管楊波， 農(nóng)紹軍， 張躍平，劉益飛

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院, 1.泌尿外科，2.病理科， 江蘇南通 226001)

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·臨床研究·

Nanog蛋白對(duì)前列腺癌雄激素剝奪治療后進(jìn)展速度的預(yù)測價(jià)值

管楊波1， 農(nóng)紹軍1， 張躍平1，劉益飛2

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院, 1.泌尿外科，2.病理科， 江蘇南通 226001)

目的 探討前列腺癌Nanog基因的蛋白表達(dá)對(duì)雄激素剝奪治療后進(jìn)展的預(yù)測價(jià)值。 方法 選擇2009年9月至2014年7月南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科收治的前列腺癌患者，共115例，所有入組患者病理確診后接受雄激素剝奪治療，免疫組化EnVision染色方法檢測前列腺穿刺癌組織中Nanog蛋白表達(dá)，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)分析臨床病理因素與Nanog蛋白標(biāo)記表達(dá)相關(guān)性，Nanog蛋白表達(dá)和傳統(tǒng)臨床病理因素分別進(jìn)行單因素分析(Log-rank檢驗(yàn))和多因素分析(Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型)。結(jié)果 Nanog蛋白表達(dá)與傳統(tǒng)臨床病理因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)治療前PSA水平與Nanog蛋白水平相關(guān)。單因素生存分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析發(fā)現(xiàn)Nanog蛋白表達(dá)是雄激素剝奪治療后進(jìn)展的獨(dú)立影響因素。結(jié)論 Nanog蛋白表達(dá)對(duì)前列腺癌雄激素剝奪治療后進(jìn)展速度有一定的預(yù)測價(jià)值。

Nanog；前列腺癌；雄激素剝奪治療；預(yù)測價(jià)值；生存分析

前列腺癌(prostatic carcinoma, PCa)是泌尿外科常見惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)居常見腫瘤第5位和男性腫瘤第2位[1]。近年來國內(nèi)前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]，并且大多數(shù)國內(nèi)PCa患者確診時(shí)已失去根治術(shù)機(jī)會(huì)，雄激素剝奪治療成為這部分患者的首先治療方案。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者一開始對(duì)雄激素剝奪治療有效，但幾乎所有接受治療的患者最終都將發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。由于前列腺癌具有高度異質(zhì)性和多灶性的生物學(xué)特性，故內(nèi)分泌治療后的病情進(jìn)展速度千差萬別。我們以往研究發(fā)現(xiàn)臨床病理指標(biāo)在一定程度上有助于預(yù)測預(yù)后，但準(zhǔn)確性尚不令人滿意[3-4]。臨床上急需要能夠預(yù)測雄激素剝奪治療后病情進(jìn)展速度的標(biāo)記物，指導(dǎo)臨床治療策略的制定和確定個(gè)性化的治療方案。

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，前列腺癌內(nèi)部存在著一小部分癌干細(xì)胞，它們對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感，其有可能成為前列腺癌產(chǎn)生去勢(shì)抵抗的原因[5]。近年來Nanog基因被證實(shí)為前列腺癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記物[6-7]，而Nanog基因?qū)η傲邢侔┬奂に貏儕Z治療后進(jìn)展的預(yù)測價(jià)值目前尚不清楚。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測了Nanog基因在雄激素剝奪治療前前列腺癌組織中表達(dá)水平，探討Nanog基因與雄激素剝奪治療無進(jìn)展生存期相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集2009年9月～2014年7月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科經(jīng)前列腺穿刺活檢病理確診的PCa病例115 例，所有病例在病理確診后均采用聯(lián)合去勢(shì)治療與抗雄激素藥物的全雄阻斷治療，并定期檢測血清睪酮水平，將血清睪酮水平維持于50 ng/mL水平以下。復(fù)習(xí)病歷資料，獲取前列腺癌患者的各項(xiàng)臨床參數(shù)，包括確診時(shí)年齡、血清總PSA水平，直腸指檢情況，盆腔CT/MRI、核素全身骨掃描、全胸片等。Gleason評(píng)分系統(tǒng)確定腫瘤病理分級(jí)，臨床分期采用2002年AJCC的TNM分期系統(tǒng)。

具體隨訪方案：內(nèi)分泌治療開始后每3月來院復(fù)診或住院復(fù)查，檢測血清PSA、睪酮水平，半年到1年行1次全身骨掃描，隨訪明確血清總PSA進(jìn)展、血清睪酮水平、腫瘤影像學(xué)進(jìn)展情況。隨訪時(shí)間截止至2015年8月1日。以血清總PSA連續(xù)2次升高為觀察終點(diǎn)。

1.2 試劑與方法 鼠抗人Nanog單克隆抗體購自Proteintech公司。免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。所有病例的病理切片重新閱片證實(shí)前列腺腺癌。前列腺癌穿刺石蠟標(biāo)本連續(xù)4 μm厚切片，采用EnVision染色方法，分別檢測癌組織中Nanog蛋白的表達(dá)情況，具體流程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。已知陽性組織切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判讀 由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立雙盲閱片判斷，每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，Nanog染色以癌細(xì)胞胞核呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，如陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)>10%為高表達(dá)，否則為低表達(dá)[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)分析Nanog蛋白表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)性，Log-rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分別進(jìn)行單因素和多因素分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1本組病例的臨床病理特征以及Nanog蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)情況 本組患者的臨床病理特征見表1?；颊咔傲邢侔┙M織中Nanog蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性分析結(jié)果提示Nanog蛋白表達(dá)僅與治療前PSA指標(biāo)存在相關(guān)性(P=0.027，表2)。Nanog蛋白染色主要位于癌細(xì)胞胞核(圖1)。

2.2 雄激素剝奪治療后腫瘤進(jìn)展情況 本研究中內(nèi)分泌治療后無進(jìn)展生存期定義為從內(nèi)分泌治療開始到血清總PSA連續(xù)2次升高的時(shí)間?；仡櫺噪S訪發(fā)現(xiàn)，本組病例中位無進(jìn)展生存期24個(gè)月(12～88個(gè)月)，115例中38例(33.0%)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。

圖1 前列腺癌穿刺組織中Nanog基因的蛋白表達(dá)(Elivision,×200)

A：Gleason評(píng)分=9分、Nanog蛋白低表達(dá)；B：Gleason評(píng)分=7、Nanog蛋白高表達(dá)。

表1 本組病例臨床病理特征

臨床病理因素例數(shù)百分率(%)本組病例數(shù)115年齡(歲) ≤705446．9 >706153．1臨床分期 T1～2N0M054．4 T3～4N0M04236．5 T1～4N+/M+6859．1Gleason評(píng)分 ≤687．0 75446．9 8～105346．1治療前PSA(ng/mL) <2076．1 20～503530．4 >507363．5

2.3 臨床病理因素聯(lián)合Nanog蛋白的單因素、多因素生存分析 首先進(jìn)行單因素的生存分析，分別將臨床分期、年齡、Gleason評(píng)分、治療前血清PSA值以及Nanog蛋白表達(dá)逐個(gè)行Kaplan-Meier單因素生存分析，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)確定雄激素剝奪治療后進(jìn)展的影響因素包括臨床分期、年齡、治療前血清PSA值以及Nanog蛋白表達(dá)(表3)。然后對(duì)這些影響因素行代入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型行多因素生存分析，最終確定Nanog蛋白表達(dá)是雄激素剝奪治療后進(jìn)展速度的獨(dú)立影響因素(表4)。由此可見，蛋白Nanog高表達(dá)是雄激素剝奪治療后疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖2)。

表2 Nanog蛋白表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性分析

臨床病理因素例數(shù)Nanog蛋白[例(%)]低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值年齡(歲) ≤705419(35．2)35(64．8)0．6650．415 >706126(42．6)35(57．4)臨床分期 TXN0M04719(40．4)28(59．6)0．0560．813 TXN+/M+6826(38．2)42(61．8)Gleason評(píng)分 ≤76225(40．3)37(59．7)0．0800．777 ≥85320(37．7)33(62．3)PSA(ng/mL) ≤504222(52．4)20(47．6)4．8770．027 >507323(31．5)50(68．5)

表3 臨床病理因素聯(lián)合Nanog蛋白表達(dá)的單因素分析

相關(guān)影響因素例數(shù)(隨訪中病情進(jìn)展例數(shù))P值年齡(歲) ≤7054(23)0．033 >7061(15)臨床分期 TxN0M047(11)0．018 TxN+/M+68(27)Gleason評(píng)分 ≤762(23)0．971 ≥853(15)血清PSA(ng/mL) <5042(10)0．029 ≥5073(28)Nanog 低表達(dá)45(11)0．016 高表達(dá)70(27)

表4 影響前列腺癌雄激素剝奪治療進(jìn)展的臨床病理因素多因素分析

因素回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤Wald值自由度P值OR值95%CI年齡-0．5490．3382．64710．1040．5770．298～1．119血清PSA0．3190．4300．55310．4571．3760．593～3．194臨床分期0．6260．4142．28710．1301．8700．831～4．208Nanog0．7720．3814．10210．0432．1641．025～4．566

Wald值:卡方值；95%CI：95%可信區(qū)間。

圖2 不同Nanog蛋白表達(dá)的雄激素剝奪治療后無進(jìn)展生存曲線

(P=0.016，Log-rank檢驗(yàn))

3 討 論

目前雄激素剝奪治療仍被認(rèn)為是晚期前列腺癌最為有效的治療手段。然而，經(jīng)過一段時(shí)間的治療，大多數(shù)患者最終發(fā)展成激素非依賴性前列腺癌。眾所周知, 在激素非依賴性轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究中，雄激素受體活化的相關(guān)機(jī)制的研究最為深入。但是最新研究表明, 癌干細(xì)胞有可能促進(jìn)激素非依賴性前列腺癌的進(jìn)展[5,8]。來自小鼠閹割模型的研究發(fā)現(xiàn), 小鼠體內(nèi)雄激素被剝奪處理能導(dǎo)致約90%前列腺上皮細(xì)胞的凋亡, 而基底細(xì)胞層則未受影響，前列腺干細(xì)胞證實(shí)位于基底細(xì)胞層。雄激素的補(bǔ)充能誘導(dǎo)這些多能干細(xì)胞的增殖并分化成基底細(xì)胞和管腔上皮細(xì)胞而重新形成前列腺結(jié)構(gòu)。

在腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域，越來越多的干細(xì)胞相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。早期的研究發(fā)現(xiàn)，Nanog 基因是一種核轉(zhuǎn)錄因子，與Oct4和Sox2共同維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能性。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)Nanog基因在包括前列腺癌在內(nèi)的眾多腫瘤組織中存在異常表達(dá)[9]。據(jù)報(bào)道，Nanog在良性前列腺增生組織和前列腺癌根治標(biāo)本的蛋白表達(dá)高于正常的前列腺上皮組織，而且Nanog在前列腺增生組織和前列腺癌組織中表達(dá)類似，它提示Nanog的異常調(diào)控可能是前列腺癌發(fā)生的起始步驟[10]。Nanog在CD133+和CD133+/CD44+的干細(xì)胞群中表達(dá)明顯高于CD133-或CD144-的癌細(xì)胞[11]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Nanog基因敲除可以導(dǎo)致前列腺癌組織的消退，相反，過表達(dá)Nanog基因可以導(dǎo)致雄激素剝脫的小鼠腫瘤生長加速，提示Nanog基因在去勢(shì)抵抗的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[6]。因此，在預(yù)測前列腺癌患者雄激素剝奪治療后進(jìn)展速度的研究中，我們選擇了Nanog基因作為我們的研究對(duì)象。

本研究分析了Nanog蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nanog蛋白表達(dá)高低僅與治療前PSA 水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，而未發(fā)現(xiàn)與年齡、臨床分期、Gleason評(píng)分相關(guān)性。與此不同，孫向東等采用組織芯片研究非小細(xì)胞肺癌中Nanog基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nanog的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床分期、分化程度密切相關(guān)[12]。這提示Nanog基因在不同腫瘤中的調(diào)控作用具有組織特異性。繼而本研究通過單因素和多因素的生存期分析最終確定腫瘤中的Nanog基因表達(dá)對(duì)腫瘤的預(yù)后產(chǎn)生獨(dú)立影響，即Nanog高表達(dá)的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)展更快，預(yù)后更差。NAGATA等[13]通過組織芯片聯(lián)合免疫組化也獲得類似的結(jié)果，即在乳腺癌患者中Nanog基因高表達(dá)提示著患者更差的預(yù)后。本研究病例數(shù)有限，隨訪時(shí)間較短，還需大樣本的長期研究進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中有少數(shù)標(biāo)本Nanog表達(dá)完全陰性，這可能與標(biāo)本的保存、染色方法等因素有關(guān)，也可能由于部分癌組織中癌干細(xì)胞數(shù)量和比例少，因而不表達(dá)或弱表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog，具體原因還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究收集PCa患者的臨床病理因素聯(lián)合免疫組化檢測治療前癌組織中Nanog蛋白的表達(dá)水平，考察它們與雄激素剝奪治療后進(jìn)展速度的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)臨床分期、Nanog蛋白表達(dá)能在一定程度上預(yù)測雄激素剝奪治療后PCa進(jìn)展速度。鑒于Nanog基因在腫瘤干細(xì)胞調(diào)控中的重要作用，推測其有望成為今后針對(duì)激素抵抗性前列腺癌的新的治療靶點(diǎn)。

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(編輯 王瑋)

Expression of Nanog in prostate cancer and its value in predicting the progression-free survival of patients after androgen deprivation therapy

GUAN Yang-bo1, NONG Shao-jun1, ZHANG Yue-ping1, LIU Yi-fei2

(1.Department of Urology; 2.Department of Pathology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, China)

Objective To evaluate the expression of Nanog in prostate cancer (PCa) and its value in predicting the progression-free survival time of patients after androgen deprivation therapy (ADT). Methods The clinicopathological data of 115 PCa cases receiving ADT treated during Sep. 2009 and July 2014 in our hospital were retrospectively analyzed. The Nanog expression in paraffin-embeded tissue was detected with immunohistochemical EnVision method. The association between Nanog expression and clinicopathologic factors was evaluated withχ2test orFishexact test. The correlation between clinicopathologic factors and Nanog expression was analyzed with univariate and multivariate Cox proportional hazard model. Results Nanog expression significantly correlated with pretreatment serum PSA level. Univariate and multivariate analysis revealed that Nanog expression was independently associated with PSA progression after ADT. Conclusion Nanog serves as an independent prognostic factor for PCa patients receiving ADT.

Nanog; prostatic carcinoma; androgen deprivation therapy; predictive value; survival analysis

2016-01-27

2016-03-28

劉益飛，副主任醫(yī)師.E-mail：18912888908@163.com

管楊波(1981-)，男(漢族)，博士研究生在讀，主治醫(yī)師，講師.研究方向：泌尿男性生殖系統(tǒng)腫瘤. E-mail：guanyangbo123@163.com

時(shí)間：2016-04-12

R737.25

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.06.007

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1374.R.20160412.1448.002.html