杜 昆 李 琦

(湖北省荊州市第一人民醫(yī)院檢驗科，荊州434000)

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IFN-β對沙眼衣原體感染的影響①

杜 昆 李 琦②

(湖北省荊州市第一人民醫(yī)院檢驗科，荊州434000)

目的：研究IFN-β在沙眼衣原體感染細胞中的表達及其對衣原體感染的影響。方法：采用ELISA雙抗體夾心法檢測衣原體感染細胞培養(yǎng)上清中IFN-β的表達，利用抗人IFN-β抗體中和IFN-β的作用，然后分別用Western blot和免疫熒光技術檢測沙眼衣原體感染后衣原體主要外膜蛋白、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白和衣原體二次感染滴度變化。結(jié)果：沙眼衣原體能誘導宿主細胞表達IFN-β、STAT1蛋白和p-STAT1蛋白，抑制IFN-β的作用能下調(diào)STAT1和p-STAT1蛋白表達，同時促進衣原體生長和提高衣原體的二次感染滴度。結(jié)論：沙眼衣原體感染能通過誘導宿主細胞分泌IFN-β并上調(diào)和活化STAT1蛋白而抑制衣原體生長。

沙眼衣原體；β干擾素；感染

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是一種嚴格細胞內(nèi)寄生的病原菌，可引起人類多種疾病，是沙眼和性傳播性疾病的常見病原體，還可導致異位妊娠、早產(chǎn)、不孕等并發(fā)癥[1-3]。此外，Ct與HIV的感染和腫瘤的發(fā)病也有著密切的關系[4-6]。Ct感染人體后，可逃避機體的免疫應答，造成持續(xù)性感染。因此，研究機體抗Ct感染的免疫機制具有重要的臨床意義。干擾素具有抑制胞內(nèi)病原微生物感染和復制的作用，主要包括Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和Ⅱ型干擾素(IFN-γ)。IFN-γ對Ct生長的影響報道較多[7-9]，而IFN-β在Ct感染過程中的作用報道較少。本課題旨在探討IFN-β在Ct感染細胞中的表達及其對Ct生長的影響，為防治Ct感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 沙眼衣原體L2血清型和HeLa細胞均由中南大學余平教授惠贈；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；人IFN-β ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；放線菌酮購自Invitrogen公司；兔抗人IFN-β、STAT1和p-STAT1抗體、羊抗MOMP抗體購自Santa Cruz公司；HRP標記的二抗購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和Ct增殖 將HeLa細胞接種到50 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長成75%融合后，棄培養(yǎng)基，加衣原體懸液，2 h后棄上清，加生長液(含10%胎牛血清和2 mg/L放線菌酮)繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細胞并重懸細胞沉淀，37℃水浴與-80℃反復凍融3次，1 000 r/min離心8 min，上清即為衣原體懸液，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Ct感染 按方法1.2.1培養(yǎng)細胞，然后按照不同實驗要求加入不同量的Ct懸液，同時加入或不加入100 μg/ml青霉素或60 μg/ml氯霉素，于不同時間點吸取上清，試劑盒檢測上清IFN-β含量。

1.2.3 ELISA雙抗體夾心法檢測IFN-β 用人IFN-β ELISA試劑盒檢測IFN-β。步驟如下：將標準品、待測樣本各100 μl加入到預先包被有人IFN-β多克隆抗體的酶標板中，37℃孵育1 h，洗滌5次，每次1 min；加入酶標二抗100 μl，37℃孵育1 h，洗滌5次，每次1 min；加入底物A、B，37℃避光孵育30 min，加終止液50 μl終止反應，450 nm波長下測定各孔OD值，根據(jù)標準品OD值制備標準曲線，根據(jù)標準曲線和待測樣本OD值計算待測樣本中人IFN-β含量。

1.2.4 Western blot實驗 在6孔板中制備單層HeLa細胞，加入抗人IFN-β抗體，然后加入衣原體懸液，培養(yǎng)48 h后提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度，以每孔 80 μg樣本上樣電泳，轉(zhuǎn)膜；室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3次，每次5 min，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min，室溫孵育HRP標記的二抗2 h，ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶。

1.2.5 Ct二次感染滴度的測定 按文獻[10]測定Ct二次感染滴度，主要步驟如下：在培養(yǎng)的單層HeLa細胞中加入抗人IFN-β抗體和衣原體懸液，感染48 h后收集衣原體；將收集的衣原體作系列稀釋后接種到預先放有玻片的24孔板HeLa細胞中，每個稀釋度設3個復孔；感染48 h后取出玻片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%曲拉通透化4 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，羊抗MOMP抗體4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標記的二抗室溫孵育1 h，封片，鏡下觀察。高倍鏡下隨機取5個視野共200個細胞進行包涵體記數(shù)，計算每孔平均包涵體數(shù)(IFU)及Ct原液中Ct濃度(IFU/ml=平均每孔包涵體數(shù)×稀釋倍數(shù)/Ct接種量)。

2 結(jié)果

2.1 Ct感染細胞IFN-β表達上調(diào) Ct感染細胞后，于不同時間點檢測IFN-β。結(jié)果如圖1所示，感染0 h IFN-β表達量較低，為6.89 pg/ml；而感染后6、12、24、36和48 h IFN-β表達量分別為46.32、98.51、139.65、201.21和226.78 pg/ml，呈現(xiàn)出隨著感染時間延長，IFN-β表達量逐漸增多，且與0 h比較，IFN-β表達變化均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 Ct的生長促進IFN-β表達 圖2A所示，未感染Ct細胞 (0 h) IFN-β表達量較低，為7.06 pg/ml；而0.5、1.0、 1.5和3.0 MOI感染細胞IFN-β表達量分別為58.97、89.78、128.79和198.65 pg/ml，與未感染細胞比較，IFN-β表達變化均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖2B所示，Ct感染細胞IFN-β表達量為216.38 pg/ml，在青霉素作用下的Ct感染細胞IFN-β表達量為205.68 pg/ml，二者比較，IFN-β表達變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在氯霉素作用下的Ct感染細胞IFN-β表達量為20.21 pg/ml，與單純Ct感染細胞比較，IFN-β表達變化有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 加入抗IFN-β抗體促進衣原體生長 圖3A所示，Ct感染細胞可檢測到MOMP蛋白表達(第2道)，加入抗IFN-β抗體后，MOMP蛋白表達量明顯增多(第3道)。圖3B所示，未加抗IFN-β抗體時，Ct二次感染滴度為6.8 IFU/ml(log10)，而分別加入5、10和20 μg/ml抗IFN-β抗體時，Ct二次感染滴度為8、10.1和12.3 IFU/ml(log10)，與未加抗IFN-β抗體感染細胞比較，Ct二次感染滴度變化有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 Ct感染HeLa細胞IFN-β表達Fig.1 Expression of IFN-β in Ct-infected HeLa cells

圖2 Ct的生長促進IFN-β表達Fig.2 Ct growth promote expression of IFN-β

圖3 抗IFN-β抗體促進衣原體生長Fig.3 Anti-IFN-β antibody promote Ct growth

圖4 抑制STAT1蛋白表達與活化促進衣原體生長Fig.4 Inhibition of STAT1 expression and activity promote Ct growth

2.4 Ct感染細胞通過誘導IFN-β分泌上調(diào)并活化STAT1蛋白 圖4所示，與正常細胞對照組相比，Ct感染細胞STAT1和p-STAT1蛋白表達明顯上調(diào)(第2道)，加入抗IFN-β抗體后，STAT1和p-STAT1蛋白表達量明顯減少，同時MOMP蛋白表達量明顯增多(第3道)。外源性IFN-β單獨作用于HeLa細胞，STAT1和p-STAT1蛋白表達也明顯增多(第4道)。

3 討論

衣原體感染可誘導宿主發(fā)生免疫應答，主要以巨噬細胞和T細胞介導的細胞免疫為主。致敏的CD4+T細胞能釋放多種細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10[11，12]，同時能激活巨噬細胞，從而抑制衣原體的增殖。其中IFN-γ是機體抗衣原體感染的一個重要的細胞因子，它可以通過誘導宿主細胞產(chǎn)生NO[9]，而NO作為一種免疫效應分子可介導細胞毒作用而抑制或殺死細胞內(nèi)寄生物。有文獻報道，Ct感染后也可誘導宿主細胞產(chǎn)生IFN-β[13，14]，但IFN-β在宿主防御Ct感染中的作用并不十分清楚。

本研究中，我們利用Ct L2血清型感染HeLa細胞，ELISA雙抗體夾心法檢測Ct感染細胞培養(yǎng)上清中是否含有IFN-β。結(jié)果證實，Ct感染不但能誘導宿主細胞產(chǎn)生IFN-β，并且隨著感染時間的延長，IFN-β表達量也逐漸增多，表明Ct感染能誘導宿主細胞表達IFN-β。為進一步證實Ct的生長與IFN-β表達的關系，我們用不同劑量的Ct感染細胞，結(jié)果表明隨著感染劑量的增加，IFN-β的表達也逐漸增多；此外，我們進一步用100 μg/ml青霉素和60 μg/ml氯霉素的作用于Ct感染細胞，然后檢測IFN-β表達，結(jié)果證實青霉素并不影響Ct感染細胞IFN-β的表達，而氯霉素能明顯減少感染細胞IFN-β的表達。雖然青霉素能抑制衣原體RB復制和RB向EB的轉(zhuǎn)化，但不影響衣原體蛋白合成，而氯霉素能抑制衣原體蛋白合成，表明IFN-β表達依賴于Ct生長。

為研究IFN-β對Ct生長的影響，我們事先在Ct感染之前加入抗人IFN-β抗體，以中和Ct感染誘導產(chǎn)生的IFN-β作用，然后用兩個不同的實驗證實IFN-β對Ct的生長影響。首先，我們檢測當IFN-β作用被抗體中和后MOMP表達情況，因為MOMP是衣原體菌體蛋白，能很好反映Ct的生長情況，結(jié)果表明當IFN-β作用被抗體中和后，MOMP蛋白的表達量增多；其次，通過檢測Ct的二次感染滴度，進一步證實了IFN-β作用被抗體中和后對Ct活性的影響，結(jié)果表明隨著抗人IFN-β抗體濃度的逐漸增加，Ct二次感染滴度也逐漸升高，未加抗人IFN-β抗體時，其感染滴度最低，結(jié)果證實IFN-β具有抑制體外Ct生長的作用。由于IFN-β可以影響細胞多個基因表達，如IFN-β可以上調(diào)人成纖維細胞STAT1、STAT2和IRF9蛋白表達[15]。Lad等[14]報道衣原體感染細胞能通過上調(diào)STAT1蛋白表達而抑制衣原體生長，而有活性的STAT1蛋白以磷酸化形式存在。為證實IFN-β對Ct生長抑制作用是否與STAT1和p-STAT1蛋白表達有關，我們檢測了沙眼衣原體感染細胞STAT1 和p-STAT1蛋白表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ct感染細胞STAT1和 p-STAT1蛋白表達明顯上調(diào)，加入抗IFN-β抗體后，STAT1和 p-STAT1蛋白表達量明顯減少，同時MOMP蛋白表達量明顯增多。外源性IFN-β單獨作用于HeLa細胞，STAT1和 p-STAT1蛋白表達也明顯增多。以上研究結(jié)果表明，沙眼衣原體感染細胞可能主要通過誘導IFN-β分泌并上調(diào)和活化STAT1蛋白而抑制衣原體生長。

綜上所述，Ct感染細胞不但能表達IFN-β，而且能通過IFN-β誘導STAT1蛋白表達而抑制Ct的增殖，這可能是宿主細胞防御Ct感染的機制之一。

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[收稿2016-01-12 修回2016-02-12]

(編輯 許四平)

Effect of IFN-β on Chlamydia trachomatis infection

DU Kun, LI Qi.

Department of Clinical Laboratory,the First People′s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China

Objective:To investigate the expression of IFN-β in Chlamydia trachomatis-infected cells and the effect of IFN-β on Chlamydia trachomatis infection. Methods: IFN-β was examined in Chlamydia trachomatis-infected cells culture supernatant with ELISA double antibody sandwich method.Chlamydia trachomatis major outer membrane protein,STAT1 protein and p-STAT1 and infectious titers were detected by using Western blot and immunofluorescence assays,respectively,after the IFN-β was neutralized by IFN-β antibody. Results: Chlamydia trachomatis infection could induce IFN-β and STAT1 protein and p-STAT1 expression.Inhibition the activity of IFN-β could down-regulated the expression of STAT1 and p-STAT1 protein,moreover,promotes Chlamydia trachomatis growth and secondary infectious titers.Conclusion: Chlamydia trachomatis growth were inhibited by IFN-β in a STAT1-dependent fashion in infected cells.

Chlamydia trachomatis;IFN-β;Infection

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.020

杜 昆(1972年-)，男，博士，副主任技師，主要從事抗感染免疫方面的研究。

R374+1

A

1000-484X(2016)11-1657-04

①本文為湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才項目(QJX 2012-46)。

②通訊作者，E-mail: liqijzhyy@163.com。