劉拉平 劉朝霞 武 瑜 張曉榮 李愛(ài)華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)測(cè)試中心 農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(楊凌)，楊凌 712100)

SPE-HPLC-MS/MS測(cè)定糧食中玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

劉拉平 劉朝霞 武 瑜 張曉榮 李愛(ài)華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)測(cè)試中心 農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(楊凌)，楊凌 712100)

建立了以乙腈-水(84∶16,v/v)為提取溶劑、正己烷萃取和HLB固相萃取(SPE)凈化、水和乙腈C18反相色譜梯度洗脫、電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)同時(shí)測(cè)定糧食中玉米赤霉烯酮(ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)2種物質(zhì)含量的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法。結(jié)果表明， ZEN和DON檢出限(以信噪比S/N=3計(jì))依次為0.1 μg/kg 和2 μg/kg，定量限(以信噪比S/N=10計(jì))依次為0.3 μg/kg 和6 μg/kg；兩者線性范圍分別為0.20～25 μg/L(相關(guān)系數(shù)r=1.000 0)和4.0～500 μg/L (相關(guān)系數(shù)r=0.999 9)；不同樣品2種目標(biāo)物3個(gè)水平的加標(biāo)回收率在88.7%～102.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.4%～7.3%之間。應(yīng)用該方法對(duì)所檢小麥樣品進(jìn)行分析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重污染樣品的2種目標(biāo)毒素。

SPE HPLC-MS/MS 玉米赤霉烯酮(ZEN) 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON) 糧食

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)均為鐮刀菌所產(chǎn)生的真菌毒素，普遍存在于霉變的玉米、高梁、小麥等糧谷類作物中，人和動(dòng)物誤食被該類毒素污染的糧谷類食物或其加工產(chǎn)品可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)[1-4]。很多國(guó)家都制定了糧谷類產(chǎn)品中ZEN和DON的限量標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷物及其制品中ZEN及DON的限量指標(biāo)為60、1 000 μg/kg[7]。

目前，糧谷中ZEN和DON的測(cè)定方法主要有薄層色譜法和酶聯(lián)免疫法[8]、免疫親和柱凈化-熒光計(jì)法和液相色譜法[9-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]，相關(guān)文獻(xiàn)資料還有氣相色譜法[13-14]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]。薄層色譜法以及酶聯(lián)免疫法為早期標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試方法，存在靈敏度低以及假陽(yáng)性干擾等方法缺陷，目前應(yīng)用較少。氣相色譜法及其質(zhì)譜聯(lián)用方法涉及目標(biāo)物質(zhì)的衍生化處理，方法的穩(wěn)定性較差，標(biāo)準(zhǔn)方法中很少采用。免疫親和柱凈化-熒光計(jì)法和液相色譜法采用特異性強(qiáng)的免疫親和層析柱進(jìn)行樣品處理，樣品凈化效果好，方法靈敏度及準(zhǔn)確度高，但該類方法所用免疫親和柱耗材價(jià)格高昂，況且一次只能做一種真菌毒素，難以廣泛應(yīng)用。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為近幾年所采用的真菌毒素測(cè)定新方法，該方法具有很強(qiáng)的目標(biāo)物質(zhì)選擇性和很高的靈敏度，樣品處理要求相對(duì)較低，一般采用常規(guī)方法的樣品前處理即可滿足要求；但目前沒(méi)有ZEN和DON同時(shí)測(cè)定的試驗(yàn)方法。固相萃取(SPE)技術(shù)為樣品凈化、富集最常用手段，在藥物殘留分析中應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)采用SPE凈化并結(jié)合溶劑萃取凈化，通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分離檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)糧食中ZEN和DON 2種真菌毒素的同時(shí)分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AD 液相色譜儀：日本島津公司；API4000 Q-TRAP質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司；V8漩渦混勻器：美國(guó)安勝公司。

ZEN、DON(標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%)：以色列FERMENTEK公司；美國(guó)Tedia公司；Oasis HLB(60 mg/3 mL)固相萃取柱。

1.2 樣品及制備

選用小麥、玉米、蕎麥、谷子樣品(本實(shí)驗(yàn)室送檢樣品)，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)磨細(xì)并通過(guò)18目篩，樣品瓶分裝待用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取ZEN及DON各10 mg至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的儲(chǔ)備液，置-18 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5 mL于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，得質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL的標(biāo)注工作液，置-18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取以上ZEN和DON標(biāo)準(zhǔn)工作液分別為0.25、5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，得質(zhì)量濃度依次為50、1000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液或樣品基質(zhì)溶液逐步稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、5、10、25 μg/L(ZEN)和4、20、100、200、500 μg/L(DON)的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，備用。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取(2.5±0.01) g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈/水(84∶16)，渦旋2 min，超聲提取30 min，中間振搖2～3次；取出離心管，8 000r/min離心5 min，取5 mL上清液于10 mL離心管中，加入3 mL正己烷(乙腈飽和)振搖、靜置分層，去除正己烷層；下清液于45 ℃氮?dú)獯蹈?，加?.5 mL甲醇溶解，補(bǔ)加4.5 mL水稀釋；過(guò)Oasis HLB柱(3 mL甲醇和3 mL水預(yù)先活化)，經(jīng)5 mL水淋洗后，用2.5 mL甲醇洗脫，洗脫液加2.5 mL水稀釋，0.45 μm膜過(guò)濾后，LC-MS/MS測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS 75 mm×3.0 mm，2.2 μm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A相為水，B相為乙腈；梯度洗脫程序0～8 min，B相從10%升至95%，保持2 min，10～12 min回至初始比例保持5 min；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負(fù)離子掃描；電噴霧電壓(IS)：-4 500 V；氣簾氣(CUR)壓 力: 138 kPa (20 Psi)；霧 化 氣(GS1)壓力: 345 kPa(50 Psi)；輔助氣(GS2)壓力:345 kPa (50 Psi)；離子源溫度(TEM)：500 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。ZEN母離子為m/z317.1，子離子為m/z273.0/186.9/174.9，其中317.1>174.9為定量離子對(duì)；去簇電壓(DP)：-80 V；碰撞能量(CE)：-27.5V/-35.0V/-34.0V。DON母離子為m/z295.1，子離子為m/z264.9/246.9/137.8，其中295.1>264.9為定量離子對(duì)；去簇電壓(DP)：-80V；碰撞能量(CE)：-16.5 V/-17.0 V/-23.0 V。碰撞室入口電壓(EP)：-10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：-15 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在流動(dòng)注射狀態(tài)下，用200 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在正離子和負(fù)離子2種模式下進(jìn)行全掃描,結(jié)果表明2個(gè)化合物均在負(fù)離子狀態(tài)下具有更高的響應(yīng)值；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液酸化以增強(qiáng)正離子信號(hào)和堿化進(jìn)行負(fù)離子掃描再次確認(rèn)負(fù)離子響應(yīng)的顯著性。進(jìn)一步對(duì)2個(gè)化合物[M-H]-母離子進(jìn)行子離子掃描，并對(duì)錐孔電壓、去族電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。最終，2個(gè)化合物均選擇豐度較高、干擾較小的3對(duì)離子進(jìn)行MRM監(jiān)測(cè)，其中豐度最高的離子作為定量離子。結(jié)合液相色譜條件，最后修正完成質(zhì)譜分析的所有參數(shù)(見(jiàn)1.5.2)。

2.2 色譜條件優(yōu)化

在LC-MS/MS分析中，色譜條件的選擇既要考慮色譜分離的效果，又要兼顧待測(cè)組分的離子化效率。本試驗(yàn)在反相C18色譜和電噴霧負(fù)離子模式下，參照1.5.1梯度洗脫程序，考察了甲醇、乙腈2種不同的有機(jī)相配合3種不同水相(純水、10 mmol/L乙酸銨和0.03%氨水)作為流動(dòng)相的色譜行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲醇、乙腈作為有機(jī)相，其目標(biāo)物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度甲醇較乙腈稍有增加，但乙腈作為流動(dòng)相具有較小的保留時(shí)間、更好的峰形，甲醇為有機(jī)相則分析時(shí)間延長(zhǎng)，峰形拖尾擴(kuò)展；而采用3種不同水相時(shí)，DON目標(biāo)峰保留時(shí)間均一樣，ZEN目標(biāo)峰純水與乙酸銨時(shí)間一致，氨水體系保留值則縮短，3種體系目標(biāo)物信號(hào)強(qiáng)度以純水體系為最優(yōu)(見(jiàn)圖1)。綜合考慮目標(biāo)物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度及色譜分離度，選擇乙腈和純水作為流動(dòng)相組合。

圖1 不同流動(dòng)相組成ZEN和DON總離子流圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件選擇與優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑選擇

ZEN可溶于堿性水溶液或乙醚、苯等非極性溶劑，DON易溶于水、甲醇等極性溶劑，2種化合物的性質(zhì)有較大差異?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)資料中ZEN的提取大多用乙腈+水(9+1)[12-13,17]、乙腈+水(84+46)[18-19]溶液，主要以有機(jī)相乙腈為主；DON的提取則多用水[10,20]、緩沖液和甲醇[14]、水+乙腈[21-22]等溶液，側(cè)重于水提為主?？紤]到DON在乙腈中也有很好的溶解度以及采用高有機(jī)相提取溶劑可顯著減少糧食類樣品中高含量水溶性大分子干擾物質(zhì)，本試驗(yàn)直接選擇乙腈+水(84+46)為提取溶劑進(jìn)行研究，該提取溶劑對(duì)2種目標(biāo)物質(zhì)均有較好的提取效果，方法回收率高、重現(xiàn)性好。

2.3.2 凈化條件優(yōu)化

參照飼料中ZEN測(cè)定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[18]和出口食品中DON測(cè)定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[21]，對(duì)樣品提取溶液采用正己烷脫脂初步凈化；而后初步凈化樣品過(guò)Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)一步凈化[21-22]。考慮到2種目標(biāo)物質(zhì)的極性不同，文獻(xiàn)所述DON測(cè)定過(guò)萃取柱前樣品用水溶解可能不能完全溶解ZEN[21-22]，利用水+甲醇混合溶液并增加甲醇比例有助于ZEN的溶解，但該溶液甲醇比例過(guò)高又會(huì)降低目標(biāo)物在固相萃取柱上的保留。2種目標(biāo)物溶解性及HLB固相萃取柱目標(biāo)物保留特性的研究：取0.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3份，氮吹儀吹干，分別用純水、水+甲醇(10+90)、水+甲醇(20+80)3種不同溶液均5 mL超聲溶解，按1.4固相萃取步驟過(guò)柱凈化；收集過(guò)柱樣品溶液、水淋洗液、甲醇洗脫液(加2.5 mL水稀釋)，過(guò)濾，測(cè)定。結(jié)果表明，純水、水+甲醇(10+90)2種溶劑均能溶解目標(biāo)組分并具有較好的萃取柱保留特性，2種目標(biāo)物均集中出現(xiàn)在甲醇洗脫部分；水+甲醇(20+80)體系過(guò)柱，第一個(gè)組分DON隨過(guò)柱樣品即有部分流出(總量1/3左右)，萃取柱保留特性較差。選用水+甲醇(10+90)體系進(jìn)一步做加標(biāo)試驗(yàn)表明，由于提取樣品中雜質(zhì)成分的影響，脂溶性組分ZEN在樣品吹干后溶解環(huán)節(jié)效果欠佳，致使該組分回收率偏低，故本環(huán)節(jié)最終優(yōu)化為樣品吹干后用0.5 mL甲醇溶解，然后加水4.5 mL稀釋至水和甲醇比例為10∶90。

采用本凈化方法，處理蕎麥、谷子、玉米3份空白基質(zhì)樣品，采用基質(zhì)加標(biāo)(ZEN 2.5 μg/kg, DON 50 μg/kg)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同樣品基質(zhì)ZEN抑制率為6.0%～53.0%，DON為2.8%～26.3%(見(jiàn)表1)，2種目標(biāo)物及不同樣品基質(zhì)效應(yīng)均比較低，樣品凈化的效果較好。但比較而言，蕎麥和谷子樣品的基質(zhì)效應(yīng)更低，而玉米樣品基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較高，這可能與樣品中脂肪含量較高有關(guān)。由于不同樣品的差異，考慮基質(zhì)效應(yīng)，采用空白樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行實(shí)際樣品的分析。

表1 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

注：基質(zhì)效應(yīng)=(基質(zhì)加標(biāo)峰面積-溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積×100%。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量限

測(cè)定1.3節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，繪制方法標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用空白樣品加標(biāo)(ZEN 1.0 μg/kg、DON 20 μg/kg)，按色譜峰S/N≥3計(jì)算方法檢出限、色譜峰S/N≥10計(jì)算方法定量限。ZEN在0.2～25 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=5.1×104X+346(r=1.000 0)，檢出限、定量限依次為0.1、0.3 μg/kg；DON在4～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=3.02×103X-738(r=0.999 9)，檢出限、定量限依次為2、6 μg/kg。2種目標(biāo)物質(zhì)的檢出限、定量限均優(yōu)于我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。

2.4.2 方法回收率和精密度

選用蕎麥、谷子、玉米3個(gè)空白樣品，按ZEN/DON添加濃度1.0/20、5.0/100、25/500 μg/kg 3個(gè)水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)(依次編號(hào)為水平1、2、3)，每個(gè)水平3次重復(fù)。結(jié)果表明，ZEN平均回收率為88.7%～96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.2%～7.3%；DON平均回收率為90.7%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%～4.0%(見(jiàn)表2)。方法的準(zhǔn)確度及精密度均達(dá)到現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)及殘留分析要求。

表2 不同水平加標(biāo)試驗(yàn)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.5 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的14個(gè)小麥、3個(gè)玉米、4個(gè)蕎麥、6個(gè)谷子(小米)共計(jì)27個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，其中小麥樣品均檢出ZEN(27.5～66.7 μg/kg)和DON(625～3545 μg/kg)，2種毒素檢出率均為100%，超標(biāo)率依次為14.3%、92.8%；玉米樣品中檢出1個(gè)ZEN(0.36 μg/kg)、2個(gè)DON(9.1、21.2 μg/kg)，檢出率為33.3%、66.7%；蕎麥樣品檢出1個(gè)ZEN(2.4 μg/kg)、2個(gè)DON(7.6、16.2 μg/kg)，檢出率依次為25.0%、50.0%；谷子樣品2種物質(zhì)均未檢出；以上玉米、蕎麥、谷子樣品2種毒素物質(zhì)含量均未超標(biāo)。我國(guó)多數(shù)地區(qū)氣候濕潤(rùn)，小麥、玉米等極易受到霉菌污染，其中ZEN和DON的污染水平比較嚴(yán)重。資料表明，小麥、玉米樣品中ZEN含量高達(dá)737 μg/kg，檢出率范圍在5.9%～100%；DON含量高達(dá)3737 μg/kg，檢出率范圍在47.6%～100%[23]。本試驗(yàn)中小麥、玉米2種毒素檢出率與文獻(xiàn)基本一致，但小麥DON的含量及超標(biāo)率偏高，玉米中2種毒素含量與超標(biāo)率偏低，這可能與樣品的來(lái)源(同批樣品)與樣品作物本生長(zhǎng)期病害發(fā)生的狀況有關(guān)。

3 結(jié)論

本方法采用溶劑萃凈化和固相萃取凈化替代現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中常用的免疫親和柱及多功能凈化柱凈化方式進(jìn)行樣品前處理，通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行含量測(cè)定，實(shí)現(xiàn)糧食類產(chǎn)品中ZEN和DON 2種真菌毒素的同時(shí)、快速分析。

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[22]黃娟，陳國(guó)松，張曉燕，等. 固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)糧食及其制品中的嘔吐毒素.色譜，2012,30(11)：1203-1207

[23]熊凱華，胡威，汪孟娟，等. 安徽河南糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的污染調(diào)查[J].食品科學(xué)，2008,30(20)：265-268.

Determination of Zearalenone and Deoxynivalenol in Cereal Grains by SPE-HPLC-MS/MS

Liu Laping Liu Zhaoxia Wu Yu Zhang Xiaorong Li Aihua

(Testing Center, Northwest A&F University, Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture (Yangling), Yangling 712100)

A method of SPE-HPLC-MS/MS was established for the content determination of ZEN and DON in cereal grains. The sample was extracted by acetonitrile-water (84∶16, v/v), and then purified by the methods of solvent extraction and HLB solid phase extraction (SPE). The chromatographic separation was performed on C18 column with gradient elution using acetonitrile and water as mobile phases, and the mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring (MRM) in electrospray negative ionization mode. The limits of detection (LOD, S/N=3) about ZEN and DON were 0.1 μg/kg and 2 μg/kg respectively, and the limits of quantification (LOQ, S/N=10) 0.3 μg/kg and 6 μg/kg respectively, and the ranges of linearity 0.20～25 μg/L(r=1.000 0) and 4.0～500 μg/L (r=0.999 9) respectively. The recoveries in different samples at three spiked concentration levels ranged from 88.7 % to 102.3 % with the relative standard deviations from 2.4 % to 7.3%.

SPE, HPLC-MS/MS, zearalenone (ZEN), deoxynivalenol (DON), cereal grains

O658

A

1003-0174(2016)04-0142-05

2014-08-02

劉拉平，男，1971年出生，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，農(nóng)產(chǎn)品、食品質(zhì)量安全檢測(cè)