陳 琦,屈栗明,翟曉強,種 鐵,呂茉琦,洪慧慧,王子明,李和程

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；2. 陜西省第二人民醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系，陜西西安 710061)

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·基礎(chǔ)研究·

青春期前苯甲酸雌二醇暴露對大鼠睪丸基因表達譜的影響

陳 琦1,屈栗明2,翟曉強1,種 鐵1,呂茉琦3,洪慧慧3,王子明1,李和程1

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；2. 陜西省第二人民醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系，陜西西安 710061)

目的 研究青春期前苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate，EB)暴露對SD大鼠睪丸基因表達譜的影響。方法 12只21日齡雄性SD大鼠，隨機分為EB [100.0 μg/(kg·d) ]暴露組(AEb組)和對照組(AC組)。于青春期前，即出生后第22 天(PND 22)每日皮下注射EB[100.0 μg/(kg·d) ]，共14 d，對照組僅注射玉米油(溶媒)。于性成熟后(PND 64)處死大鼠，采用Affymetrix大鼠基因組230 2.0芯片研究大鼠睪丸基因表達譜變化，選擇部分基因采用定量RT-PCR驗證芯片實驗結(jié)果。結(jié)果 與對照組相比，AEb組有2 740個基因表達變化，其中下調(diào)基因1 043個，上調(diào)基因1 697個。聚類分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要包括類固醇激素合成、結(jié)合和代謝相關(guān)基因，精子發(fā)生和精子細胞發(fā)育相關(guān)基因，DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)基因，蛋白質(zhì)合成和修飾相關(guān)基因，以及免疫反應(yīng)、細胞粘附、細胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因等。實時定量RT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論 青春期前EB暴露對SD大鼠睪丸基因表達譜有影響，基因組學(xué)的改變可能進一步影響睪丸組織的發(fā)育與功能。

苯甲酸雌二醇(EB)；睪丸；基因芯片；大鼠；青春期前

國內(nèi)外研究顯示，近半個世紀(jì)以來人類精液質(zhì)量顯著下降，與此同時，隱睪、尿道下裂和睪丸腫瘤的發(fā)病率卻不斷增高[1-5]。外源性雌激素，也稱為環(huán)境雌激素，被認(rèn)為是上述現(xiàn)象發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)譡6]。既往研究大多圍繞在胚胎期和或新生期大劑量外源性雌激素暴露對雄性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的影響[7-10]，不能完全說明其他生長發(fā)育階段外源性雌激素暴露的風(fēng)險。青春期前是人和哺乳動物生殖系統(tǒng)發(fā)育的重要時期。此階段的兒童和青少年仍可有過量的外源性雌激素攝入。我們前期的研究結(jié)果顯示青春期前大劑量苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate， EB)暴露對大鼠睪丸發(fā)育及功能有明顯的近期和較遠期毒性作用[11], 但具體的分子機制尚不明確。為此，本次實驗我們采用大鼠基因組芯片方法觀察青春期前EB暴露對性成熟后大鼠睪丸基因表達譜的影響，并選擇部分基因采用定量RT-PCR驗證芯片結(jié)果，進一步闡明青春期前大劑量EB暴露對性成熟期大鼠睪丸發(fā)育影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 主要試劑：EB(粉劑, 純度98%)、玉米油(corn oil) 和Earle 平衡鹽溶液(含碳酸氫鈉2.2 g/L) 均為美國Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品;大鼠基因組230 2.0基因芯片(GeneChip?Rat Genome 230 2.0 Array，包含31 042個大鼠基因或ESTs的探針組)(美國Affymetrix公司)。

1.2 實驗動物分組與處理 根據(jù)前期實驗方法[11]，選取12只21日齡雄性SD大鼠(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供)，在室溫20～25 ℃下，按自然晝夜節(jié)律采光，普通飼料喂養(yǎng)，大鼠可自由飲水。隨機將大鼠分為EB [100.0 μg/(kg·d) ]暴露組(AEb組)和對照組(AC組)，每組6只。于青春期前，即出生后第22(postnatal day 22，PND 22)～35 天(PND 35)，實驗組每日皮下注射EB(美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，粉劑，純度98%，溶解于玉米油中)，共14 d，對照組僅注射玉米油(溶媒)。于性成熟后(PND 64)利用乙醚麻醉法處死大鼠，迅速取出睪丸組織，稱重后將睪丸組織迅速置入液氮快速冷凍后-80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因芯片檢測 利用Trizol法提取睪丸組織總RNA，并進行質(zhì)檢，從每組中選擇RNA質(zhì)檢合格的標(biāo)本(每組n=4)，等量混合(生物重復(fù))后進行芯片研究[28]，采用One-Step Tukey’s Biweight法計算log2ratio值的加權(quán)平均數(shù)，該加權(quán)平均數(shù)即可反應(yīng)某個基因或EST在實驗組中的表達變化方向及變化幅度。log2ratio=1.0時，代表某個基因或EST在實驗組中的表達增加至對照組的2倍；log2ratio=-1.0時，代表某個基因或EST在實驗組中的表達下降至對照組的0.5倍；log2ratio=0時，代表某個基因或EST在實驗組中的表達與對照組無差異。

1.4 實時定量RT-PCR 根據(jù)芯片雜交結(jié)果，對部分基因利用ABI PRISM-7000 Sequence Detection System進行實時定量RT-PCR驗證。擴增cDNA的基因代號及其引物(以β-actin為內(nèi)參對照)見表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中cDNA模板2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 25 μL， Dye 6 μL，上游引物 2 μL，下游引物2 μL，雙蒸水13 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性30 s，58.5 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，進行45個循環(huán)，72 ℃ 延伸30 min。用實驗組平均△Ct值減去對照組的平均△Ct值，即得到實驗組與對照組比較的log2ratio值，可直接與實驗芯片與對照芯片比較時算得的該待測基因的log2ratio值進行比較。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 睪丸組織基因表達譜分析 與對照組比較，EB [100.0 μg/(kg·d) ]暴露組(AEb組)共有2 740個基因表達發(fā)生改變，其中下調(diào)基因1 043個，上調(diào)基因1 697個，見圖1。

圖1 AEb組與對照組比較睪丸組織差異

2.2 差異基因聚類分析 根據(jù)基因GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫中基因產(chǎn)物的分子功能、參與的生物過程及其所屬的細胞成分，初步可將青春期前大劑量EB暴露所引起表達變化基因分為以下幾類：類固醇激素合成、結(jié)合和代謝相關(guān)基因；精子發(fā)生與精子細胞發(fā)育相關(guān)基因；凋亡相關(guān)基因；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因；細胞骨架相關(guān)基因；細胞粘附相關(guān)基因；氧化應(yīng)激相關(guān)基因；免疫反應(yīng)相關(guān)基因；DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)基因；蛋白質(zhì)合成、修飾和折疊相關(guān)基因以及功能不明基因等。

其中在類固醇激素合成、結(jié)合和代謝相關(guān)基因中， AEb組有8個基因表達下調(diào)，有31個基因表達上調(diào)，具體基因變化情況見表2。在精子發(fā)生與精子細胞發(fā)育相關(guān)基因中， AEb組有24個基因表達下調(diào)，有11個基因表達上調(diào)，具體基因變化情況見表3。2.3 實時定量RT-PCR結(jié)果 本研究進一步采用實時定量RT-PCR驗證可能與睪丸生長和發(fā)育有關(guān)的差異表達基因Svs5、Ca2、Olfm1、Pxmp4、Rapgef4、RGD1563617_predicted、LOC498335、Cyp17a1、Esr1、Ncr3、RGD1563599_predicted和S100a9等基因在AEb組和對照組中的表達變化，實時定量RT-PCR實驗結(jié)果與基因芯片實驗結(jié)果基本一致，具體見表4。

表1 PCR擴增cDNA的基因代碼及其引物

登錄號基因代碼引物基因序列片段大小(bp)NM＿133516Svs5F5′?GCCAACTGAAGACTTGAGCCAATAG?3′96R5′?GGGATCCTGCATCCTGAGACA?3′NM＿019291Ca2F5′?AGCTGTGCAGCACCCAGATG?3′192R5′?GAGCCAGGATATGTCCAGTAGTCCA?3′NM＿053573Olfm1F5′?TGGCGCCTATGACTACGATGAA?3′147R5′?GACCCGAACCTTGAGCCTGA?3′NM＿172223Pxmp4F5′?CACCTATAAGAGTCTCCAGGCCCTA?3′164R5′?AGGCAAACAGGACACGTGATG?3′BF404045Rapgef4F5′?AACATGCCTTTCATTCCTCCA?3′128R5′?AGGCGTTGCCCCATTTC?3′AI454332RGD1563617＿predictedF5′?AAAAGGAAAAAGAAAACGCT?3′118R5′?TCTCAGCAATCGTTACCTTC?3′AA892854LOC498335F5′?AACTCCACCTCCAGGCAGAATG?3′139R5′?GGTCGAGCTCACCTTGGAACA?3′NM＿012753Cyp17a1F5′?TGGCCATCTGCCTACACCTG?3′180R5′?TGACATGCATATGACCACGTCTG?3′NM＿012689Esr1F5′?TGTTACGAAGTGGGCATGATGAA?3′145R5′?GCCAAAGGTTGGCAGCTCTC?3′NM＿181822Ncr3F5′?GAGCGAGCTGCCTACACAAGTC?3′178R5′?AGTGCTGGATCTTTGGGATTTAGAA?3′AA800892RGD1563599＿predictedF5′?ACGCCTCAAGATCCCGTTT?3′97R5′?GTGCCTACGGTTTATGCTCTTTG?3NM＿053587S100a9F5′?CTGAACAAGGCGGAATTCAAAG?3′185R5′?TTCTCATGACAGGCAAAGATCAAC?3′NM＿031144Actb(β?actin)F5′?GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3′139R5′?GGTCGAGCTCACCTTGGAACA?3′

表2 青春期前EB暴露對性成熟后大鼠睪丸類固醇激素合成、結(jié)合和代謝相關(guān)基因表達的影響

基因登錄號基因名稱基因代碼暴露組vs．對照組(log2ratio)NM＿012692CytochromeP450IIA1(hepaticsteroidhydroxylaseIIA1)gene///cy?tochromeP450，subfamily2A，polypeptide1Cyp2a1///Cyp2a2-0．8BM390846transcriptionalregulatingfactor1(predicted)Trerf1＿predicted-0．4AI175488oxysterolbindingprotein(predicted)Osbp＿predicted-0．6AI070135oxysterolbindingprotein?like1AOsbpl1a-0．6NM＿012859lipase，hormonesensitiveLipe-0．5AI137224oxysterolbindingprotein?like1AOsbpl1a-0．5NM＿012753cytochromeP450，family17，subfamilya，polypeptide1Cyp17a11．4NM＿031682hydroxyacyl?CoenzymeAdehydrogenasetypeIIHadh21．3NM＿0172683?hydroxy?3?methylglutaryl?CoenzymeAsynthase1Hmgcs10．6NM＿032066hydroxysteroid(17?beta)dehydrogenase12Hsd17b120．7NM＿017286cytochromeP450，family11，subfamilya，polypeptide1Cyp11a10．5NM＿017265hydroxysteroiddehydrogenase?1，delta<5>?3?beta(predicted)Hsd3b1＿predicted0．9AF394783sulfotransferasefamily1A，phenol?preferring，member1Sult1a11．0AI175009diazepambindinginhibitorDbi0．7M34728sterolcarrierprotein2Scp20．7M57668prolactinreceptorPrlr1．0AI233740aldo?ketoreductasefamily1，memberB8Akr1b80．7M62763sterolcarrierprotein2Scp20．7BM384958vitaminKepoxidereductasecomplex，subunit1Vkorc10．6NM＿053569membrane?boundtranscriptionfactorpeptidase，site1Mbtps10．8NM＿012692CytochromeP450IIA1(hepaticsteroidhydroxylaseIIA1)geneCyp2a1-1．0AI112698Oxysterolbindingprotein2(predicted)Osbp2＿predicted-0．6NM＿053317nuclearreceptorsubfamily0，groupB，member1Nr0b10．5NM＿031541scavengerreceptorclassB，member1Scarb11．1AF071495scavengerreceptorclassB，member1Scarb11．4NM＿024392hydroxysteroid(17?beta)dehydrogenase4Hsd17b40．4NM＿053819tissueinhibitorofmetalloproteinase1Timp11．0NM＿012576nuclearreceptorsubfamily3，groupC，member1Nr3c10．6NM＿080886sterol?C4?methyloxidase?likeSc4mol0．5NM＿012650sexhormonebindingglobulinShbg0．7NM＿017154xanthinedehydrogenaseXdh0．5AI235465steroidsensitivegene1Ssg10．7M336483?hydroxy?3?methylglutaryl?CoenzymeAsynthase2Hmgcs20．8L48060prolactinreceptorPrlr0．8J03867cytochromeb5reductase3Cyb5r30．5BE098506dehydrogenase/reductase(SDRfamily)member8Dhrs80．6NM＿017080hydroxysteroid11?betadehydrogenase1Hsd11b10．4M28241glutathioneS?transferase，mu1Gstm10．7AB006007steroidogenicacuteregulatoryproteinStar0．3

表3 青春期前EB暴露對性成熟后大鼠睪丸精子發(fā)生與精子細胞發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

登錄號基因名稱基因代碼暴露組vs．對照組(log2ratio)AF094609spermatogenesisassociated7Spata7-0．3BF405109protease，serine，21Prss21-0．4BE100899spermatogenesisassociated20Spata20-0．5BI289580spermatogenesisassociated20Spata20-0．4BF390864spermatogenesisassociated21Spata21-0．3NM＿031792spermassociatedantigen4Spag4-0．3NM＿013136malegermcell?associatedkinaseMak-0．5NM＿134392spermatogenesisassociated6Spata6-0．3AI179127Kelchdomaincontaining3Klhdc3-0．3BI288276fascinhomolog3，actin?bundlingprotein，testicular(Strongylocentrotuspurpuratus)Fscn3-0．5AI717642serine/threoninekinase22substrate1Stk22s1-0．7NM＿022209proteinphosphatase2(formerly2A)，regulatorysubunitB(PR52)，betaisoformPpp2r2b-0．9AA800004septin44?Sep-0．3NM＿021596diazepambindinginhibitor?like5Dbil5-0．3aNM＿134467ringfingerprotein38Rnf38-0．3aAF077195Sertolicellprotein1Sert10．6AF139918insulin?like3Insl31．4NM＿012793guanidinoacetatemethyltransferaseGamt0．9NM＿053867tumorprotein，translationally?controlled1Tpt10．7NM＿013041synaptonemalcomplexprotein3Sycp3-0．4NM＿012579histone1，H1tHist1h1t-1．0NM＿012810synaptonemalcomplexprotein1Sycp1-0．8Y11490adisintegrinandmetallopeptidasedomain18Adam18-0．7NM＿053832forkheadboxJ1Foxj1-1．0BF410146heatshock70kuprotein2Hspa2-0．6AI547628similartospermatogenesisassociatedglutamate(E)?richprotein4dLOC501290-0．4BF410146heatshock70kuprotein2Hspa2-0．6AF314657clusterinClu0．7NM＿053457claudin11Cldn110．6NM＿021989tissueinhibitorofmetalloproteinase2Timp20．7BG673439claudin11Cldn110．5BI276999testisenhancedgenetranscriptTegt0．4NM＿031694heatshockfactor2Hsf2-0．4aBF523128tissueinhibitorofmetalloproteinase2Timp20．4bAF314657clusterinClu0．8b

注：a臨界減少(MD)；b臨界增加(MI)。

表4 定量RT-PCR與芯片實驗結(jié)果對照表

登錄號基因代碼暴露組(AEb)vs．對照組(AC)(log2ratio)RT?PCR芯片NM＿133516Svs53．43．0NM＿019291Ca21．01．2NM＿053573Olfm1-0．6-1．6NM＿172223Pxmp41．01．4BF404045Rapgef40．20．4AI454332RGD1563617＿predicted0．73．1AA892854LOC498335-0．8-1．1NM＿012753Cyp17a11．31．4NM＿012689Esr1-0．3-0．3NM＿181822Ncr3-1．1-2．1AA800892RGD1563599＿predicted-0．6-0．8NM＿053587S100a9-1．8-2．0

3 討 論

隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染日益加劇，作為人類健康核心和社會文明進步標(biāo)志的生殖健康的情況也更加惡化，而男性生殖健康形勢尤為嚴(yán)峻[1-5]。1992年，丹麥CARLSEN等[12]回顧了1938～1991年間公開發(fā)表的關(guān)于精液質(zhì)量研究的61篇文獻，發(fā)現(xiàn)西方國家男性精子密度均數(shù)由1940年的113×106/mL降至1990年的66×106/mL，下降幅度接近50%。2000年，SWAN等[2]在此基礎(chǔ)上，又補充了1991～1996年間發(fā)表的文獻(共101篇)并進行薈萃分析，再次證實了上述結(jié)論。我國學(xué)者黃莉萍等[3]對1985～2009年間的115篇文獻進行總結(jié)分析后也發(fā)現(xiàn)近25年來我國正常男性精子密度呈顯著下降趨勢。

既往關(guān)于外源性雌激素的雄性生殖毒性作用研究，大多集中于胚胎期和新生期外源性雌激素暴露對雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能的影響。比如，胚胎期或圍出生期大劑量外源性雌激素暴露，可導(dǎo)致雄性動物出現(xiàn)尿道下裂、隱睪和成年后精子密度下降[7,13-14]。新生期大劑量外源性雌激素暴露，也可引起生殖系統(tǒng)發(fā)育異常[15-17]。然而，青春前期是人和哺乳動物生殖系統(tǒng)發(fā)育的重要時期，這一時期的兒童仍可有過量的外源性雌激素攝入，具有雌激素樣作用的烷基酚類和鄰苯二甲酸酯類化合物廣泛存在于生產(chǎn)和生活環(huán)境中，可直接污染水源和食物[13]。經(jīng)典雌激素類物質(zhì)，如雌二醇和DES等，作為家畜或家禽促生長激素的應(yīng)用已被長期禁止，但不排除被不法養(yǎng)殖者非法使用[7]。在臨床醫(yī)療工作中，患有包皮過長、包莖或尿道下裂的兒童或青少年施行陰莖或尿道手術(shù)后，常注射或服用大劑量的雌激素，如DES或EB，以防止術(shù)后陰莖勃起，甚至有濫用趨勢[11]，這些均有可能危害青春期前的人群，我們在前期研究[11]中發(fā)現(xiàn)青春期前EB暴露可引起性成熟期大鼠血清睪酮濃度明顯降低(P<0. 05),睪丸重量減輕，生精小管發(fā)育較差、生精上皮中細胞數(shù)目減少、精子發(fā)生阻滯、間質(zhì)細胞發(fā)育幼稚等表現(xiàn)，但具體的分子機制不明。

本研究采用基因芯片研究青春期前EB暴露對SD大鼠性成熟后(PND64)睪丸基因表達譜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青春期前大劑量EB暴露[100.0 μg·(kg·d)×14 d]與對照組相比有共有2 740個基因表達發(fā)生改變，其中下調(diào)基因1 043個，上調(diào)基因1 697個，結(jié)合我們前期發(fā)現(xiàn)，說明該劑量EB暴露在引起大鼠睪丸明顯大體和組織形態(tài)改變的情況的同時具有基因組毒性作用，基因組變化可能進一步解釋睪丸的形態(tài)和功能改變。

通過基因聚類分析，我們發(fā)現(xiàn)青春期前EB暴露的睪丸毒性作用機制涉及多種途徑，包括類固醇激素合成、結(jié)合和代謝，精子發(fā)生和精子細胞發(fā)育，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，凋亡，細胞骨架合成，細胞粘附，氧化應(yīng)激，免疫反應(yīng)，DNA復(fù)制和修復(fù)，蛋白質(zhì)合成和修飾等。外源性雌激素暴露生殖毒性作用機制的多樣性和復(fù)雜性說明通過單個或幾個基因或信號通路研究不可能完全闡明其機制，確有必要利用高通量基因芯片技術(shù)在整個基因組的表達水平進行全面篩選或研究，這可能也是最終闡明外源性雌激素生殖毒性機制的必由之路。

在差異表達的類固醇激素的合成、結(jié)合和代謝基因中，共有39個基因發(fā)生變化，這些基因大部分與雄激素的合成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在青春期前大劑量暴露組中，Scarb1、Cyp11a1、Hsd3b1和Cyp17a1表達均上調(diào)。LIU等[18]研究了4種具有發(fā)育毒性作用的鄰苯二甲酸酯類化合物胚胎期(GD11～19)暴露對大鼠GD19時睪丸基因表達譜的影響，發(fā)現(xiàn)Scarb1、Cyp11a1、Hsd3b1和Cyp17a1表達均下調(diào)。NACIFF等[19]研究了17α-炔雌醇等3種外源性雌激素胚胎期(GD11～20)暴露對大鼠GD20時睪丸和附睪混合標(biāo)本基因表達譜的影響，也發(fā)現(xiàn)Scarb1、Star、Cyp11a1和Cyp17a1表達均下調(diào)。這兩項研究的結(jié)果與本研究結(jié)果不完全一致，但FIELDEN等[20]在研究胚胎期至哺乳期(GD12～PND20)DES暴露對PND21、PND105和PND315時睪丸基因表達的影響時發(fā)現(xiàn)，Scarb1在PND21時表達上調(diào)，Star、Cyp11a1和Cyp17a1在PND105時上調(diào)。我們分析造成這種差異的原因可能與不同的實驗動物，不同的外源性雌激素以及不同的檢測時間點有關(guān)，但其中機制仍需要進一步探討。此外，在類固醇激素的合成、結(jié)合和代謝相關(guān)基因中，我們還發(fā)現(xiàn)具有性激素結(jié)合轉(zhuǎn)運功能的性激素結(jié)合球蛋白的基因(Shbg)在青春期前大劑量EB暴露組中的表達上調(diào)，具有雌激素代謝滅活作用的雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶SULT1A1基因(Sult1a1)在青春期前表達上調(diào)。核受體家族成員基因(Nr0b1)青春期前大劑量組中表達上調(diào)， Nr0b1又稱為Dax-1蛋白，該蛋白表達于胚胎期睪丸，與哺乳動物性腺發(fā)育和性別決定有關(guān)[19]。這些基因的變化可能解釋青春期前EB暴露對性成熟期血清睪酮水平的下降以及睪丸間質(zhì)細胞發(fā)育幼稚等現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)共有35個精子發(fā)生和精子細胞發(fā)育相關(guān)基因表達發(fā)生變化，其中大部分為精子發(fā)生相關(guān)基因，精子細胞發(fā)育相關(guān)基因僅有4個(Fscn3、Stk22s1、Ppp2r2b、Rnf38)，實驗結(jié)果進一步說明青春期前大劑量EB暴露除影響精子發(fā)生外，對精子細胞發(fā)育也有影響。以上這些基因的變化也可以解釋我們前期實驗中發(fā)現(xiàn)的青春期前EB暴露對大鼠性成熟期后附睪精子數(shù)量和質(zhì)量的下降現(xiàn)象。

綜上所述，本研究初步明確了青春期前EB暴露生殖毒性作用的部分基因機制，差異表達基因也可初步作為監(jiān)測外源性雌激素生殖毒性作用標(biāo)志物的候選分子。

[1] ROLLAND M, LE MJ, WAGNER V, et al. Decline in semen concentration and morphology in a sample of 26609 men close to general population between 1989 and 2005 in France[J]. Hum Reprod, 2013, 28(2):462-470.

[2] SWAN SH, ELKIN EP, FENSTER L. The question of declining sperm density revisited an analysis of 101 studieds published in 1934-1996[J]. Environm Health Perspect. 2000, 108(7): 961-966.

[3] 黃莉萍，李亞斐，熊鴻燕，等. 近25年中國正常男性精液質(zhì)量的變化趨勢分析[J]. 生殖與避孕， 2011,31(2):122-128.

[4] BARAZANI Y, KATZ BF, NAGLER HM, et al. Lifestyle, environment, and male reproductive health[J]. Urol Clin North Am,2014, 41(1):55-66.

[5] SVECHNIKOV K, STUKENBORG JB, SAVCHUCK I, et al.Similar causes of various reproductive disorders in early life[J]. Asian J Androl, 2014, 16(1):50-59.

[6] TOFT G, Persistent organochlorine pollants and human reproductive health[J]. Dan Med J,2014, 61(11):B4967.

[7] SHARPE RM. The ’oestrogen hypothesis’-where do we stand now? [J]. Int J Androl, 2003, 26(1): 2-15.

[8] NORGIL DI, MAIN KM, TOPPARI J, et al. Impact of exposure to endocrine disrupters in utero and in childhood on adult reproduction [J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2002, 16(2): 289-309.

[9] FISHER JS. Environmental anti-androgens and male reproductive health: focus on phthalates and testicular dysgenesis syndrome [J]. Reproduction, 2004, 127(3): 305-315.

[10] EDWARDS TM, MOORE BC, GUILLETTE Jr LJ. Reproductive dysgenesis in wildlife: a comparative view [J]. Int J Androl, 2006, 29(1):109-121.

[11] 李和程，陳琦，王子明，等. 青春期前苯甲酸雌二醇暴露對SD大鼠睪丸發(fā)育與功能的影響[J]. 四川大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2009,40(1):15-19.

[12] CARLSEN E, GIWERCMAN A, KEIDING N, et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years[J]. Bmj, 1992, 305(6854):609-613.

[13] CEDERROTH CR, SCHAAD O, DESCOMBES P, et al. Estrogen receptor alpha is a major contributor to estrogen-mediated fetal testis dysgenesis and cryptorchidism [J]. Endocrinology, 2007,148(11):5507-19.

[14] VIRTANEN HE, RAJPERT-DE ME, MAIN KM, et al. Testicular dysgenesis syndrome and the development and occurrence of male reproductive disorders[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 207(2 Suppl):501-505.

[15] ATANASSOVA N, MCKINNELL C, WALKER M, et al. Permanent effects of neonatal estrogen exposure in rats on reproductive hormone levels, Sertoli cell number, and the efficiency of spermatogenesis in adulthood [J]. Endocrinology, 1999,140(11):5364-5373.

[16] SHARPE RM, RIVAS A, WALKER M, et al. Effect of neonatal treatment of rats with potent or weak(environmental) oestrogens, or with a GnRH antagonist, on Leydig cell development and function through puberty into adulthood [J]. Int J Androl, 2003, 26(1):26-36.

[17] MCKINNELL C, ATANASSOVA N, WILLIAMS K, et al. Suppression of androgen action and the induction of gross abnormalities of the reproductive tract in male rats treated neonatally with diethylstilbestrol [J]. J Androl, 2001, 22(2):323-338.

[18] LIU K, LEHMANN KP, SAR M, et al. Gene expression profiling following in utero exposure to phthalate esters reveals new gene targets in the etiology of testicular dysgenesis[J]. Biol Reprod, 2005, 73(1):180-192.

[19] NACIFF JM, HESS KA, OVEMANNn GJ, et al. Gene expression changes induced in the testis by transplacental exposure to high and low doses of 17{alpha}-ethynyl estradiol, genistein, or bisphenol A[J]. Toxicol Sci, 2005, 86(2):396-416.

[20] FIELDEN MR, HALGREN RG, FONG CJ, et al. Gestational and lactational exposure of male mice to diethylstilbestrol causes long-term effects on the testis, sperm fertilizing ability in vitro, and testicular gene expression[J]. Endocrinology, 2002, 143(8): 3044-3059.

(編輯 王 瑋)

Effects of prepubertal exposure toestradiol benzoate on rat testicular gene expression profile

CHEN Qi1, QU Li-ming1, ZHAI Xiao-qing1, CHONG Tie1, LV Mo-qi3, Hong Hui-hui3, WANG Zi-ming1, LI He-cheng1

(1.Department of Urology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004,China; 2. Department of Urology, the Second People’s Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710004, China; 3. Department of Pathology, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the effects of prepubertal exposure to estradiol benzoate(EB) on testicular gene expression profile of SD rats.Methods A total of 12 21-day-old male SD rats were randomly divided into EB exposure group(AEb) and a control group(AC). Rats in the AEb group were injected(s.c.) with EB dissolved in corn oil at a dose of 100.0 μg/(kg·d) during prepuberty [from postnatal day(PND) 22 to PND 35] for 14 d, while rats in the AC group received vehicle only. After sexual maturity(PND 64), the testes were harvested and testicular gene expression profile was analyzed by Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array and some genes were selected to confirm the results of array by Q-RT-PCR. Results Compared with the control, in AEb group, 2740 genes’ expression changed, of which 1043 were down-regulated and 1697 were up-regulated. All altered genes that had known function could be classified as followed: genes related to steroids synthesis, binding and metabolism, spermatogenesis and spermatid development, DNA replication and repair, protein synthesis and modification, transcription regulation, immune response, cytoskeleton, signal transduction, oxidative stress and apoptosis. Moreover, Q-RT-PCR results were basically identical with the results of gene microarray. Conclusion Prepubertal exposure to EB 100.0 μg/(kg·d) affects the testicular gene expression profile of SD rats. The changes of genomics may further affect the growth, development and function of testicular tissues.

estradiol benzoate; testis; gene microarray; rat; prepuberty

2015-12-17

2016-03-01

陜西省自然科學(xué)基金(No. 2015JM8436)；陜西省衛(wèi)生廳基金(No. 012D58)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目[No. 2007K15-02(3)]

李和程,副主任醫(yī)師.E-mail:lhch29@126.com.王子明,教授,主任醫(yī)師.E-mail:ziming-w@263.net

陳琦(1972-),男(漢族),主治醫(yī)師,碩士.研究方向:泌尿外科、男科學(xué). E-mail: chenqixjtu@163.com

R994.6；Q492.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.06.017