徐貴華 劉東紅 趙瑞香 陳健初 王 俊 葉興乾

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院1，新鄉(xiāng) 453003)(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院2，杭州 310058)

抗氧化劑對(duì)膽固醇高溫氧化抑制作用研究

徐貴華1，2劉東紅2趙瑞香1陳健初2王 俊2葉興乾2

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院1，新鄉(xiāng) 453003)(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院2，杭州 310058)

探討了11種抗氧化劑對(duì)膽固醇在空氣和豬油中高溫氧化的抑制作用以及對(duì)豬油過(guò)氧化值的影響。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)高溫氧化前后膽固醇含量變化，同步檢測(cè)5種主要高溫氧化產(chǎn)物(7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5,6β-環(huán)氧基膽固醇、5,6α-環(huán)氧基膽固醇、7-酮基膽固醇)。結(jié)果表明：多種抗氧化劑對(duì)膽固醇在空氣中的高溫氧化可以起到明顯的抑制作用，以蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸效果最好。膽固醇在豬油中氧化程度較弱，11種抗氧化劑中只有咖啡酸表現(xiàn)出較好的抑制作用。過(guò)氧化值的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)：咖啡酸、橙皮素、柚皮素、維生素E、BHT均有一定的降低過(guò)氧化值作用，其中以咖啡酸效果最佳。不同抗氧化劑對(duì)空氣中膽固醇高溫氧化的抑制有很大不同，從而有助于篩選具有較強(qiáng)高溫抗氧化能力的抗氧化劑。咖啡酸的高溫抗氧化能力值得關(guān)注。

抗氧化劑 膽固醇 高溫氧化 豬油 氣相色譜

膽固醇廣泛存在于動(dòng)物源食品中，其在劇烈的加工條件下及不當(dāng)貯藏時(shí)會(huì)發(fā)生復(fù)雜的氧化反應(yīng)，生成一系列膽固醇氧化產(chǎn)物，如羥基膽固醇、環(huán)氧基膽固醇、酮基膽固醇等，研究證實(shí)，這些氧化產(chǎn)物對(duì)人體的危害比膽固醇更大[1]。對(duì)于油脂含量較高的食品，人們通常比較重視油脂的氧化酸敗。針對(duì)這方面的研究指標(biāo)有很多，如酸價(jià)、羰基價(jià)、丙二醛、過(guò)氧化值等。這些指標(biāo)有助于從宏觀上反映油脂的氧化酸敗程度，但無(wú)法從微觀角度詳細(xì)描述油脂氧化情況。目前對(duì)油脂氧化酸敗的研究已很多，但對(duì)其中膽固醇氧化反應(yīng)研究較少，缺乏油脂中膽固醇氧化與氧化酸敗關(guān)系的報(bào)導(dǎo)。國(guó)外對(duì)食品中膽固醇氧化方面的研究較多，試驗(yàn)對(duì)象通常是膽固醇含量較高的動(dòng)物性油脂[2- 3]、肉制品[4]、乳制品[5]、水制品[6-7]、蛋制品[8-9]等，國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域報(bào)導(dǎo)還較少[10-11]。本研究檢測(cè)了膽固醇氧化產(chǎn)物中含量較高的5種： 7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5,6β-環(huán)氧基膽固醇、5,6α-環(huán)氧基膽固醇、7-酮基膽固醇。為了探討抗氧化劑對(duì)油脂氧化酸敗和膽固醇高溫氧化的影響，選擇了9種天然酚類物質(zhì)，包括6種黃酮：蘆丁、槲皮素(前者是后者的糖苷形式)、橙皮苷、橙皮素(前者是后者的糖苷形式)、柚皮苷、柚皮素(前者是后者的糖苷形式)；3種酚酸：咖啡酸、阿魏酸(前者是后者的酯化形式)、綠原酸；2種常用抗氧化劑，即維生素E(α-生育酚)和BHT(丁基化羥基甲苯)，研究膽固醇在空氣和豬油中的高溫氧化特性及5種抗氧化劑在抑制其高溫氧化產(chǎn)物生成時(shí)的表現(xiàn)，并探討豬油過(guò)氧化值變化。本研究有助于從微觀上解釋膽固醇高溫氧化特性，對(duì)篩選天然油脂抗氧化劑有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

膽固醇(cholesterol)、7α-羥基膽固醇(7α-hydroxycholesterol)、7β-羥基膽固醇(7β-hydroxycholesterol)、5,6β-環(huán)氧基膽固醇(5,6β-epoxycholesterol)、5,6α-環(huán)氧基膽固醇(5,6α-epoxycholesterol)、7-酮基膽固醇(7-ketocholesterol)、5α-膽甾醇(5α-cholestane)、三甲基硅烷基試劑(trimethylsilyl (TMS) reagent)、蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、BHT、維生素E(Vitamin E, α-tocopherol)、綠原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、橙皮苷(hesperidin)、橙皮素(hesperitin)、柚皮苷(naringin)、柚皮素(naringinin)：美國(guó)Sigma公司;豬油:市售。其他試劑為分析純。

1.2 抗氧化劑對(duì)空氣中膽固醇高溫氧化的影響

1.3 抗氧化劑對(duì)豬油中膽固醇高溫氧化的影響

將豬油溶于正己烷，使其濃度為10%。再將膽固醇加入并充分溶解混勻，使膽固醇的濃度為0.1%(即豬油中膽固醇含量為1%)。取400L上述溶液于試管中，加入8g的抗氧化劑(事先用甲醇配制成100g/mL的溶液待用)，相當(dāng)于豬油中抗氧化劑的加入量為200 mg/kg。先用氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑，然后放入烘箱中于160 ℃下加熱1 h。冷卻至室溫，加入80g的5α-膽甾醇作為內(nèi)標(biāo)，用2 mol/L的KOH乙醇溶液進(jìn)行冷皂化并過(guò)夜，然后用正己烷對(duì)未皂化部分進(jìn)行提取，再用氮?dú)鈱⒄和榇蹈桑尤隩MS三甲基硅烷基試劑于60 ℃下進(jìn)行衍生化反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后用氮?dú)獯蹈?，然后用正己烷溶解定容，過(guò)0.22m有機(jī)濾膜后，取1L進(jìn)入GC-MS檢測(cè)。

1.4 氣質(zhì)聯(lián)用色譜條件

采用安捷倫7890A氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀對(duì)膽固醇及其氧化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：彈性石英毛細(xì)管柱(SACTM-5, 30 m×0.25 mm, i.d.; Supelco, Inc., Bellefonte, PA, USA)，氦氣流速為1.5 mL/min，柱溫以30 ℃/min的速度從80 ℃升至270 ℃，然后保持22 min，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均保持在280 ℃。

1.5 過(guò)氧化值的測(cè)定

采用GB/T 5009.37—2003中的第2法比色法測(cè)定油脂氧化的過(guò)氧化值。過(guò)氧化值單位為mmol/kg。

1.6 定性和定量分析

膽固醇及其氧化產(chǎn)物的定性方法采用保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)和質(zhì)譜庫(kù)檢索方法。定量分析采用內(nèi)標(biāo)法，依據(jù)總離子流圖峰面積進(jìn)行計(jì)算。所有樣品均作3次平行，測(cè)定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化劑對(duì)空氣中膽固醇高溫氧化的影響

采用GC-MS檢測(cè)分析了膽固醇及其5種主要氧化產(chǎn)物：7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、5,6β-環(huán)氧基膽固醇、5,6α-環(huán)氧基膽固醇、7-酮基膽固醇，結(jié)果如表1、表2所示。表1顯示了11種抗氧化劑對(duì)膽固醇在空氣中氧化的抑制作用，以未氧化膽固醇的量(越高抗氧化效果越好)與膽固醇氧化產(chǎn)物的量(越低抗氧化效果越好)來(lái)表示抗氧化效果。160 ℃下加熱1 h，未氧化膽固醇剩余量為24.13%，膽固醇氧化產(chǎn)物(5種氧化產(chǎn)物合計(jì)值)為10.64%，5種膽固醇主要氧化產(chǎn)物中以7-酮基膽固醇含量最高。通過(guò)添加相當(dāng)于2%膽固醇量的抗氧化劑，膽固醇的氧化受到不同程度的抑制。蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸效果最好，可以完全抑制膽固醇氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)膽固醇的量也基本保持不變。相比之下，工業(yè)中常用的抗氧化劑BHT幾乎未起到抑制膽固醇氧化的作用。維生素E的效果與阿魏酸相當(dāng)，但作用明顯不如上述4種酚類物質(zhì)。另外，橙皮素和柚皮素對(duì)膽固醇氧化有較弱的抑制作用，但它們的糖苷化形式(橙皮苷和柚皮苷)則完全不能抑制膽固醇的氧化。綜合表1的結(jié)果，對(duì)11種抗氧化劑抑制膽固醇高溫氧化作用的排序： 蘆丁≈槲皮素≈綠原酸≈咖啡酸>阿魏酸≈維生素E>柚皮素≈橙皮素>柚皮苷≈橙皮苷≈BHT。

表1 抗氧化劑對(duì)空氣中膽固醇高溫氧化的抑制作用(%,160 ℃下加熱1 h)

注：“-”表示未檢測(cè)到或低于檢測(cè)限，余同。

表2 抗氧化劑對(duì)豬油中膽固醇高溫氧化的抑制作用(%,160 ℃下加熱1 h)

通過(guò)研究抗氧化劑對(duì)膽固醇高溫氧化的抑制作用，可以在一定程度上反映抗氧化劑的高溫抗氧化能力，從而區(qū)別于常見(jiàn)的還原力、FRAP抗氧化能力、ORAC抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力等一系列在常溫條件下測(cè)定抗氧化能力的方法。

2.2 抗氧化劑對(duì)豬油中膽固醇高溫氧化的影響

膽固醇在豬油中的氧化特點(diǎn)及所選11種抗氧化劑在此條件下的表現(xiàn)情況如表2所示。在160 ℃下加熱1 h，未氧化膽固醇剩余量為63.00%，膽固醇氧化產(chǎn)物(5種氧化產(chǎn)物合計(jì)值)為1.11%。與在空氣中相比，膽固醇在豬油中氧化速度明顯較慢，生成的膽固醇氧化產(chǎn)物亦較少[12]。相當(dāng)于200 mg/kg豬油量的抗氧化劑添加量，未能起到類似空氣中膽固醇氧化的抑制效果，說(shuō)明這些抗氧化劑在豬油中的抗氧化活性不如空氣中。11種抗氧化劑中只有咖啡酸對(duì)豬油中膽固醇的高溫氧化起到顯著的抑制效果，其他抗氧化劑抑制效果均不明顯(包括對(duì)空氣中膽固醇高溫抗氧化效果良好的蘆丁、槲皮素、綠原酸)。這表明膽固醇氧化與所在介質(zhì)有很大關(guān)系，而抗氧化劑在不同介質(zhì)條件下的作用效果差別也很大。研究認(rèn)為豬油中取得的結(jié)果更接近于食品中膽固醇高溫氧化的真實(shí)情況，因此，又對(duì)照研究了抗氧化劑對(duì)豬油過(guò)氧化值的影響。

2.3 抗氧化劑對(duì)豬油高溫加熱時(shí)過(guò)氧化值的影響

測(cè)定了160 ℃下加熱1 h豬油的過(guò)氧化值，見(jiàn)圖1。添加200 mg/kg的咖啡酸可以顯著降低豬油過(guò)氧化值(從145.71 mmol/kg減至98.85 mmol/kg)，其他抗氧化劑中橙皮素(109.93 mmol/kg)、柚皮素(112.93 mmol/kg)、維生素E(115.24 mmol/kg)、BHT(109.03 mmol/kg)也取得較好的效果。蘆丁和槲皮素對(duì)空氣中膽固醇氧化抑制作用明顯，但對(duì)豬油中過(guò)氧化值的降低作用較差，分別為139.21 mmol/kg(蘆丁)、133.78 mmol/kg(槲皮素)。由此可見(jiàn)，豬油的過(guò)氧化值指標(biāo)與膽固醇的氧化有很大不同，由過(guò)氧化值的單一指標(biāo)不能反映出膽固醇的高溫氧化情況。對(duì)豬油中膽固醇高溫氧化的研究將有助于進(jìn)一步闡明油脂氧化過(guò)程及程度。

圖1 添加抗氧化劑對(duì)豬油過(guò)氧化值的作用(160 ℃下加熱1 h)

3 結(jié)論

抗氧化劑對(duì)膽固醇的高溫氧化可以起到抑制作用，尤其是當(dāng)膽固醇在空氣中氧化時(shí)。膽固醇在豬油中氧化程度相對(duì)較弱，所選擇的11種抗氧化劑中僅有咖啡酸表現(xiàn)出較明顯的膽固醇高溫氧化抑制作用。過(guò)氧化值的對(duì)比研究表明，添加咖啡酸、橙皮素、柚皮素等可以有效降低豬油的過(guò)氧化值。單一的過(guò)氧化值指標(biāo)不能反映膽固醇高溫氧化情況。不同種類的抗氧化劑對(duì)膽固醇高溫氧化的抑制有很大不同，從而有助于篩選高溫抗氧化能力較強(qiáng)的抗氧化劑，咖啡酸的高溫抗氧化能力值得關(guān)注。

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Inhibition Effects of Antioxidants on the Thermo-Oxidation of Cholesterol

Xu Guihua1, 2Liu Donghong1Zhao Ruixiang1Chen Jianchu2Wang Jun2Ye Xingqian2

(Department of Food Science, Henan Institute of Science and Technology1, Xinxiang 453003)(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University2, Hangzhou 310058)

Inhibition effects of 11 antioxidants on the thermo-oxidation of cholesterol in air and lard have been evaluated in the study, as well as their effect on the peroxides value of lard. Cholesterol and 5 major cholesterol oxidation products: 7α-hydroxycholesterol, 7β-hydroxycholesterol, 5,6β-epoxycholesterol, 5,6α-epoxycholesterol, and 7-ketocholesterol have been detected by GC-MS. The results showed that several antioxidants were effective in inhibition of thermo-oxidation of cholesterol in air; rutin, quercetin, chlorogenic, caffeic had achieved the favorable effects. Cholesterol was less oxidized in lard than in air; only caffeic had a satisfied perfoemance in inhibiting cholesterol oxidation. According to the results of peroxide value experiment, caffeic, hesperitin, naringinin, VE, and BHT could decrease the peroxide value effectively, among which caffeic was the best. Inhibition effects of different antioxidants on the thermo-oxidation of cholesterol in air varied greatly, which could be applied to screen the antioxidants with high thermo-antioxidation capacity. The thermo-antioxidation capacity of caffeic deserved more attention.

antioxidants, cholesterol, thermo-oxidation, lard, gas chromatography

TS22

A

1003-0174(2016)04-0100-04

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31201304),中國(guó)博士后科學(xué)基金(2013M541787),浙江省博士后擇優(yōu)資助(BSH1301025),河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(13IRTSTHN006)

2014-08-01

徐貴華，男，1977年出生，副教授，食品氧化與抗氧化

葉興乾，男，1962年出生，教授，食品科學(xué)