毛煒翔，陳紅兵

（1. 江西省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，南昌 330029；2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，南昌 330047）

小麥過敏原α-醇溶蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

毛煒翔1，陳紅兵2

（1. 江西省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，南昌 330029；2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，南昌 330047）

小麥中α-醇溶蛋白是乳糜瀉的主要致病抗原。本實驗根據(jù)已報道的α-醇溶蛋白氨基酸序列，PCR法從鄭麥9023中擴(kuò)增出了α-醇溶蛋白基因。分別將α-醇溶蛋白基因克隆到 pMD19-T-Simple載體和pGEX-4T-1載體，經(jīng)過PCR，酶切，測序鑒定，成功構(gòu)建了克隆載體pMD19-T-α-gli和表達(dá)載體pGEX-4T-1-α-gli，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS，借助SDS-PAGE分析方法，成功得到了表達(dá)α-醇溶蛋白的大腸桿菌工程菌株。

小麥過敏；醇溶蛋白；分子克??；表達(dá)

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國際化，食物過敏問題具有更大的潛在危險性，建立可靠、定量的過敏原檢測方法對于確保食品標(biāo)簽的一致性和消費(fèi)者的安全十分必要[1]。

我國作為小麥生產(chǎn)第一大國，長期以來也是小麥進(jìn)口大國，年消費(fèi)量在1億噸以上[1]，小麥過敏成為一個不可忽視的食品安全問題[2]。然而因歷史和研究水平的原因，我國對包括小麥過敏的基礎(chǔ)研究投入嚴(yán)重不足，相關(guān)的過敏原檢測技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)還是一片空白。

本實驗擬從小麥品種“鄭麥9023”（我國當(dāng)前優(yōu)質(zhì)小麥品種種植面積第一位）中，克隆出小麥重要過敏原α-gliadin的基因，并探索α-gliadin的基因在大腸桿菌中的表達(dá)。通過本實驗，將獲得大量重組過敏原α-gliadin，為下一步工作奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，如制備單克隆抗體或多克隆抗體、過敏原α-gliadin的表位定位以及乳糜瀉病人體外診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化[1]。同時，對于加快開展小麥過敏原檢測技術(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)的研究，保障人民身心健康安全將具有重要的現(xiàn)實意義[3]。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

種子購自河南省鄭州市場，E.coliDH5α本實驗室保存，載體pMD19-T-Simple購自Takara（大連）有限公司，E.coli BL21（DE3）pLysS、載體pGEX-4T-1由南昌大學(xué)黃國俊博士惠贈。

1.2 主要酶與試劑

Taq DNA聚合酶購自Takara（大連）有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、BamHI購自MBI公司，T4連接酶購自Promega公司，分子量Marker、高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒，PCR膠回收試劑盒購自TIANGen公司，其余試劑均為生化試劑或國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成[1]

根據(jù)GenBank已報道的小麥α-gliadin的基因序列，設(shè)計好一對擴(kuò)增引物，為了便于克隆與表達(dá)，在上游引物5'端引入了BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物5'端引入了EcoRI酶切位點(diǎn)。為了使限制性內(nèi)切酶能夠有效識別酶切位點(diǎn)切斷DNA，分別在上游引物和下游引物的5'端加入ACA和ACC保護(hù)性堿基（用帶底紋字體表示）[1]。

上游引物

5'-ACAGGATCCGTTAGAGTTCCAGTG -3'（BamHI）下游引物

5'-ACCGAATTCTCAGTTGGTACCGAAG-3'（EcoRI）

引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，酶切位點(diǎn)用斜體和下劃線表示[1]。

1.4 α-gliadin基因的擴(kuò)增

1.4.1 小麥基因組DNA的提取

以鄭麥9023種子為材料，提取基因組DNA[4]。

1.4.2 α-gliadin基因的擴(kuò)增

采用50μL反應(yīng)體系，dNTP（2.5mmol/L each）2μl，緩沖液（10xBuffer）5μl，上下游引物（20μmol/L）各1μl，模板DNA1μl（100ng），0.5μL（2.5單位）Taq DNA聚合酶，用無菌水加至總體積為50μL。94℃預(yù)變性2min；循環(huán)過程，94℃變性lmin，52℃退火lmin，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收

按照TIANGen普通型瓊脂糖DNA回收試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.6 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收的PCR產(chǎn)物與載體pMD19-T-Simple在T4DNA連接酶的作用下4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Ampicillin、X-gal、IPTG的LB培養(yǎng)基，挑取經(jīng)藍(lán)白斑篩選的白色菌落，用TIANGen質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定、測序，經(jīng)鑒定的陽性重組克隆質(zhì)粒命名為pMD19-T-α-gli[5]。

1.7 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pMD19-T-α-gli重組質(zhì)粒和pGEX-4T-1載體分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切后回收，在T4DNA連接酶的作用下16℃連接15h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞。挑選呈白色菌落的重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR[6]、雙酶切及序列測定，將經(jīng)鑒定的陽性重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-α-gli。

1.8 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-α-gli菌液劃線于含有Amp的LB瓊脂平板上，挑取單個菌落在含Amp（終濃度為100mg/L）的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1：50比例擴(kuò)大振蕩培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.55-0.65時，加入IPTG（終濃度為1.0mmol/L）37℃振蕩培養(yǎng)，另設(shè)未誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-α-gli重組質(zhì)粒菌作為陰性對照，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，各取出1mL菌液，然后于4℃ 12000rpm/min離心4min，收集上清，用PBS液懸浮沉淀。

1.9 SDS-PAGE電泳[7]

分別取經(jīng)過上述方法處理過的樣品10μL，加入等量2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5min，冰浴2min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（積層膠濃度為5%，分離膠為12%），電泳后，經(jīng)考馬斯亮蘭染色，甲醇-冰乙酸脫色后，觀察結(jié)果。通過Bio-Rad公司的成像系統(tǒng)Quantity One定量分析，對SDS-PAGE電泳的蛋白帶進(jìn)行掃描，分析表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥基因組DNA的提取

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明（圖1），可以看到小麥基因組DNA清晰的條帶，可以以此為模板擴(kuò)增目的基因α-gliadin。

圖1 小麥基因組DNA電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis pattern of genomic DNA from wheat

2.2 α-gliadin基因的PCR

采用設(shè)計的引物，以基因組為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳（圖2），在大約800bp的位置有特異片段，與預(yù)期的基因長度一致。

圖2 α-gliadin基因的擴(kuò)增Fig.2 The agrarose electrophoresis pattern of the target DNA by PCR amplification

2.3 重組克隆載體的PCR、雙酶切鑒定和測序

以陽性克隆子為模板，進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果在800bp左右有PCR產(chǎn)物（圖3），證明為陽性克隆子。

提取陽性克隆子的質(zhì)粒，分別用限制內(nèi)切酶BamHI，EcoRI酶切，經(jīng)凝膠電泳分析，酶切片段大小正確，證明克隆構(gòu)建成功（圖4）。

將上海生工測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，同源性最高可達(dá)到100%，證明已克隆到正確的α-gliadin基因。

圖3 pMD19-T-α-gli的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 The agrarose electrophoresis pattern of pMD19-T-α-gli gene by PCR amplification of target clone in situ

圖4 陽性克隆子的酶切鑒定Fig. 4 Agarose gel electrophoresis pattern of the digested plasmid DNA

2.4 重組表達(dá)載體的PCR、雙酶切鑒定和測序

以pGEX-4T-1-α-gli質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出800bp左右的條帶（圖5）；pGEX-4T-1-α-gli用BamHI，EcoRI雙酶切后，也可得到約800bp左右的片段（圖6）。通過PCR、酶切結(jié)果以及測序結(jié)果也表明，α-gliadin基因已被正確地插入到pGEX-4T-1表達(dá)載體中。

圖5 pGEX-4T-1-α-gli的PCR鑒定結(jié)果Fig.5 Agarose gel electrophoresis pattern of the target gene of pGEX-4T-1-α-gli by PCR

圖6 陽性克隆子的酶切鑒定Fig.6 Agarose gel electrophoresis pattern of the digested plasmid DNA

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測分析

pGEX-4T-1載體為含有tac啟動子以及Amp抗性基因的原核高效表達(dá)載體，PGEX-4T-1為融合表達(dá)載體，其本身表達(dá)GST Tag的蛋白，分子量大小為26 kD。所表達(dá)的目的蛋白的分子量為31 kD，因此重組融合蛋白的分子量應(yīng)為57kD。

通過與未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液相比較，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E.coliBL21（DE3）pLysS出現(xiàn)特異蛋白條帶，約為57Kd，目的蛋白大小和推測的結(jié)果相近（圖7），說明α-gliadin蛋白得到表達(dá)。Quantity One定量分析，誘導(dǎo)表達(dá)4h時融合蛋白含量GST-α-gliadin達(dá)到菌體總蛋白35%左右。

圖7 E.coliBL21（DE3）pLysS/pGEX-4T-1-α-gli的表達(dá)分析Fig.7 SDS-PAGE pattern of expression products of pGEX-4T-1-α-gli in BL21（DE3）pLysS induced by IPTG

3 討論

通過對α-gliadin基因的測序及其蛋白的表達(dá)，將為下一步做制備多克隆抗體的工作奠定基礎(chǔ)，證明重組蛋白是否具有與IgE抗體結(jié)合的能力，進(jìn)一步探索重組蛋白和天然蛋白在免疫原性上的區(qū)別，以及將來為大量的乳糜瀉病人體外診斷提供重組蛋白。

[1] 毛煒翔.小麥過敏原α-醇溶蛋白編碼基因的分子克隆的研究[D].南昌:南昌大學(xué).2008.

[2] Battais F, Pineau F, Popineau Y, et al. Food allergy to wheat: identification of immunoglobulin E and immunoglobulin G-binding proteins with sequential extracts and purified proteins from wheat flour[J]. Clin Exp Allergy, 2003, 33(7): 962-970.

[3] Biagi F, Zimmerl K, Thomas P. Is gliadin mispresented to the immune system in celiac disease? A hypothesis. [J]. Q J Med, 1999, 92(2): 119-122.

[4] McDonaldB A. Population genetics of plant pathogenic fungi[M]. Bioscience,1993.

[5] 吳乃虎.基因工程原理[M].北京:科學(xué)出版社,1999.

[6] 金冬雁譯.分子克隆實驗指南[M].北京:科學(xué)出版社,1992.

[7] 郝春燕,李建國,李雅軒.小麥醇溶蛋白基因克隆研究進(jìn)展[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,27(2): 67-70.

Prokaryotic Expression of α-gliadin Allergen in Wheat

MAO Wei-xiang1, CHEN Hong-bing2
(1. Jiangxi Institute of Standardization, Nanchang 330029, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang 330047, China)

α-gliadin is the major allergen that leads to celiac diseases. The α-gliadin gene was amplified by PCR from Zhengmai 9023, then cloned to pMD 19-T simple vector. A expression vector pGEX-4T-1-α-gli was constructed by routine method, and was identified by PCR, double digestion and sequence analysis. The result showed it was constructed correctly. The expression vector was transformed into E.coliBL21（DE3）pLysS and inducted by IPTG. The result of SDS-PAGE showed it was successfully expressed as a GST fusion protein.

wheat allergy; gliadin; molecular cloning; gene expression

TS201.3

A

1672-6286(2016)8-0011-6

國家質(zhì)檢總局科研計劃項目（2009QK230）。

毛煒翔（1983-），男，碩士，研究方向為食品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)化。