼠大網(wǎng)膜，腎周脂肪囊，睪丸周圍等處取脂肪組織并分離ADSCs，用軟骨細胞誘導培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并通過抑制劑或干擾分子改變細胞自噬水平，檢測ADSCs向軟骨細胞分化的變化情況。結果：抑制自噬，細胞表達軟骨細胞標識蛋白，SOX-9的量顯著下調：誘導自噬，SOX-9的表達顯著升高，結論：細胞自噬促進ADSCs向軟骨細胞分化。

脂肪干細胞；細胞自噬；細胞分化

軟骨缺損是臨床常見的一種骨科疾病，由于軟骨是一種無神經及血管營養(yǎng)的組織，其自身修復能力有限，導致臨床治療困難重重。構建組織工程軟骨是一種有效的解決方式，然而，種子細胞的來源問題又一直制約著軟骨組織工程的發(fā)展。脂肪干細胞(adipose-derived-stem cells，ADSCs)的發(fā)現(xiàn)為解決這一問題提供了新的方法。細胞自噬是一種高度保守的溶酶體依賴性降解途徑。通過自噬，細胞可以清除受損或衰老的細胞器及過度聚集的蛋白，在維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。此外，越來越多的研究表明，細胞自噬還參與機體眾多機能的調控，如細胞凋亡、天然免疫、獲得性免疫、細胞分化等。迄今為止，細胞自噬對ADSCs的調控作用仍然未被證實。為此，本研究通過細胞自噬誘導劑雷帕霉素(Rapamycin)及抑制劑(3-MA)，分別誘導和抑制細胞自噬水平，進一步通過熒光定量PCR (qRT-PCR) 和Western blot檢測軟骨細胞標識物SOX-9的表達情況，發(fā)現(xiàn)誘導ADSCs的細胞自噬，顯著提高其向軟骨細胞的分化能力。相反，細胞自噬被抑制后，其分化能力顯著降低。此外，我們通過干擾分子抑制自噬相關基因ATG5的表達，對上述結果進行驗證，進一步證實了細胞自噬對ADSCs向軟骨細胞分化的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SD大鼠由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心自繁自養(yǎng)。3-MA、Rapamycin購自美國Sigma公司。LC3及SOX-9抗體購自美國 Cell Signaling Technology (CST)公司。Trizol Regent、熒光定量試劑盒購自Invitrogen公司。FITC標記二抗購自中國碧云天公司。ATG5干擾分子(siATG5)由蘇州吉馬公司設計合成。

1.2 ADSCs的分離培養(yǎng)

取雄性SD大鼠，頸椎脫臼法處死，在無菌條件下取大鼠大網(wǎng)膜，腎周脂肪囊，睪丸周圍等處取脂肪組織。脂肪組織經D-Hank’s液漂洗后剪碎，并置于0.1%的I型膠原酶中消化，隨后經過濾后置于含10% FBS高糖DMEM中，37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。72h后換液，去除未貼壁細胞，待細胞長滿后0.25%胰酶消化傳代。

1.3 Western blot

ADSCs接種6孔板，置于含軟骨細胞誘導劑(50nmol/L抗壞血酸、6.25mg/L胰島素、100nmol/L地塞米松、50μg/L TGF-β1)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)至第14天后，棄上清，細胞經裂解液裂解，收取總蛋白。等量的蛋白通過12%的SDS-PAGE膠進行跑膠分離，并轉移至PVDF膜上。洗滌后，用5%脫脂奶粉封閉。并分別用SOX-9、LC-3及內參β-actin一抗孵育，室溫孵育1h后，使用HRP標記的二抗進行孵育并顯色。

1.4 qRT-PCR

ADSCs經誘導培養(yǎng)14d后，收取樣品，按TRIzol Reagent說明書提取細胞總RNA。并通過逆轉錄酶將其反轉錄為cDNA。依據(jù)RT-PCR試劑盒說明書，進行實時熒光定量PCR擴增。SOX-9 mRNA表達水平與內參(GAPDH)作均一化處理。引物采用Primer 5進行設計，序列見表1。

表1 引物序列采用primer與設計

2 結果

2.1 誘導自噬促進ADSCs的分化

為證實細胞自噬對ADSCs分化的調控作用，我們用含軟骨細胞誘導劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs，同時設置雷帕霉素處理的實驗組。細胞培養(yǎng)14d后，收取樣品。細胞自噬被誘導后LC3蛋白會由LC3-I型轉化為LC3-II型，這也是公認的細胞自噬被誘導的標志。為此，我們首先通過Western blot檢測LC3-I和LC3-II蛋白的表達變化情況，結果發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理顯著促進LC3-II的表達(圖1A)，證實雷帕霉素可以提高ADSCs的自噬水平。進一步，通過qRT-PCR和Western blot分別檢測軟骨標識蛋白SOX-9在mRNA和蛋白水平的表達變化情況。結果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理顯著促進SOX-9的表達(圖1B, 1C)。

圖1 A: Western blot檢測LC3表達；B: qRT-PCR檢測SOX-9表達； C: Western blot檢SOX-9的表達

2.2 抑制細胞自噬抑制ADSCs向軟骨細胞分化

隨后，我們檢測抑制細胞自噬對ADSCs分化的影響。同樣，ADSCs在含軟骨細胞誘導劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實驗組用細胞自噬抑制劑3-MA處理，同時設未處理組對照。細胞培養(yǎng)14d后通過qRT-PCR及Western blot檢測SOX-9的表達變化情況。結果表明，3-MA處理顯著抑制SOX-9的表達(圖2A, 2B)。

圖2 A:qRT-PCR檢測SOX-9的表達；B: Western blot檢測SOX-9的表達

2.3 干擾自噬相關基因的表達抑制ADSCs向軟骨細胞分化

為進一步對上述結果進行驗證，我們通過干擾分子抑制自噬相關基因的表達，檢測其對ADSCs分化的影響。首先我們通過qRT-PCR驗證干擾分子的干擾效果。結果證實ATG5干擾分子可顯著抑制ATG5的表達(圖3A)。同時，SOX-9的表達也受到明顯抑制(圖3B, 3C)。表明抑制細胞自噬，可顯著抑制ADSCs向軟骨細胞的分化。

圖3 A,B: q RT-PCR 檢測ATG5及SOX-9的表達；C：Western blot檢測SOX-9的表達

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，軟骨受損后自身修復能力有限，當受損部位直徑大于4 mm時，則軟骨組織不能自行修復[1]。通過“微骨折”、軟骨移植等方法進行軟骨缺損治療取得一定效果，但同時面臨著排斥反應、修復質量差等缺陷。通過組織工程學對軟骨缺損進行治療，是醫(yī)學中的又一進步，通過組織工程制造的器官為創(chuàng)傷的修復提供了更豐富的來源，同時也是醫(yī)學進入制造組織和器官的新時代。然而，在組織器官體外制造的過程中，種子細胞的來源又制約著其發(fā)展。如，在對軟骨組織進行研究的過程中自體軟骨細胞最早被用作種子細胞，但該細胞存在體外分化能力弱且培養(yǎng)傳代中部分細胞會失去表形等缺點[2]。

脂肪干細胞是成體干細胞之一，2001年由Zuk等人從脂肪組織中分離得到，自身可不斷更新增殖，同時具有干細胞特有的多向分化潛能。大量的研究證實了，ADSCs在特定條件下可分化為神經細胞、成骨細胞、內皮細胞及軟骨細胞等[3～4]。細胞自噬是一種真核細胞高度保守的降解途徑，細胞自噬可降解體內過剩聚集蛋白或衰老的細胞器，在維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。隨著研究的不斷深入，細胞自噬的作用不斷被揭示，如自噬通過調節(jié)干擾素的產生而影響天然免疫，通過調控MHC分子的表達調節(jié)獲得性免疫等。此外，細胞自噬水平的改變還影響多種細胞的分化。如，通過基因敲除自噬相關基因，顯著抑制了成骨細胞的分化生成；細胞自噬可以通過降解PDLIM1蛋白而調控精子細胞的分化生成[5]；誘導自噬可以促進大鼠神經干細胞的增殖與分化等[6]。

ADSCs在軟骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)可分化為軟骨細胞。然而，迄今為止細胞自噬對脂肪干細胞分化的調控作用仍未見報道。為此，我們并對ADSCs進行軟骨細胞分化的誘導培養(yǎng)，同時，通過化學試劑或干擾分子等手段改變細胞自噬水平。通過qRT-PCR和Western blot手段檢測軟骨細胞標示蛋白SOX-9的表達變化情況，探明了細胞自噬在ADSCs向軟骨細胞分化過程中的正調控作用。為ADSCs做為種子細胞構建工程組織軟骨提供了更豐富的理論基礎。同時，也首次證實了在ADSCs中細胞自噬可以被誘導產生。

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Cell autophagy promoting the cells differentiation from adipose stem cells to cartilage

CHENQuan-gang1,CHENRen-jin1,YUANHong-hua2

(1.Laboratory Animal Unit, Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004, China; 2. Neurobiological Research Center, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004,China)

Objective: To investigated the effect of autophagy on ADSCs differentiation. Methods: ADSCs were isolated from the adipose tissue around the testicles under aseptic conditions. Cellular autophagy were induced or inhibited by inhibitors or interference and cultured in chondrocyte induction medium. The differentiations of ADSCs were evaluated by western blot. Results: Inhibits the cellular autophagy, the expression of cartilage cell protein SOX-9 significantly reduced. However, when cellular autophagy was induced, the SOX-9 expression was increased. Conclusion: Autophagy promotes the differentiation of ADSCs into chondrocytes.

ADSCs；autophagy;cell differentiation

1.徐州醫(yī)學院院長基金，編號：53631319；2.國家自然科學基金面上項目，編號：31172171。

陳全剛(1985～)男， 山東臨沂人，博士，助理研究員。

袁紅花(1968～)女，江蘇徐州人，高級實驗師。E-mail：jianling213@126.com。

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1008-0104(2016)06-0001-03

2016-06-23)