張 如 戴巧玲 吳小燕 李琳琳 陳元?jiǎng)?吳 佳

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350116)

分光光度法測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量

張 如 戴巧玲 吳小燕 李琳琳 陳元?jiǎng)?吳 佳

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350116)

采用紫外可見(jiàn)分光光度法研究了剛果紅濃度、β-葡聚糖濃度、反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、離子濃度、光照、體系中可能共存的淀粉和蛋白等因素對(duì)測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量的影響。同時(shí)，在紫外吸收光譜分析的基礎(chǔ)上運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法計(jì)算剛果紅與燕麥β-葡聚糖的結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N及平均結(jié)合數(shù)n。結(jié)果表明：室溫條件下，剛果紅質(zhì)量濃度50 μg/mL，pH 7.5，反應(yīng)時(shí)間30 min，離子濃度0.1 mol/L時(shí)，吸光度與β-葡聚糖濃度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線(xiàn)性關(guān)系。光照對(duì)測(cè)定無(wú)影響，共存的淀粉和蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定影響較小。在試驗(yàn)條件下，剛果紅與燕麥β-葡聚糖的結(jié)合常數(shù)K為4.08×106、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N為336、平均結(jié)合數(shù)n為297。

燕麥 β-葡聚糖 剛果紅 分光光度法 結(jié)合模型

(1→3)(1→4)-β-D-葡聚糖，簡(jiǎn)稱(chēng)β-葡聚糖，屬于水溶性膳食纖維，是由D-葡萄糖以連續(xù)的β-(1→4)糖苷鍵和單個(gè)的β-(1→3)糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性多糖[1]，β-(1→4)鍵與β-(1→3)的比例約為7∶3，β-葡聚糖主要存在于燕麥、大麥等谷物中，并以燕麥麩中含量較高，是燕麥中重要的功能成分。研究發(fā)現(xiàn)，燕麥β-葡聚糖具有多種生理功能，能夠降低膽固醇水平，預(yù)防心腦血管疾病，具有調(diào)節(jié)血糖，改善便秘，調(diào)理腸道等功能[2-5]。因此，研究人員對(duì)燕麥β-葡聚糖的提取、含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)性質(zhì)等開(kāi)展了大量的工作。

目前，測(cè)定β-葡聚糖含量較準(zhǔn)確的方法主要是酶法和流動(dòng)注射(FIA)熒光法[6-13]。但是酶法需要用到昂貴的高純度專(zhuān)一性酶，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。流動(dòng)注射熒光法需要用到昂貴的儀器，需專(zhuān)人操作。因此，這2種方法都難以廣泛應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，剛果紅可與β-葡聚糖專(zhuān)一性結(jié)合，使溶液顏色加深[14-15]。利用這一原理，本研究以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為檢測(cè)儀器，定量測(cè)定燕麥β-葡聚糖的含量，對(duì)測(cè)定條件和方法的準(zhǔn)確度與精密度進(jìn)行了研究。并運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法計(jì)算剛果紅與燕麥β-葡聚糖的定量結(jié)合規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 主要材料

燕麥β-葡聚糖標(biāo)品：百特純大分子科技有限公司；剛果紅：上海晶純生化科技股份有限公司，ACS級(jí)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CARY50 Bio紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)瓦里安公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010 0 g β-葡聚糖，加去離子水，80 ℃水浴攪拌溶解，冷卻至室溫后定容至100 mL，搖勻，即得到0.1 mg/mL的β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

剛果紅儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.050 0 g剛果紅，溶解于0.1 mol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中，定容至250 mL，搖勻，即得0.2 mg/mL的剛果紅溶液。使用時(shí)，配制成所需濃度的剛果紅溶液。

淀粉儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.315 8 g可溶性淀粉，加適量去離子水，5 min內(nèi)加熱至沸，煮沸15 min，快速冷卻至室溫后定容至100 mL，搖勻，即得3.158 mg/mL淀粉儲(chǔ)備液。使用時(shí)，配制成所需濃度的淀粉溶液。

蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.315 8 g酪蛋白，加10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，攪拌溶解完全后加10 mL 0.1 mol/L HCl中和后定容至100 mL，搖勻，即得3.158 mg/mL蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液。使用時(shí)，配制成所需濃度的蛋白質(zhì)溶液。

1.3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

向試管中加入一定體積的燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水補(bǔ)至2 mL，加入4 mL一定濃度的剛果紅溶液，得到不同濃度β-葡聚糖和剛果紅的混合液，立即渦旋振蕩10 s，靜置30 min后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)混合液在350～700 nm進(jìn)行吸收光譜掃描。并將混合液吸收光譜減去相同濃度剛果紅溶液吸收光譜，得到兩者的差譜?；旌弦褐懈鹘M分濃度均為溶液中(共6 mL)的終濃度。試驗(yàn)均做3次平行，后續(xù)試驗(yàn)如無(wú)特殊說(shuō)明，操作過(guò)程與此相同。

1.3.3 剛果紅濃度與β-葡聚糖線(xiàn)性范圍的確定

配制系列混合液，使其中剛果紅質(zhì)量濃度為30～70 μg/mL，β-葡聚糖質(zhì)量濃度為0～30 μg/mL，于550 nm處測(cè)定吸光度。試驗(yàn)以相應(yīng)濃度的剛果紅溶液為空白。

1.3.4 測(cè)定條件的影響

所有測(cè)定的混合液中，β-葡聚糖和剛果紅終質(zhì)量濃度分別固定為8 μg/mL和50 μg/mL。

反應(yīng)溫度的影響：配制混合液于5～50 ℃條件下靜置30 min，在550 nm處測(cè)定吸光度，以相同反應(yīng)溫度的剛果紅溶液為空白。

離子濃度的影響：配制濃度為0～0.2 mol/L，pH值7.5的磷酸鹽緩沖液，將其作為溶劑配制剛果紅溶液。在550 nm處測(cè)定混合液吸光度，以相應(yīng)離子濃度的剛果紅溶液為空白。

緩沖液pH值的影響：配制0.1 mol/L pH值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，將其作為溶劑配制剛果紅溶液。于550 nm處測(cè)定混合液吸光度，以相應(yīng)pH值的剛果紅溶液為空白。

反應(yīng)時(shí)間的影響：配制混合液靜置0～60 min，在550 nm處測(cè)定吸光度，以相同濃度的剛果紅溶液為空白。

淀粉的影響：向混合體系中加入淀粉儲(chǔ)備液，使其中淀粉與β-葡聚糖濃度之比為0～100。于550 nm處測(cè)定吸光度，以相同濃度的剛果紅溶液為空白。

蛋白質(zhì)的影響：方法同淀粉的影響，蛋白質(zhì)與β-葡聚糖濃度之比為0～100。

光照的影響：將混合液分別在正常光照與避光條件下靜置30 min，在550 nm處測(cè)定吸光度。以相同條件下的剛果紅溶液為空白。每組均做5次平行試驗(yàn)。

1.3.5 精密度和加樣回收率試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)：方法同1.3.4光照條件的影響中正常光照條件組。

加樣回收率試驗(yàn)：取1 mL適當(dāng)稀釋的燕麥麩皮水提液，加入0～0.48 mL的燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水補(bǔ)足至2 mL，加入4 mL剛果紅溶液，于550 nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的剛果紅溶液為空白。

回收率=(C-A)/B×100%

式中：A為燕麥麩皮水提液所含β-葡聚糖量；B為標(biāo)準(zhǔn)β-葡聚糖加入量；C為加入標(biāo)準(zhǔn)β-葡聚糖后水提液所測(cè)β-葡聚糖量。

1.3.6 剛果紅和β-葡聚糖結(jié)合模型

ΔA=A-εFCT

(1)

Δε=εB-εF

(2)

n=ΔA/(ΔεCG)

(3)

ΔA=Δε(1+KCT)/K-ΔεN(CTΔε/ΔA-1)CG

(4)

式中：A為剛果紅與葡聚糖復(fù)合物的吸光度；εF為游離剛果紅的摩爾吸光系數(shù)；CT為溶液中剛果紅總的濃度；εB為結(jié)合到葡聚糖上剛果紅的摩爾吸光系數(shù)；n為平均每個(gè)β-葡聚糖分子上結(jié)合的剛果紅分子數(shù)；CG為溶液中β-葡聚糖的濃度；K為結(jié)合常數(shù)；N為溶液中每一個(gè)β-葡聚糖分子上的總的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

式(4)中，ΔεN是一個(gè)常數(shù)，Δε(1+KCT)/K是與試驗(yàn)中所用剛果紅濃度有關(guān)的常數(shù)。以(CTΔε/ΔA-1)CG為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)作圖，可得一線(xiàn)性方程。通過(guò)該線(xiàn)性方程的截距與斜率可求得結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

圖1中剛果紅質(zhì)量濃度為50 μg/mL，β-葡聚糖質(zhì)量濃度為8 μg/mL。由圖1可知，混合液的吸收光譜與剛果紅溶液的相比，發(fā)生了明顯紅移，在480～600 nm范圍內(nèi)吸光度明顯增加。由兩者的差譜可以看出，在波長(zhǎng)550 nm處存在吸光度的最大差值。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)不同剛果紅濃度，不同β-葡聚糖濃度混合液測(cè)得的吸收光譜，與相應(yīng)濃度的剛果紅吸收光譜比較起來(lái)，均在550 nm處有吸光度的最大差值，表明該波長(zhǎng)處?kù)`敏度最高，故選擇550 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 吸收光譜與吸收差譜

2.2 剛果紅濃度與β-葡聚糖線(xiàn)性范圍的確定

2.2.1 剛果紅濃度的確定

由圖2可以看出，在一定濃度的剛果紅溶液中，隨著葡聚糖濃度的增加，吸光度逐漸增加并趨于平穩(wěn)。含較高濃度剛果紅混合液的吸光度曲線(xiàn)位于含較低濃度剛果紅混合液吸光度曲線(xiàn)的上方。為了實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定，需要利用吸光度曲線(xiàn)的線(xiàn)性增加部分。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡聚糖質(zhì)量濃度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)，混合液的吸光度大致隨葡聚糖的濃度呈線(xiàn)性增加的趨勢(shì)。在這一線(xiàn)性范圍內(nèi)考察，對(duì)于相同濃度的葡聚糖溶液，當(dāng)剛果紅質(zhì)量濃度從30 μg/mL增加至50 μg/mL時(shí)，吸光度有所增加。進(jìn)一步增加剛果紅濃度，混合液吸光度基本保持不變，吸光度曲線(xiàn)接近重合，可認(rèn)為此時(shí)β-葡聚糖上的可結(jié)合位點(diǎn)基本都被剛果紅分子占據(jù)，因此當(dāng)剛果紅質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時(shí)吸光度不再增加。不同剛果紅濃度下，葡聚糖質(zhì)量濃度為0～10 μg/mL的線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)的斜率見(jiàn)表1，由表1可見(jiàn)當(dāng)剛果紅質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時(shí)回歸曲線(xiàn)的斜率基本保持不變且維持在0.031左右，說(shuō)明在此濃度時(shí)測(cè)定的靈敏度達(dá)到最大且基本不再隨剛果紅濃度而增加。綜合考慮選擇剛果紅終質(zhì)量質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

圖2 剛果紅濃度對(duì)復(fù)合物測(cè)定的影響

剛果紅質(zhì)量濃度/μg/mL3040506070葡聚糖在0～10μg/mL范圍斜率0.0210.0250.0310.0310.032

2.2.2 β-葡聚糖線(xiàn)性范圍的確定

將圖2中50 μg/mL的剛果紅吸光度曲線(xiàn)單獨(dú)繪制，如圖3所示。由圖3可以看出，復(fù)合物的吸光度與β-葡聚糖質(zhì)量濃度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖3 β-葡聚糖質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合物測(cè)定的影響

2.3 測(cè)定條件的影響

2.3.1 反應(yīng)溫度的影響

由圖4a可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增大，吸光度呈現(xiàn)先穩(wěn)定不變后減小的趨勢(shì)。其中5～35 ℃時(shí)，吸光度基本穩(wěn)定；35 ℃以上，吸光度顯著減小。推測(cè)反應(yīng)溫度高于35 ℃時(shí)，剛果紅分子與β-葡聚糖之間的氫鍵作用力遭到破壞，不利于復(fù)合物的形成?？紤]到實(shí)際的實(shí)驗(yàn)情況，反應(yīng)溫度選擇在室溫下即可。

2.3.2 離子濃度的影響

因圖4b采用對(duì)數(shù)坐標(biāo)，故不包括離子濃度為0時(shí)的吸光度0.020?？梢钥闯?，隨著離子濃度的增加，吸光度先顯著增加然后明顯減小。當(dāng)離子濃度達(dá)到0.05 mol/L時(shí)，吸光度達(dá)到最大。離子濃度0.1 mol/L和0.05 mol/L時(shí)的吸光度基本相等。離子濃度較小時(shí)，因?yàn)樯倭繋ж?fù)電荷的剛果紅分子與β-葡聚糖結(jié)合使β-葡聚糖分子帶負(fù)電荷，影響了更多剛果紅分子結(jié)合到β-葡聚糖上，所以此時(shí)混合液的吸光度較小。隨著離子濃度的增加，部分剛果紅分子的負(fù)電荷被屏蔽，減少了剛果紅分子與β-葡聚糖分子間的靜電斥力，有利于更多的剛果紅與β-葡聚糖結(jié)合形成復(fù)合物，故吸光度增加。當(dāng)離子濃度過(guò)大時(shí)，剛果紅分子負(fù)電荷被屏蔽程度進(jìn)一步增大，促使其自身聚集程度增加，所形成的剛果紅聚集體難以結(jié)合到β-葡聚糖分子上，減少了復(fù)合物的形成，故吸光度又減小。考慮到0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖能力較強(qiáng)，選擇離子濃度為0.1 mol/L。

圖4 測(cè)定條件的影響

2.3.3 緩沖液pH值的影響

由圖4c可以看出，隨著緩沖液pH值的增大，吸光度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為7.5時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。推測(cè)在該pH條件下，剛果紅分子與β-葡聚糖能較好的結(jié)合形成深紅色的復(fù)合物，故選擇緩沖液pH值7.5。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖4c可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光度不斷增加。其中0～10 min范圍內(nèi)，吸光度顯著增加；10～20 min范圍內(nèi)，吸光度緩慢增加；30 min以后，吸光度基本穩(wěn)定。推測(cè)剛果紅分子結(jié)合到葡聚糖分子上形成復(fù)合物是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，此過(guò)程達(dá)到平衡需要一定的時(shí)間，在試驗(yàn)條件下，經(jīng)30 min基本達(dá)到平衡。故選擇反應(yīng)時(shí)間為30 min，以獲得較為穩(wěn)定的吸光度值。

2.3.5 淀粉的影響

因圖4d采用對(duì)數(shù)坐標(biāo)，故不包括未添加淀粉時(shí)的吸光度0.257。可以看出，當(dāng)?shù)矸叟c葡聚糖濃度比值小于10時(shí)，吸光度基本穩(wěn)定，比值大于10時(shí)，吸光度明顯減小。這可能是因?yàn)樵诤^高淀粉濃度的溶液中，淀粉與剛果紅相互作用，形成了類(lèi)似碘與淀粉所形成的包合物，阻礙了剛果紅分子與葡聚糖分子的結(jié)合，造成了吸光度的降低。但是，剛果紅與淀粉間的結(jié)合作用較弱，因此，當(dāng)體系中淀粉濃度較低時(shí)，對(duì)吸光度影響較小。由圖4d可見(jiàn)，當(dāng)?shù)矸叟c葡聚糖濃度比值小于10時(shí)，淀粉對(duì)測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量幾乎沒(méi)有影響。

2.3.6 蛋白質(zhì)的影響

因圖4d采用對(duì)數(shù)坐標(biāo)，故不包括未添加蛋白質(zhì)時(shí)的吸光度0.256?？梢钥闯?，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與葡聚糖濃度比值小于5時(shí)，吸光度基本穩(wěn)定，比值大于5時(shí)，吸光度下降明顯。這可能是因?yàn)檩^高濃度蛋白質(zhì)溶液中，蛋白質(zhì)與剛果紅發(fā)生了結(jié)合，從而影響了剛果紅與葡聚糖分子的結(jié)合[18-19]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與葡聚糖濃度比值小于5時(shí)，蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量幾乎沒(méi)有影響。

2.3.7 光照的影響

因?yàn)楣庹湛赡軙?huì)使剛果紅分子發(fā)生順?lè)串悩?gòu)變化，從而可能影響剛果紅與β-葡聚糖的結(jié)合，所以分別在正常光照條件和避光條件下進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。由表2可以看出，正常光照條件和避光條件下，在550 nm處5次重復(fù)試驗(yàn)的平均吸光度基本相同。因此，認(rèn)為光照對(duì)測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量沒(méi)有影響。

表2 光照對(duì)復(fù)合物測(cè)定的影響

2.4 精密度和加樣回收率試驗(yàn)

2.4.1 精密度試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)同一濃度β-葡聚糖的多次測(cè)定來(lái)檢驗(yàn)分光光度法的精密度。由表2正常光照組可以看出，5次試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好，RSD=0.78%，表明分光光度法測(cè)定β-葡聚糖含量有較高的精密度。

表3 加樣回收率試驗(yàn)

2.4.2 加樣回收率試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)已知濃度β-葡聚糖的測(cè)定，來(lái)檢驗(yàn)分光光度法的準(zhǔn)確度。由表3可以看出，試驗(yàn)結(jié)果平均回收率為101.32%，表明分光光度法測(cè)定β-葡聚糖含量有較高的準(zhǔn)確度。

2.5 剛果紅和β-葡聚糖結(jié)合模型

圖5 ΔA～(CTΔε/ΔA-1)CG×10-9

3 結(jié)論

室溫條件下，剛果紅質(zhì)量濃度50 μg/mL，pH 7.5，反應(yīng)時(shí)間30 min，磷酸鹽緩沖液離子濃度0.1 mol/L時(shí)，吸光度與β-葡聚糖質(zhì)量濃度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)具有線(xiàn)性關(guān)系。光照對(duì)分光光度法測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量無(wú)影響，較低濃度的共存淀粉和蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定影響較小。在試驗(yàn)條件下，剛果紅與燕麥β-葡聚糖的結(jié)合常數(shù)K為4.08×106、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N為336、平均結(jié)合數(shù)n為297。剛果紅分光光度法測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量有較好的精密度和準(zhǔn)確度。因此，在一定條件下，剛果紅分光光度法能較好的測(cè)定燕麥β-葡聚糖的含量。

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Quantification of Oat β-Glucan by Spectrophotometry

Zhang Ru Dai Qiaoling Wu Xiaoyan Li Linlin Chen Yuansheng Wu Jia

(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116)

Spectrophotometry was used to determine the content of oat β-glucan. The effects of some factors were investigated, including the concentration of Congo red and oat β-glucan, reaction temperature, pH, reaction time, ion concentration, exposure to light, and the starch and protein coexisting in the system. The binding equilibrium constant K, the total number of binding sites per β-glucan molecule N, and the binding number of Congo red per β-glucan molecule n were determined by chemometrics based on the analysis of ultraviolet-visible absorption spectra. The results showed that the absorbency had a linear relationship with β-glucan in the concentration from 0 to 10 μg/mL under the condition that room temperature, Congo red concentration 50 μg/mL, pH 7.5, reaction for 30 min, and ion concentration 0.1 mol/L. Exposure to light had no effect on the determination. Starch and protein had a relatively low effect on the absorbency. The binding equilibrium constant K, binding sites N and average binding numbernare 4.08×106, 336 and 297, respectively under the experimental conditions.

oat,β-glucan,congo red,spectrophotometry,binding model

TS201.2

A

1003-0174(2016)06-0140-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101224)，福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013J05049)

2014-09-24

張如，男，1989年出生，碩士，食品工程

吳佳，男，1980年出生，副教授，食品化學(xué)