張康逸 張麗霞 王興國 劉元法

(河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所1，鄭州 450002)(鄭州大學(xué)化學(xué)系2，鄭州 450001)(江南大學(xué)食品學(xué)院3，無錫 214122)

磷脂酶A1(LecitaseUltra)水解磷脂酰膽堿的動(dòng)力學(xué)方程和熱力學(xué)研究

張康逸1,2張麗霞1王興國3劉元法3

(河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所1，鄭州 450002)(鄭州大學(xué)化學(xué)系2，鄭州 450001)(江南大學(xué)食品學(xué)院3，無錫 214122)

研究了磷脂酶A1(LecitaseUltra)在水相體系中水解磷脂酰膽堿(PC)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)。依據(jù)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)方程式，計(jì)算出了催化水解反應(yīng)的活化能為5.96 kJ/mol；并進(jìn)行了LecitaseUltra水解PC的Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)法酶催化模型動(dòng)力學(xué)模擬，利用底物抑制原理進(jìn)行了模型修正；采用Lineweaver-Burk作圖法，計(jì)算出反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km，Vmax和kI分別為4.02×10-2mol/L、10.05 mol/(L·min)和1.33×102mol/L。研究結(jié)果為探討Lecitase Ultra催化機(jī)理及其變性機(jī)理提供了參考。

磷脂酶A1磷脂酰膽堿 甘油磷脂酰膽堿 動(dòng)力學(xué) 熱力學(xué)參數(shù)

磷脂酶A1(LecitaseUltra)是一種成熟工業(yè)用酶，具有脂肪酶(T.lanuginosa)的熱穩(wěn)定性和脂肪酶(F.oxysporum)的活性[1-2]，能水解磷脂Sn-1位?；舅醄3]，已被成功應(yīng)用到油脂化學(xué)工業(yè)中三酰甘油、磷脂的酯交換及催化水解方向，如：酯化制備低聚脂肪酸甘油酯[4]、大豆油部分水解[5]、有機(jī)相酶法制備溶血磷脂[6]、酶催化合成多不飽和脂肪酸磷脂[7]等，并且顯示出很高的催化活性。

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究可為酶催化反應(yīng)機(jī)理提供一些信息，而熱力學(xué)參數(shù)的測(cè)定有助于了解酶的變性機(jī)理，二者對(duì)于酶催化反應(yīng)研究是非常必要的。通常采用微量量熱法研究酶的熱變性、采用尿素法或鹽酸胍法研究酶的溶劑變性，近年來有研究采用動(dòng)力學(xué)方法研究酶的穩(wěn)定性，該方法簡單、且不需使用價(jià)格昂貴的微量量熱儀[8-9]。

本試驗(yàn)研究LecitaseUltra水解大豆粉末磷脂動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)。通過Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)法酶催化模型對(duì)LecitaseUltra催化水解過程進(jìn)行模擬，計(jì)算出反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km，Vmax和kI；根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)方程，計(jì)算出酶水解反應(yīng)的活化能，并建立水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

食品級(jí)大豆粉末磷脂(磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%，主要成分20% PC，15% PE，20% PI，5% PA)：天津市博帥工貿(mào)有限公司；PC(99%)和L-α-GPC(99%)標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司(St. Louis, MO, USA)；LecitaseUltra(酶活力9 500 U/mL)：Novozymes A/S；CaCl2(分析純)、乙腈(色譜純)和醋酸銨(色譜純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為Millipore超純水(18.2 MΩ·cm, TOC∶ 3 μg/mL)；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Waters1525高效液相色譜儀：美國Waters公司；GT16-3高速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；MixPlus漩渦震蕩器：合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)步驟

水解大豆粉末磷脂反應(yīng)在1個(gè)250 mL三頸圓底燒瓶中完成。操作步驟：稱取5 g大豆粉末磷脂，量取150 mL去離子水，轉(zhuǎn)移到250 mL燒瓶中，在40 ℃水浴(通過水浴鍋控溫，溫度計(jì)校準(zhǔn)溫度，誤差±0.5 ℃)中加熱，通過機(jī)械攪拌混勻(轉(zhuǎn)速450 r/min，均質(zhì)20 min)，然后添加0.5 g無水CaCl2和4 750 U的LecitaseUltra進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)5 min，停止攪拌快速取樣2 mL(5mL的移液槍從反應(yīng)液的中部快速取樣)，添加95%乙醇1 mL終止反應(yīng)，在80 ℃進(jìn)行真空濃縮去水，然后溶于2 mL氯仿∶甲醇(2∶1，V∶V)，再用漩渦振蕩器進(jìn)行混合，在10 000 r/min的離心機(jī)上離心，取上清液在-20 ℃下保存，最后進(jìn)行HPLC-ELSD分析。

1.2.2 Lecitase Ultra催化水解反應(yīng)初速度

反應(yīng)初速度的定義為反應(yīng)時(shí)間t=0 時(shí)刻的反應(yīng)速率, 以5 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的平均反應(yīng)速率代替反應(yīng)初速度。

(1)

式中：v初為反應(yīng)初速度/mol/(L·min)；ct為反應(yīng)t時(shí)間磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)的質(zhì)量濃度/g/L；c0為酶反應(yīng)初始時(shí)PC的質(zhì)量濃度/g/L；t為酶反應(yīng)的時(shí)間差/min；V0為酶反應(yīng)的體積/L；MPC為磷脂酰膽堿的相對(duì)分子質(zhì)量/782 g/mol。

1.2.3 Lecitase Ultra的動(dòng)力學(xué)測(cè)定

在一定的pH和溫度下, 測(cè)定不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)初速度v, 利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出LecitaseUltra的Km和Vmax。

1.2.4 Lecitase Ultra的熱穩(wěn)定性測(cè)定

參照1.2.1中的試驗(yàn)方法，將LecitaseUltra水解磷脂酰膽堿的反應(yīng)分別在20、25、30、35、40、45、50 ℃等溫度下進(jìn)行，反應(yīng)5 min，取樣2 mL，添加95%乙醇1 mL終止反應(yīng)，在80 ℃進(jìn)行真空濃縮去水，進(jìn)行HPLC-ELSD分析，計(jì)算不同溫度下的反應(yīng)初速度。

1.3 HPLC-ELSD

分析條件：分析柱Lichrospher Si60 4.6×250 mm；柱溫35 ℃；流速0.97 mL/min；梯度洗脫，流動(dòng)相A∶甲醇∶水(8∶1，V∶V)，流動(dòng)相B：甲醇，流速1.0 mL/min；A相的梯度，開始10 min，以40%梯度增加到60%，保持5 min，之后3 min，以60%梯度降低到40%；進(jìn)樣量20 μL。樣品的定性通過標(biāo)樣保留時(shí)間比對(duì)，定量采用標(biāo)樣外標(biāo)法。

PC標(biāo)準(zhǔn)曲線：用氯仿∶甲醇(2∶1，V∶V)將PC標(biāo)準(zhǔn)品配成1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC-ELSD測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=12.281 9X-5.790 6(R2=0.992 6)，PC濃度(1 mg/mL≤cpc≤3.5 mg/mL)。

L-α-GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線：用氯仿∶甲醇(2∶1，V∶V)將L-α-GPC標(biāo)準(zhǔn)品配成1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC-ELSD測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=9.273 9X-8.379 9(R2=0.991 0)，L-α-GPC濃度(1 mg/mL≤cgpc≤4 mg/mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶水解反應(yīng)的熱力學(xué)分析

溫度影響反應(yīng)速率，但不影響反應(yīng)級(jí)數(shù)，利用經(jīng)典熱力學(xué)方程推導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)速率和反應(yīng)溫度關(guān)系，其中平衡常數(shù)k和底物濃度c是影響反應(yīng)速率的2個(gè)主要因素。

反應(yīng)速率方程：

(2)

依據(jù)絕對(duì)反應(yīng)速率理論，反應(yīng)平衡常數(shù)k和溫度T有如下關(guān)系：

(3)

式中：k為平衡常數(shù)；kB為波茲曼常數(shù)；h為普朗克常數(shù)；ΔG≠為反應(yīng)自由能變化；T為絕對(duì)溫度；R為氣體常數(shù)。

利用Arrhenius經(jīng)驗(yàn)方程進(jìn)行反應(yīng)速率與反應(yīng)溫度之間關(guān)系的定量描述：

k=Ae-Ea/RT

(4)

式中：A為Arrhenius因子；Ea為反應(yīng)活化能。

將方程(4)代入方程(2)中可以得出反應(yīng)速率與反應(yīng)活化能的關(guān)系：

v=A′e-Ea/RT

(5)

(6)

LecitaseUltra水解PC的反應(yīng)活化能可以通過方程(5)，方程(6)(借助lnv與1/T關(guān)系圖)求出，lnv0與1/T的線性關(guān)系見圖1。從圖1中得出反應(yīng)初速率與反應(yīng)溫度的關(guān)系：

從方程(5)計(jì)算出反應(yīng)活化能為5.96 kJ/mol，這與已報(bào)道的磷脂酶活化能是一致的(0.97～34.5 kJ/mol)[10]。

圖1 酶催化水解的反應(yīng)初始速率與反應(yīng)溫度的關(guān)系

2.2 酶水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)分析

從圖2中可以看出，LecitaseUltra水解PC制備甘油磷脂酰膽堿(L-alpha glycerylphosphorylcholine,L-α-GPC)的催化水解反應(yīng)速率(即曲線的斜率)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸減小，最終趨于平緩。這可能是因?yàn)椋?) 底物逐漸消耗，造成酶的相對(duì)飽和，致使相對(duì)催化效率降低；2) 隨著產(chǎn)物的積累，逆反應(yīng)速度逐漸增加，同時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)物對(duì)酶的抑制；3)2個(gè)因素共同作用導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。這些原因共同作用導(dǎo)致LecitaseUltra水解PC的反應(yīng)過程不符合均相催化反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)模型，需要建立一種新的模型進(jìn)行模擬。對(duì)于酶反應(yīng)中的這個(gè)問題，許多酶催化專家試著用初速度代替反應(yīng)速度進(jìn)行模擬。在反應(yīng)初始階段，僅有少量底物被水解，可以將底物濃度的變化忽略；同樣，生成的產(chǎn)物也比較少，逆反應(yīng)也可以忽略不計(jì)，另外，在水解反應(yīng)的初始階段LecitaseUltra是穩(wěn)定的。所以，模擬LecitaseUltra水解PC反應(yīng)過程的關(guān)鍵步驟是準(zhǔn)確測(cè)定反應(yīng)初速度。為了獲得準(zhǔn)確反應(yīng)初速度，需要盡可能在比較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)測(cè)定反應(yīng)底物的變化，作轉(zhuǎn)化率和時(shí)間關(guān)系曲線，利用線性回歸法計(jì)算切線斜率。一般情況下，酶水解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率低于20%時(shí)，轉(zhuǎn)化率和時(shí)間的曲線是線性的[11]。因此，為了精確測(cè)定LecitaseUltra水解的初速度，本研究均在PC轉(zhuǎn)化率小于10%的情況下進(jìn)行測(cè)定。

圖2 Lecitase Ultra水解反應(yīng)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

本研究是水相體系中LecitaseUltra催化水解PC制備L-α-GPC，假設(shè)水的量在水解過程中基本保持不變。因此，LecitaseUltra的催化水解反應(yīng)可視作“擬一級(jí)反應(yīng)”來處理。水解反應(yīng)的模型：

(7)

式中，E、S、P和ES分別代表LecitaseUltra、底物、產(chǎn)物和?；o酶；k1、k-1、k2和k-2分別代表各步反應(yīng)的速率常數(shù)。

酶催化模型主要有2個(gè)：平衡法(Michaelis-Menten方程)和穩(wěn)態(tài)法(Briggs-Haldane修飾的Michaelis-Menten方程)[12-13]。Michaelis-Menten平衡模型，假設(shè)底物結(jié)合速率比中間體分解速率快(即k2遠(yuǎn)小于k-1)。Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)模型，假定中間體分解成產(chǎn)物的步驟沒有逆反應(yīng)，穩(wěn)態(tài)時(shí)ES濃度近似保持不變(d[ES]/dt = 0)。對(duì)于本研究來說，反應(yīng)底物S有較大的長鏈脂肪酸，能產(chǎn)生強(qiáng)大的空間位阻，導(dǎo)致水解過程中酶與底物結(jié)合速率較慢。因此，可以用穩(wěn)態(tài)法模型來模擬LecitaseUltra催化水解PC的反應(yīng)過程。從穩(wěn)態(tài)理論出發(fā)，ES復(fù)合物濃度變化的微分方程等于零，即：

(8)

整理得：

(9)

方程v0=k2[ES]和[E0]= [E]+[ES]兩邊相除，可以得到方程(10)：

(10)

將方程(9)代入方程(10)整理得：

(11)

(12)

圖3表明：反應(yīng)底物對(duì)LecitaseUltra水解反應(yīng)具有抑制作用，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.128 mol/L時(shí)，酶水解反應(yīng)受到底物抑制，反應(yīng)初速度開始下降。對(duì)方程式(7)的模型進(jìn)行修正：

圖3 反應(yīng)初速率與S濃度的關(guān)系

(13)

形成的抑制性復(fù)合物(SES)有一個(gè)解離常數(shù)(KI)：

(14)

這種抑制設(shè)想為2個(gè)底物分子結(jié)合到同一個(gè)LecitaseUltra活性位點(diǎn)的不同亞位點(diǎn)上，導(dǎo)致酶和底物的反應(yīng)基團(tuán)(*)不匹配(圖4)。根據(jù)抑制模型進(jìn)行反應(yīng)速度方程式推導(dǎo)：

(15)

圖4 底物抑制和非抑制酶水解模型

利用Lineweaver-Burk作圖法[14-15]，對(duì)反應(yīng)初速度倒數(shù)和底物濃度倒數(shù)作圖(圖5)，求出低底物濃

圖5 初始反應(yīng)速率倒數(shù)(1/V)與S濃度倒數(shù)之間的關(guān)系

度下的參數(shù)Km和Vmax。同時(shí)，在3個(gè)最大底物濃度對(duì)應(yīng)的點(diǎn)，求出底物競爭性抑制時(shí)的kI。Km，Vmax和kI分別為4.02×10-2mol/L、10.05 mol/(L·min)和1.33×102mol/L。

3 結(jié)論

LecitaseUltra是一種有效的生物催化劑，在水相體系中能催化水解大豆粉末磷脂中的PC制備L-α-GPC。通過動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)研究進(jìn)一步探索LecitaseUltra催化反應(yīng)機(jī)理及其變性機(jī)理。本試驗(yàn)依據(jù)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)方程式，計(jì)算出LecitaseUltra水解反應(yīng)的活化能為5.96 kJ/mol；并在假設(shè)水的量在反應(yīng)過程中基本保持不變條件下，利用Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)法酶催化模型進(jìn)行“擬一級(jí)”的LecitaseUltra水解PC的動(dòng)力學(xué)模擬。根據(jù)底物抑制原理進(jìn)行了模型修正，采用Lineweaver-Burk作圖法，對(duì)反應(yīng)初速度倒數(shù)和底物濃度倒數(shù)作圖，得出反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km，Vmax和KI分別為4.02×10-2mol/L、10.05 mol/(L·min)和1.33×102mol/L。

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The Hydrolysis of Phosphatidylcholine by Phospholipase A1(Lecitase Ultra) Through the Kinetic and Thermodynamic

Zhang Kangyi1,2Zhang Lixia1Wang Xingguo3Liu Yuanfa3

(Henan Academy of Agricultural Sciences Institute of Agricultural products Processing1, Zhengzhou 450002)(Zhengzhou University Department of Chemistry2, Zhengzhou 450001)(Jiangnan University School of Food Science and Technology3, Wuxi 214122)

Abstract: The kinetic and thermodynamic properties of the hydrolysis of phosphatidylcholine (PC) by phospholipase A1(LecitaseUltra) in aqueous systems are studied in the paper. Based on experience Arrhenius equation, the activation energy ofLecitaseUltrahydrolysis is 5.96 kJ/mol. Briggs-Haldane steady enzymatic model is fitted to enzymatic hydrolysis process of PC. Meantime, the steady model is further modified using the principle of substrate inhibition. On the base of Lineweaver-Burk plot, kinetic parametersKm,Vmaxandk1was 4.02 × 10-2mol/L, 10.05 mol/ (L·min) and 1.33 × 102mol/L, respectively. The results provide the basic data and theoretical support for the catalytic and degeneration mechanism of Lecitase Ultra to further explore.

phospholipase A1, phosphatidylcholine, L-alpha glycerylphosphorylcholine, kinetics，thermodynamic parament

TS229

A

1003-0174(2016)04-0076-05

國家自然科學(xué)基金(31301502)，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金(2013YQ25)

2014-06-19

張康逸，男， 1981年出生，博士，脂質(zhì)研究

劉元法，男，1974年出生，教授，油脂加工