杜偉釗 盛靈慧 李保山 王 晶 向新乾 李秀琴

(北京化工大學(xué)1，北京 100029)(中國計(jì)量科學(xué)研究院2，北京 100029)

氣相色譜-質(zhì)譜法測定橄欖油中8種脂肪酸含量

杜偉釗1，2盛靈慧2李保山1王 晶2向新乾1李秀琴2

(北京化工大學(xué)1，北京 100029)(中國計(jì)量科學(xué)研究院2，北京 100029)

基于同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)建立了同時(shí)檢測橄欖油中8種脂肪酸的方法。對同位素內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行了篩選，確定了4種脂肪酸同位素標(biāo)記物的組合模式。優(yōu)化了酸堿結(jié)合法的樣品衍生化條件：含有適量同位素稀釋劑的8 mg橄欖油樣品中加入2%的NaOH-CH3OH溶液2 mL，在80 ℃條件下皂化15 min。加入2%的H2SO4-CH3OH溶液10 mL，甲酯化10 min，隨后加入10 mL水終止反應(yīng)。8種脂肪酸在0.02～1.6 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，定量限(S/N10)為0.07～0.54 μg/mL。本方法靈敏度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于橄欖油中脂肪酸的測定。

橄欖油 氣相色譜-質(zhì)譜 同位素稀釋 脂肪酸

橄欖油所含的不飽和脂肪酸最高可達(dá)88%，對人體具有多種保健作用[1-4]。由于橄欖樹種植困難，并且存在地域和環(huán)境等氣候限制以及壓榨工藝復(fù)雜等因素，造成了橄欖油價(jià)格的居高不下。高品質(zhì)橄欖油的摻假是一種比較常見的欺詐行為。傳統(tǒng)的鑒別橄欖油優(yōu)劣的方法主要是采取感官特征，但這種方法受到檢驗(yàn)人員主觀因素的干擾。據(jù)報(bào)道顯示橄欖油中的脂肪酸組成可以有效的支撐橄欖油的質(zhì)量評價(jià),但脂肪酸含量的變化可能導(dǎo)致不同的判定結(jié)果,因此準(zhǔn)確測定橄欖油的脂肪酸含量對于結(jié)果判定至關(guān)重要[5-7]。

目前關(guān)于脂肪酸的定量檢測主要以氣相色譜為主[8-11]，也有采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的報(bào)道，如Lerma-García等[11]采用液相色譜質(zhì)譜法對橄欖油中的脂肪酸進(jìn)行了測定。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，不僅涉及到脂肪酸的提取，同時(shí)需要對目標(biāo)脂肪酸進(jìn)行衍生化處理，樣品前處理不可避免的對測定結(jié)果造成一定影響。本研究在樣品前處理過程中通過引入目標(biāo)脂肪酸的同位素標(biāo)記物共同處理，消除了因?yàn)闃悠返难苌?、轉(zhuǎn)移、定容等過程帶來的影響。針對樣品中不同豐度的脂肪酸采用分段檢測的方式，實(shí)現(xiàn)了橄欖油中脂肪酸的準(zhǔn)確測定。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜儀(配EI離子源)：美國賽默飛世爾公司；DK-8D型恒溫水浴槽：上海一恒科技有限公司；MTN-2800D型氮吹儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；xp56型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO；10、100、1 000 μL移液槍：德國eppendorf公司。

正己烷、甲醇：J&T baker；98%H2SO4、NaOH：北京化工廠；棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸、山崳酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：中國計(jì)量科學(xué)研究院；棕櫚酸同位素標(biāo)記物(1-13C, 99%)、硬脂酸同位素標(biāo)記物(1-13C, 99%)、油酸同位素標(biāo)記物(1-13C, 99%)、花生酸同位素標(biāo)記物(D39, 98%)：美國劍橋同位素標(biāo)準(zhǔn)品公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

準(zhǔn)確稱取棕櫚酸20 mg，油酸120 mg，亞油酸10 mg，加入10 mL甲醇溶解記為母液A；棕櫚油酸15 mg，硬脂酸45 mg，α-亞麻酸11 mg，花生酸5.6 mg，山崳酸3 mg，加入35 mL甲醇溶液溶解記為母液B；棕櫚酸同位素標(biāo)記物20 mg，油酸同位素標(biāo)記物120 mg，加入10 mL甲醇溶解記為母液C；硬脂酸同位素標(biāo)記物60 mg，花生酸同位素標(biāo)記物60 mg，加入35 mL甲醇溶解記為母液D；橄欖油樣品160 mg，加入2 mL正己烷溶解記為母液E。所有母液樣品在使用前均保存于-68 ℃冰箱保存，使用前平衡至室溫。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和樣本的配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液由母液A,B混合組成，使得曲線覆蓋范圍為樣品中目標(biāo)脂肪酸含量的0.5～1.5倍(分別為0.5，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)中依次準(zhǔn)確稱取等量的500 μL母液C和200 μL母液D，用作同位素內(nèi)標(biāo)。

樣品溶液由母液C，D，E混合組成，采用天平準(zhǔn)確稱量500 μL母液C，200 μL母液D，200 μL母液E混合均勻即為含有同位素內(nèi)標(biāo)物的待測樣品。

1.2.3 樣品前處理

向配制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液或樣品溶液中加入2%的NaOH-CH3OH溶液2 mL，80 ℃水浴回流皂化15 min，隨后加入濃度為2%的H2SO4-CH3OH溶液10 mL，回流甲酯化10 min，最后加入20 mL超純水中止反應(yīng)，并將體系冷卻至室溫，用10 mL正己烷振蕩萃取。取上清液，氮?dú)鈸]干，用1 000 μL正己烷復(fù)溶后上機(jī)檢測。

1.2.4 GC-MS工作條件

氣相色譜質(zhì)譜：thermo ISQ；色譜柱：Agilent DB-225 MS(60 m，0.250 mm，0.25 μm)；載氣：高純氦氣；升溫程序：柱溫箱初始溫度120 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min的速率升溫至195 ℃，保持20 min，以5 ℃/min的速率升溫至235 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：220 ℃；掃面范圍：35～400 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化及甲酯化反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用外標(biāo)法對前處理過程中堿濃度(1%、2%、3%、4%)、皂化時(shí)間(10、15、20、25 min)、酸濃度(1%、2%、3%、4%)和甲酯化時(shí)間(2、5、10、15 min)分別進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以橄欖油中含量較高的不飽和脂肪酸油酸作為優(yōu)化指標(biāo)，優(yōu)化結(jié)果如圖1、圖2所示。可以看出油酸的甲酯化轉(zhuǎn)化率隨著各優(yōu)化條件的上升均有所增加，但達(dá)到某一峰值后均呈不同程度的下降趨勢?？梢园l(fā)現(xiàn)堿濃度過高可能會(huì)過多的中和后續(xù)反應(yīng)中的酸催化劑，因此降低了甲酯化效率；而皂化、甲酯化時(shí)間過長或是酸濃度過高均可能引發(fā)了副反應(yīng)而降低了甲酯化效率。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到1.2.3中的前處理?xiàng)l件。

圖1 堿濃度(a)和酸濃度(b)對甲酯化效率的影響

圖2 皂化時(shí)間(c)和甲酯化時(shí)間(d)對甲酯化效率的影響

2.2 同位素標(biāo)記物和特征離子峰的選擇

為保證測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，考察了多種同位素標(biāo)記物的出峰情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用脂肪酸部分氘代標(biāo)記物時(shí)，有可能會(huì)對目標(biāo)脂肪酸本身造成干擾，影響色譜峰的對稱性。如圖3所示，C16∶0(2,2-D2)同位素標(biāo)記物的加入使得棕櫚酸峰形受到影響，而C16∶0(1-13C)同位素標(biāo)記物的加入可以避免此現(xiàn)象的發(fā)生，如圖4所示。同時(shí)當(dāng)使用脂肪酸全氘代標(biāo)記物時(shí)，同位素標(biāo)記物的保留時(shí)間與目標(biāo)脂肪酸的保留時(shí)間會(huì)出現(xiàn)偏移。如圖5所示，花生酸C20∶0(D39)同位素標(biāo)記物的出峰時(shí)間比花生酸的出峰有所提前，但結(jié)果顯示保留時(shí)間不同并不會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

圖3 棕櫚酸及其同位素標(biāo)記物C16∶0(2,2-D2)色譜圖

圖4 棕櫚酸及其同位素標(biāo)記物C16∶0(1-13C)色譜圖

圖5 花生酸及其同位素標(biāo)記物C20∶0(D39)色譜圖

2.3 線性方程

試驗(yàn)中，內(nèi)標(biāo)所用同位素標(biāo)記物與橄欖油中同一脂肪酸摩爾比在1∶1左右，標(biāo)準(zhǔn)曲線覆蓋濃度范圍為目標(biāo)脂肪酸的0.5～1.5倍。以脂肪酸與其對應(yīng)脂肪酸同位素標(biāo)記物在樣品中的摩爾比作為X軸，譜圖中的脂肪酸與同位素標(biāo)記物的面積比為Y軸作圖，可獲得如圖6所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6 脂肪酸與同位素比標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6中RM為樣品中脂肪酸與其對應(yīng)脂肪酸標(biāo)記物的摩爾比；RA為樣品中脂肪酸與其對應(yīng)脂肪酸標(biāo)記物的出峰面積比；k與b分別為經(jīng)過線性擬合所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距。

8種脂肪酸的保留時(shí)間、特征離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1。通過分段檢測的方法，調(diào)整分流比及待測樣品濃度使不同含量的脂肪酸色譜峰信噪比(S/N)均在20以上，方法的檢出限(S/N=3)為0.02～1.6 μg/mL，定量限(S/N=10)為0.07～5.4 μg/ml。

表1 8種脂肪酸的保留時(shí)間、特征離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱量NIST 3274-1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及脂肪酸同位素標(biāo)記物，對棕櫚酸、棕櫚油酸等8種脂肪酸進(jìn)行測定，考察該方法的準(zhǔn)確性。測定過程與1.2.3和1.2.4條件相同。根據(jù)脂肪酸含量的不同，采取分段檢測的方法，將目標(biāo)脂肪酸與其對應(yīng)的脂肪酸同位素峰面積比值帶入各自的線性方程中，計(jì)算出各脂肪酸的含量。表2為NIST 3274-1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值及方法驗(yàn)證試驗(yàn)的測試結(jié)果。

表2 NIST 3274-1標(biāo)物中脂肪酸參考及實(shí)測含量

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示該試驗(yàn)方法具有良好的準(zhǔn)確性，測定結(jié)果全部落在標(biāo)準(zhǔn)值的區(qū)間內(nèi)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用自身同位素標(biāo)記物測定某一脂肪酸含量時(shí)，數(shù)據(jù)將更為準(zhǔn)確，但是由于脂肪酸同位素內(nèi)標(biāo)的價(jià)格昂貴并難于獲取等原因，在實(shí)際的檢測過程中無法實(shí)現(xiàn)全部采用自身同位素進(jìn)行定量，試驗(yàn)中通過采用碳數(shù)相近的脂肪酸同位素內(nèi)標(biāo)，同樣取得了準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.5 橄欖油樣品中脂肪酸的定量分析

準(zhǔn)確稱量一定量的橄欖油及同位素標(biāo)記物樣品，隨后按1.2.3的條件進(jìn)行樣品前處理，按1.2.4的方法進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如表3所示?？梢钥闯鲩蠙煊椭兄舅岷孔罡叩臑橛退幔吭?41.71 mg/g左右，其次是棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸，含量分別在110.99，61.80和37.84 mg/g左右，其余4種脂肪酸(棕櫚油酸、α-亞麻酸、花生酸和山崳酸)含量均在1%以下，橄欖油中不飽和脂肪酸總量在80%以上。

表3 8種脂肪酸在橄欖油中的含量

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了橄欖油中8種常見脂肪酸的定量檢測方法，獲取的最佳皂化、甲酯化條件為：樣品8 mg，2%的NaOH-CH3OH溶液2 mL皂化15 min，2%的H2SO4-CH3OH溶液10 mL甲酯化10 min。采用同位素稀釋質(zhì)譜法可以實(shí)現(xiàn)橄欖油中8種脂肪酸的定量檢測。通過對NIST 3274-1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同樣檢測方法的比對，可知本方法具有良好的準(zhǔn)確性，可比性和可溯源性。

志謝：本項(xiàng)目得到了國家質(zhì)檢總局食品安全項(xiàng)目“谷物、油脂類食品中脂肪酸、功能糖、蛋白過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究”(32-ASPAQ1303)和質(zhì)檢行業(yè)公益項(xiàng)目子課題“雙打中大豆油和橄欖油檢驗(yàn)鑒定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制”(32-211309GYH-2)的支持。

[1]Visioli F, Galli C. Biological properties of olive oilphytochemicals [J] .Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2002, 42:209-221

[2]Nadia Mekki, Monique Charbonnier, Patrick Borel, et al.Butter Differs from Olive Oil and Sunflower Oil in Its Effects on Postprandial Lipemia and Triacylglycerol-Rich Lipoproteins after Single Mixed Meals in Healthy Young Men [J] .The journal of nutrition, 2002, 132(12):3642-3649

[3]Menendez J A, Papadimitropoulou A, Vellon L, et al.A genomic explanation connecting “mediterranean diet”, olive oil and cancer: Oleic acid, the main monounsaturated fatty acid of olive oil, induces formation of inhibitory “PEA3 transcription factor-PEA3 DNA binding site ” complexes at the Her-2/neu(erbB-2) oncogene promoter in breast, ovarian and stomach cancer cells [J] .European Journal of Cancer, 2006, 42(15): 2425-2432

[4]Owen, R. W.,Giacosa, A., Hull, W. E., et al.Olive oil consumption and health: The possible role of antioxidants [J] .Lancet Oncology,2000, 1:107-112

[5]Maggio R M, Kaufman T S, Carlo M D, et al. Monitoring of fatty acid composition in virgin olive oil by fourier transformed infrared spectroscopy coupled with partial least squares [J] .Food Chemistry, 2009, 114(4): 1549-1554

[6]Tsimidou M, Karakostas K. Geographical classification of greek virgin olive oil by non-parametric multivariate evaluation of fatty acid composition [J] .Journal of the Science of Food and Agriculture, 1993, 62(3): 253-257

[7]Aguilera MP, Beltran G, Ortega D, et al. Characterisation of virgin olive oil of Italian olive cultivars: Frantoio and Leccino, grown in Andalusia [J] .Food Chemistry, 2005, 89:387-391

[8]湯富彬，沈丹玉，劉毅華，等.油茶籽油和橄欖油中主要化學(xué)成分分析 [J] .中國糧油學(xué)報(bào)，2013，28(7)：108-113

[9]MahsaNaghshineh, Abdul Azisariffin，HasanahMohdGhazali, et al. Effect of Saturated/Unsaturated Fatty Acid Ratio on Physicochemical Properties of Palm Olein-Olive Oil Blend [J] . J Am Oil ChemSoc, 2010, 87:255-262

[10]M. Monfreda, L. Gobbi, A. Grippa. Blends of olive oil and sunflower oil: Characterisation and olive oil quantification using fatty acid composition and chemometric tools [J]. Food Chemistry, 2012, 134:2283-2290

[11]Lerma-García M J, Herrero-Martínez J M, Ramis-Ramos G, et al. Evaluation of the quality of olive oil using fatty acid profiles by direct infusion electrospray ionization mass spectrometry [J] .Food chemistry, 2008, 107(3): 1307-1313

[12]Gómez-González S, Ruiz-Jiménez J, de Castro M D L. Oil content and fatty acid profile of spanish cultivars during olive fruit ripening [J] . Journal of the American Oil Chemists' Society, 2011, 88(11): 1737-1745

[13]Yizhao Chen, Qinde Liu, Sharon Yong, et al. An improved reference measurement procedure for triglycerides and total glycerides in human serum by isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry [J] . Clinica Chimica Acta, 2014, 428: 20-25

[14]王海波，李昌寶，吳雪輝，等.響應(yīng)面方法優(yōu)化羅漢果籽油提取工藝及脂肪酸組成分析 [J] .中國糧油學(xué)報(bào)，2013，28(7)：46-49.

Determination of Eight Fatty Acids in Olive Oil by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Du Weizhao1，2Sheng Linghui2Li Baoshan1Wang Jing2Xiang Xinqian1Li Xiuqin2

(Beijing University of Chemical Technology1, Beijing 100029)(National Institute of Metrology2, Beijing 100029)

An isotope dilution method for simultaneous determination of eight fatty acids in olive oil has been established along with the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in the paper. After comparison among different isotope labeled fatty acids, four fatty acids were selected to be the internal standards. The conditions of fatty acid methyl esters preparation were optimized. The final procedures were as follows: 8 mg of sample oil, saponificated in 2 mL of NaOH-CH3OH (2%) for 15 min; methyl esterificated by 10 mL of H2SO4-CH3OH (2%) for 10 min. The limits of quantification (LOQ), linearity and accuracy were validated finally. The LOQs for analytes were proved to range from 0.07～0.54 g/mL (S/N10); the determination coefficients>0.99 within the tested concentration range (0.02～1.6 g/mL). The established method shall be successfully applied in the determination of target fatty acids in olive oil.

olive oil, GC-MS, isotope dilution, fatty acid

TQ646.4

A

1003-0174(2016)04-0104-05

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局”雙打”項(xiàng)目子課題(21130SGYH-2)，中國計(jì)量科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(AKY1411-14)

2014-08-08

杜偉釗，男，1989年出生，碩士，化學(xué)工程與技術(shù)

盛靈慧，男，1978年出生，副研究員，脂質(zhì)計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)研究