劉 普 李小方 王永威 劉一瓊 鄧瑞雪

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術(shù)研究中心 河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

油用牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)含量測(cè)定方法研究

劉 普 李小方 王永威 劉一瓊 鄧瑞雪

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術(shù)研究中心 河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

采用Folin-Ciocalteus比色法測(cè)定油用牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)化合物的含量。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，系統(tǒng)研究了Folin-Ciocalteus比色法測(cè)定油用牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)的方法。得到適宜的顯色條件為：顯色劑用量為5 mL，碳酸鈉溶液用量為15 mL，反應(yīng)時(shí)間為30 min，反應(yīng)溫度為20～25 ℃。根據(jù)低聚茋類(lèi)化合物與Folin-Ciocalteus反應(yīng)后的紫外可見(jiàn)光區(qū)的特征吸收，由光譜掃描曲線可知最大吸收波長(zhǎng)為750 nm，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到?jīng)]食子酸的濃度與吸光度之間的線性關(guān)系。研究結(jié)果表明：在0.5～3.5 μg/mL范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸吸光度與其質(zhì)量呈良好線性關(guān)系，R2=0.999 6，平均加樣回收率99.8%，RSD為0.97%。該方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好，可以用于低聚茋類(lèi)化合物的含量測(cè)定。

Folin-Ciocalteus比色法 油用牡丹 籽餅粕 低聚茋類(lèi)化合物

牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，包括亞油酸、亞麻酸和油酸，總不飽和脂肪酸含量可以達(dá)到90%以上[1-4]。此外，牡丹籽餅粕中還含有大量的多酚類(lèi)活性物質(zhì)—低聚茋類(lèi)化合物[5]。低聚茋類(lèi)化合物是一類(lèi)具有1, 2-二苯乙烯骨架的聚合物的總稱。主要包括白藜蘆醇及其衍生物以同種或異種單體經(jīng)脫氫后形成的聚合度不等且具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物。近年來(lái)，隨著低聚茋類(lèi)化合物數(shù)量的增多，因?yàn)槠渚哂袕?fù)雜的結(jié)構(gòu)和良好抗真菌、抗細(xì)菌、抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋病及保肝等多種生物活性[6-10]，備受研究者的關(guān)注。目前共有超過(guò)600種的低聚茋類(lèi)化合物被分離得到。

目前測(cè)定多酚類(lèi)常用的方法是Folin-Ciocalteu比色法，如茶葉中茶多酚的測(cè)定[11-12]，但茶多酚屬于黃酮類(lèi)和類(lèi)黃酮類(lèi)(花色苷類(lèi))化合物，而油用牡丹中多酚為低聚茋類(lèi)化合物。鮮有采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定低聚茋類(lèi)化合物含量研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)Folin-Ciocalteu比色法對(duì)油用牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)化合物含量的測(cè)定方法進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽餅粕：紫斑牡丹(P.rocki)通過(guò)不脫殼直接壓榨法榨油后的剩余部分，由洛陽(yáng)全福食品有限公司提供；牡丹醇A (Suffruticosol A)：自制，純度>98%(HPLC)；鉬酸鈉：天津市化學(xué)試劑四廠；鎢酸鈉，無(wú)水碳酸鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸，濃鹽酸，硫酸鋰：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 2501-PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-D(Ⅲ) 型循環(huán)水真空泵：河南省予華儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；HANGPNG FA2004電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；H-1650臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Folin-Ciocalteu試劑的配制[11-12]

將10 g鎢酸鈉、2.5 g鉬酸鈉、70 mL蒸餾水、50 mL 85%磷酸及10 mL濃鹽酸裝入帶回流裝置的200 mL圓底燒瓶中，充分混合，文火緩慢回流10 h，加入15 g硫酸鋰(Li2SO4)，5 mL蒸餾水及數(shù)滴液溴，然后將燒瓶?jī)?nèi)溶液開(kāi)口煮15 min，以驅(qū)除過(guò)量的溴，冷至室溫后用容量瓶定容至100 mL，過(guò)濾。濾液呈微綠色。濾液酸度相當(dāng)于2 moL/L HCl溶液。將其置于棕色試劑瓶?jī)?nèi)，冷藏保存，用前稀釋3倍。

1.3.2 沒(méi)食子酸溶液的配制

稱取0.5 g沒(méi)食子酸，用去離子水完全溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為5 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液。分別移取0，1.0，2.0，3.0，5.0，7.0 mL于100 mL容量瓶中，定容，分別配成0，0.05，0.1，0.15，0.25，0.35 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 單體低聚茋類(lèi)樣品的配制

稱取從牡丹籽中分離得到的低聚茋類(lèi)化合物—牡丹醇A (Suffruticosol A) 86.0 mg，用去離子水完全溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.86 mg/mL的牡丹醇A溶液。取5 mL上述牡丹醇A溶液于100 mL容量瓶中，定容，配制成0.043 mg/mL的牡丹醇A溶液。

1.3.4 牡丹籽餅粕供試品的制備

稱取一定量的牡丹籽餅粕于潔凈離心管中，然后向離心管中加入一定量丙酮，超生震蕩提取25 min，然后在6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到燒瓶中，重復(fù)3次，將上清液均轉(zhuǎn)移至燒瓶中，在小于60 ℃條件下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓回收丙酮，得牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)化合物提取物。稱取一定量的低聚茋類(lèi)提取物，用蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，備用。

1.3.5 測(cè)定條件

1.3.5.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取沒(méi)食子酸溶液、牡丹醇A溶液和牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)提取物溶液各1.0 mL，分別與60 mL蒸餾水、5 mL Folin-Ciocalteu試劑、20%Na2CO3溶液混合均勻并定容至100 mL，20～25 ℃ 避光放置30 min，以1.0 mL去離子水代替樣品作空白對(duì)照，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到?jīng)]食子酸、牡丹醇A和牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)提取物經(jīng)顯色反應(yīng)后的吸收光譜，以選擇標(biāo)準(zhǔn)物和比色測(cè)定的波長(zhǎng)。

1.3.5.2 顯色時(shí)間和溫度的確定

將各比色試劑混合均勻后，20 ℃避光放置，每隔一段時(shí)間測(cè)定其吸光值，確定比色體系反應(yīng)完全所需時(shí)間。測(cè)定在不同溫度下顯色反應(yīng)后溶液的吸光值，以考察反應(yīng)溫度對(duì)比色效果的影響。

1.3.5.3 試劑加入體積比對(duì)吸光度的影響

取沒(méi)食子酸酸溶液1.0 mL，加入60 mL蒸餾水，混勻后分別加入體積比20%的Na2CO3溶液，定容至100 mL，顯色后測(cè)定其吸光值，測(cè)定Folin-Ciocalteu試劑與堿溶液用量比對(duì)比色效果的影響，以確定Folin-Ciocalteu顯色劑與飽和Na2CO3溶液的比例。

1.3.6 測(cè)定方法

分別取一定量供試品溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)出測(cè)定吸光度，帶入線性回歸方程，計(jì)算低聚茋類(lèi)化合物的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 比色法條件的確定

2.1.1 比色波長(zhǎng)的確定

低聚茋類(lèi)化合物屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，可以與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)后生成藍(lán)色的化合物，測(cè)定藍(lán)色化合物的吸收光譜，選擇最大吸收波長(zhǎng)作為比色法測(cè)定的波長(zhǎng)。圖1為沒(méi)食子酸、牡丹醇A和牡丹籽餅粕提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后的吸收光譜。沒(méi)食子酸、牡丹醇A和牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)提取物溶液與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)顯色后均在720～760 nm范圍內(nèi)有一明顯吸收峰，選擇最大吸收峰750 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由于沒(méi)食子酸與低聚茋類(lèi)化合物在750 nm處具有相同的吸收峰，因此可以選擇沒(méi)食子酸作為對(duì)照品來(lái)測(cè)定低聚茋類(lèi)化合物的含量。

圖1 樣品經(jīng)顯色反應(yīng)后的吸收光譜

2.1.2 顯色時(shí)間和溫度的確定

低聚茋類(lèi)化合物與顯色劑反應(yīng)需要一個(gè)過(guò)程，從圖2可知，30 min內(nèi)吸光值增大，顯色反應(yīng)迅速，反應(yīng)液顏色變藍(lán)且藍(lán)色逐漸加深。30 min后吸光值增大很小，反應(yīng)液顏色基本不變，表明顯色反應(yīng)基本完全。因此，將30 min確定為比色法的反應(yīng)時(shí)間。

圖2 吸光值隨反應(yīng)時(shí)間變化

顯色反應(yīng)溫度對(duì)顯色效果也有一定的影響，過(guò)低和過(guò)高均不利于低聚茋類(lèi)化合物的顯色(圖3)。在低溫條件下，顯色反應(yīng)緩慢，吸光值較小。隨著溫度提高，反應(yīng)速度加快，吸光值也逐漸增大，至30 ℃時(shí)達(dá)到最大值。而在20～25 ℃范圍內(nèi)吸光值穩(wěn)定在0.337，與30 ℃時(shí)0.338并無(wú)太大差距。在20～30 ℃范圍內(nèi)吸光度隨溫度變化在千分位，溫度影響并不太大。高溫條件下，反應(yīng)顏色相對(duì)較淺，吸光值降低。這表明生成的藍(lán)色物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定，容易褪色，所以綜合考慮后本試驗(yàn)確定顯色反應(yīng)溫度為20～25 ℃。

圖3 吸光值隨反應(yīng)溫度變化

2.1.3 試劑加入體積比對(duì)吸光度的影響

顯色劑與低聚茋類(lèi)化合物須在堿性條件下才能顯色。顯色劑用量對(duì)顯色效果也有影響(圖4)，分別加1、2、3、3.5、4、4.5、5 mL顯色劑，以選擇最佳顯色效果。圖4反映顯色劑用量為5 mL最佳。

在顯色劑與堿體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5條件下確定堿用量。圖5反映出在1∶3時(shí)顯色效果最好，1∶4時(shí)顯色效果明顯較差。因此，確定顯色劑用量為5 mL，堿用量為15 mL (在100 mL容量瓶中顯色、定容)。

圖4 吸光值隨Folin-Ciocalteu試劑添加量的變化

圖5 吸光值隨20%Na2CO3溶液與顯色劑體積比的變化

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別移取1.3.2中配置的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入60 mL的水，混合后加入5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8 min內(nèi)，加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，用水定容。將標(biāo)準(zhǔn)溶液在20 ℃放置30 min后，在波長(zhǎng)為750 nm下測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，曲線的回歸方程為：y=0.094 3x+0.004 7，R2=0.999 6，式中：x為樣品質(zhì)量濃度(μg/mL)；y為吸光度值。方程表明，標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.5～0.35 μg/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

圖6 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)化合物進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，反應(yīng)完全后在30 ℃下避光放置45、60、90、120、150 min后測(cè)定吸光值。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值有下降趨勢(shì)，但幅度不大，RSD為0.325%，表明穩(wěn)定性良好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 精密度試驗(yàn)

對(duì)Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)化合物進(jìn)行精密度試驗(yàn)，同一樣品測(cè)定5次，其吸光值的RSD為1.6%，表明該方法具有較高的精密度，完全能滿足樣品分析的要求。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取6份已知低聚茋類(lèi)化合物含量的牡丹籽餅粕提取物于離心管中，分別加入濃度為0.043 mg/mL的牡丹醇A溶液2.0，2.0，3.0，3.0，3.5，3.5 mL，然后按照1.3.4的方法配制供試品溶液?；旌暇鶆蚝蠹尤? mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8 min內(nèi)，加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，用水定容。將上述溶液在20 ℃放置2 h后，在波長(zhǎng)為750 nm下測(cè)定吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算低聚茋類(lèi)化合物的含量，并計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該比色方法的準(zhǔn)確度和可靠性。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，6次加標(biāo)回收試驗(yàn)的最低回收率為98.3%，最高回收率為101.3%，平均回收率為99.8%，其RSD為0.97%。結(jié)果表明，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，完全可用于牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)化合物含量的測(cè)定。

2.4 測(cè)定牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)化合物含量

采用上述方法，測(cè)定6批通過(guò)壓榨法制備的牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)化合物的含量，每個(gè)樣品平均測(cè)試3次，取平均值。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同批次測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

牡丹籽油中低聚茋類(lèi)化合物具有多酚類(lèi)物質(zhì)的性質(zhì)，通過(guò)與Folin-Ciocalteu作用在750 nm處有最大吸收峰，可以采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定天然產(chǎn)物中低聚茋類(lèi)化合物的含量。Folin-Ciocalteu法測(cè)定牡丹籽餅粕中低聚茋類(lèi)化合物含量的條件為：顯色時(shí)間為120 min，顯色反應(yīng)溫度為20 ℃，顯色劑用量為5 mL，堿用量為15 mL。

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定牡丹籽油這低聚茋類(lèi)化合物含量，具有穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、精密度高的特點(diǎn)，加樣回收率可以達(dá)到99.8%。此方法簡(jiǎn)便、快捷、穩(wěn)定，可以用于牡丹籽油及其它樣品中低聚茋類(lèi)化合物的含量測(cè)定。

[1]戚軍超，周海梅，馬錦琦，等. 牡丹籽油化學(xué)成分GC-MS分析[J]. 糧食與油脂, 2005, 19 (11)：22-23

[2]鄧瑞雪，劉振，秦琳琳，等. 超臨界CO2流體提取洛陽(yáng)牡丹籽油工藝研究[J].食品科學(xué)，2010，31(10)：142-145

[3]史國(guó)安，郭香鳳，金寶磊，等. 牡丹籽油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28(4)：47-50

[4]王昌濤，張萍，董銀卯. 超臨界CO2提取牡丹籽油的工藝以及成分分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(8)：96-99

[5]劉普，牛亞琪，鄧瑞雪，等. 紫斑牡丹籽餅粕低聚茋類(lèi)成分研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2014，49(12)：1018-1021

[6]Pawlus A D，Sahli R，Bisson J, et al. Stilbenoid Profiles of Canes from Vitis and Muscadinia Species[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(3): 501-511

[7]Riviere C, Pawlus A D, Merillon J M . Natural stilbenoids: distribution in the plant kingdom and chemotaxonomic interest in Vitaceae[J]. Natural Products Report, 2012, 29: 1317-1333

[8]Aslama S N, Stevenson P C. Antibacterial and antifungal activity of cicerfuran and related 2-arylbenzofurans and stilbenes[J]. Microbiological Research, 2009, 164(2): 191-195

[9]Sarpietro M G, Spatafora C. Effect of Resveratrol-Related Stilbenoids on Biomembrane Models[J]. Journal of Natural Products, 2013, 76(8): 1424-1431

[10]Shen T, Wang X N，Lou H X. Natural stilbenes: an overview[J]. Natural Product Reports, 2009, 26: 916-935

[11]黨法斌，高峰，郭磊，等. 茶多酚含量測(cè)定方法研究綜述[J]，食品工業(yè)科技，2012，33(5)：410-417

[12]劉麗香，Tanguy Laural，梁興飛，等. Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定苦丁茶中多酚含量[J]，茶葉科學(xué)，2008，28(2)：101-106.

Test Methodology of the Content of Oligostilbenes in the Seed Cake of Peony for Oil

Liu Pu Li Xiaofang Wang Yongwei Liu Yiqiong Deng Ruixue

(Henan Engineering Technology Research Center for Funiu Mountain Wild Medicinal Source Chemical Engineering & pharmaceutical College,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023)

The experiment in the paper utilized Folin-Ciocalteu colorimetric method to determine the oligostilbenes in peony seed cake for oil. The gallic acid was applied as a reference substance and has been systematically investigated for the development of the optimal colorimetric method. The optimum colorimetric conditions were as follows: 5 mL of Folin-Ciocalteu reagent, 15 mL of 20% Na2CO3solution, reaction time for 30 min and reaction temperature at 20～25 ℃. On condition that the reaction of oligostilbenes and the Folin-Ciocalteu reagent had the characteristics of absorption at 400～900 nm UV-Vis, the spectral scanning curves was taken to determine the wavelength as 750 nm. By drawing standard curve, the significant linear relation between concentration of gallic acid and absorbance was obtained. The calibration curve for quantifying gallic acid exhibited a fine linearity in range of 0.5～3.5μg/mL (R2=0.999 6); the reaverage recoveries of gallic acid of 99.8% with a RSD of 0.97%, the results showed that the method is simple, fast, fine stability, and suitable for the determination of the oligostilbenes in the plant.

folin-ciocalteus colorimetry, peony for oil, peony seed cake, oligostilbenes

TS229

A

1003-0174(2016)04-0138-05

洛陽(yáng)市科技攻關(guān)(1301052A,1401074A)，河南科技大學(xué)大學(xué)生訓(xùn)練計(jì)劃(HG201501)，河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)(152102110079)

2014-08-24

劉普，男，1978年出生，副教授，牡丹深加工的研究與開(kāi)發(fā)

鄧瑞雪，女，1978年出生，副教授，功能活性天然產(chǎn)物及其全合成