王翠喆 哈曉丹 謝建新 許 彭 李 偉 張 君

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832000)

?

KLF9和KLF15在維吾爾族網(wǎng)膜脂肪中的表達(dá)及其與炎癥相關(guān)性分析①

王翠喆 哈曉丹 謝建新 許 彭 李 偉②張 君

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832000)

目的：檢測維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織KLF9及KLF15 mRNA表達(dá)水平，分析KLF9、KLF15與炎癥信號通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性。方法：選取維吾爾族個體NC組50例、OB組45例，檢測一般資料和生化指標(biāo)。采集網(wǎng)膜脂肪組織，RT-PCR法檢測KLF9、KLF15及NF-κB炎癥信號通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：OB組BMI、WC、HC、WHR、TG和LDL顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織中，OB組NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05)，NF-κB mRNA表達(dá)與體重和TG顯著正相關(guān)(P<0.05)，TNF-α mRNA表達(dá)與TG和TC顯著正相關(guān)(P<0.05)，IL-6 mRNA表達(dá)與HC、TG和LDL顯著正相關(guān)(P<0.05)；OB組網(wǎng)膜脂肪組織KLF15 mRNA表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05)，與BMI、WC、WHR顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與HDL正相關(guān)，與TG負(fù)相關(guān)。KLF9 mRNA表達(dá)水平高于NC組，與NF-κB顯著正相關(guān)(P<0.01)，與IL-6正相關(guān)。結(jié)論：KLF15可能通過調(diào)控脂代謝發(fā)揮抗炎作用；肥胖狀態(tài)下脂代謝紊亂可能間接上調(diào)KLF9的表達(dá)，而KLF9作為轉(zhuǎn)錄激活因子可能通過調(diào)控下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進炎癥因子的表達(dá)和釋放。

維吾爾族；網(wǎng)膜脂肪組織；KLF9；KLF15；炎癥

肥胖已成為世界性的健康問題。當(dāng)前認(rèn)為，肥胖是一種慢性炎癥狀態(tài)，該狀態(tài)與肥胖發(fā)生時脂肪細(xì)胞的脂解增加、血液游離脂肪酸水平(Free fatty acid,FFA)升高密切相關(guān)[1]，并且可以誘發(fā)多種慢性疾病。脂肪組織作為全身炎癥反應(yīng)的始發(fā)部位，在機體能量代謝的調(diào)節(jié)方面起重要作用，但肥胖啟動炎癥發(fā)生的具體分子機制并不十分明確。

Kruppel 樣因子(Kruppel-like factors,KLFs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,其典型結(jié)構(gòu)特征是在其羧基端具有3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)[2]，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化和胚胎發(fā)育等多個生命活動的調(diào)控。有文獻報道， KLF9和KLF15在調(diào)控脂代謝過程中發(fā)揮重要作用，而脂代謝紊亂是引發(fā)炎癥的關(guān)鍵因素[3，4]。因此，KLF9和KLF15可能參與脂肪組織炎癥反應(yīng)。

為此，本研究采集維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織，檢測KLF9及KLF15 mRNA表達(dá)水平，分析KLF9、KLF15與炎癥信號通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性，為闡明肥胖始動炎癥的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2012年10～12月及2013年4～9月新疆喀什地區(qū)人民醫(yī)院腹部擇期手術(shù)的維吾爾族個體95例，手術(shù)前收集一般資料；檢測血糖、血脂水平。將研究對象分為正常(Normal control,NC) 組(18.5 kg/m2≤BMI≤24 kg/m2) 50例、肥胖(Obesity,OB)組(BMI≥28 kg/m2) 45例。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病(Diabetes mellitus,DM)、腫瘤、急性炎癥、肝腎疾病及近期服用可能干擾糖脂代謝藥物者。本研究方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(No.2014LL22)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集 各組于手術(shù)前1 d測量腰圍(Waist circumference ,WC)、臀圍(Hip circum-ference,HC)、腰臀比(Waist-to-hip ratio,WHR)、收縮壓(Systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(Diastolic blood pressure,DBP)、體質(zhì)指數(shù)(Body mass index,BMI)。手術(shù)當(dāng)日開腹后嚴(yán)格無菌操作取網(wǎng)膜脂肪組織，約3 cm×3 cm，液氮凍存，標(biāo)記住院號、姓名、性別。

1.2.2 生化指標(biāo)測定 葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)、總膽固醇(Total cholesterol ,TC)、甘油三酯(Triglyceride ,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein ,HDL)和低密度脂蛋白(Low density lipoprotein ,LDL)均用全自動生化分析儀檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平 取脂肪組織300 mg，Trizol法提取網(wǎng)膜脂肪組織總RNA[5]，實時定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)檢測mRNA表達(dá)水平。實時定量PCR儀購自美國ABI公司，型號ABI7500 Fast。PCR反應(yīng)體系為20 μl：RNase-free水7 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，SYBR Select Master Mix 10 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件為：經(jīng)94℃ 30 s預(yù)變性后，95℃變性5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。擴增引物序列及目的片段長度見表1。表達(dá)量以目的基因與內(nèi)參GAPDH比值表示，內(nèi)參GAPDH拷貝數(shù)為1。

表1 各引物序列

Tab.1 All kinds of primer sequences

GeneSequenceIDPrimernamePrimer(5′?3′)Fragment(bp)KLF9NM＿0012062KLF9?FTGGCTGTGGGAAAGTCTATGG124KLF9?RCTCGTCTGAGCGGGAGAACTKLF15XM＿0052474002KLF15?FGGTACGGCTTCACACCTGAG150KLF15?RACACCAAAAGCAGCCACCTNF?κBXM＿0115320091NF?κB?FCTGAGTCCTGCTCCTTCCA103NF?κB?RCTTCGGTGTAGCCCATTTGTTNF?αNM＿0005943TNF?α?FGTGACAAGCCTGTAGCCCAT111TNF?α?RTATCTCTCAGCTCCACGCCAIL?6XM＿0115153901IL?6?FCCTTCGGTCCAGTTGCCTTC105IL?6?RGTGGGGCGGCTACATCTTTGGAPDHNM＿0012567991GAPDH?FGGTGGTCTCCTCTGACTTCAA211GAPDH?RTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCT

2 結(jié)果

2.1 一般資料及生化指標(biāo)比較 OB組體質(zhì)量、WC、HC、WHR、BMI、TG和LDL顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.2 網(wǎng)膜脂肪組織炎癥信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平 在網(wǎng)膜脂肪組織中，OB組KLF9 mRNA表達(dá)水平高于NC組；NF-κB、TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05)；而OB組KLF15mRNA表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05),見圖1。

表2 各組一般資料和生化指標(biāo)比較

Tab.2 Comparison of data and biochemical indicators of two groups

TestingindexNCOBCasenumber5045Age4742±17394594±1001Weight(kg)6308±7747996±11102)WC(cm)8962±152911242±8562)HC(cm)9340±86410623±18232)WHR096±016107±0082)BMI2292±2543156±3132)SBP(mmHg)12052±226112974±2095DBP(mmHg)8028±15208282±1417FPG(mmol/L)50±085500±072TG(mmol/L)260±143376±1892)TC(mmol/L)487±120508±103LDL(mmol/L)264±080302±0771)HDL(mmol/L)122±047145±080

Note：ttest,1)P<0.05,2)P<0.01 the difference between NC and OB group was statistically significant.

圖1 炎癥信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平Fig.1 Key gene mRNA expression level of inflammatory signaling pathwaysNote: t test.*.P<0.05,**.P<0.01 the difference between NC and OB group was statistically significant.

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 一般資料和生化指標(biāo)與炎癥因子相關(guān)性分析 維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織NF-κB mRNA表達(dá)與體重和TG顯著正相關(guān)(P<0.05)；TNF-α mRNA表達(dá)與TG和TC顯著正相關(guān)(P<0.05)；IL-6 mRNA表達(dá)與HC、TG和LDL顯著正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.3.2 KLF9與炎癥因子相關(guān)性分析 在網(wǎng)膜脂肪組織中，KLF9 mRNA表達(dá)與NF-κB顯著正相關(guān)(P<0.01)，與IL-6正相關(guān)，見圖2。

2.3.3 一般資料和生化指標(biāo)與KLF15相關(guān)性分析 在網(wǎng)膜脂肪組織中，KLF15 mRNA表達(dá)與BMI、WC、WHR顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與HDL正相關(guān)，與TG負(fù)相關(guān)，見圖3。

表3 一般資料和生化指標(biāo)與炎癥因子相關(guān)性

Tab.3 Correlation of general data,biochemical indexes and inflammatory factor

CorrelationNF?κBrPTNF?αrPIL?6rPBMI021200540173011601770117Weight02391)00300162014201710129WC018800890051064602110060HC021600500191008202751)0013WHR01090355-0135022400960428TG02581)002602281)003803422)0004TC0124031702291)004701900136HDL-0209007400990371-00790517LDL009804050162014403001)0012

Note：Pearson analysis,1)P<0.05,2)P<0.01 the correlation between general data，biochemical indexes and the mRNA expression level of inflammatory factor has statistical significance.

圖2 KLF9與炎癥信號通路關(guān)鍵因子相關(guān)性Fig.2 Correlation of KLF9 and inflammatory signaling pathways critical factors Note: Pearson analysis,the correlation between the two factors has statistical significance.

圖3 一般資料和生化指標(biāo)與KLF15相關(guān)性Fig.3 Correlation of general data,biochemical indicators and KLF15Note: Pearson analysis,the correlation between the two factors has statistical significance.

3 討論

肥胖是一種慢性炎癥狀態(tài)，與多種代謝紊亂密切相關(guān)，包括胰島素抵抗和2型糖尿病[5]。肥胖導(dǎo)致的脂代謝紊亂是引發(fā)炎癥的關(guān)鍵，而其具體機制并不十分明確。有研究報道，新疆地區(qū)哈薩克族和維吾爾族人群超重或腹型肥胖的患病率均已超過40%，且顯著高于漢族人群[6]。在相同的BMI水平下，維吾爾族個體腰臀比和糖尿病的患病率顯著高于哈薩克族個體[7]。此外，維吾爾族有更多的網(wǎng)膜脂肪，而哈薩克族個體有更多的皮下脂肪[7]。腹型肥胖個體更容易患糖尿病和心血管疾病等慢性代謝性疾病[8]。因此，本研究采集維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織，檢測KLF9、KLF15及炎癥信號通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平，分析KLF9、KLF15與炎癥相關(guān)性。

在骨骼肌細(xì)胞中，KLF15調(diào)控脂的攝取和利用。在脂肪細(xì)胞中，TNF-α能夠顯著降低KLF15的表達(dá)水平，并且干擾KLF15后能夠顯著抑制抗炎性脂肪細(xì)胞因子Adipolin的表達(dá)水平[3]。最新研究報道，在小鼠頸總動脈原位移植和飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型中，KLF15能抑制依賴P300的P65活性，減弱P65與MCP-1和VCAM-1啟動子區(qū)的結(jié)合能力，從而發(fā)揮抗炎的作用[9]。本研究結(jié)果表明，OB組KLF15 mRNA表達(dá)水平顯著低于NC組，而炎癥因子NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組，提示KLF15可能發(fā)揮抗炎作用。相關(guān)性分析結(jié)果表明，KLF15與BMI、WC和WHR均顯著正相關(guān)，與HDL正相關(guān)，與TG負(fù)相關(guān)，KLF15與炎癥因子NF-κB、TNF-α及IL-6則無顯著相關(guān)性，而血脂代謝異常與網(wǎng)膜脂肪組織炎癥因子mRNA水平顯著正相關(guān)。以上結(jié)果提示，肥胖狀態(tài)下，KLF15的表達(dá)抑制可能導(dǎo)致了脂代謝紊亂，繼而促進了脂肪組織炎癥因子的表達(dá)和釋放。而肥胖狀態(tài)下KLF15表達(dá)抑制的具體機制有待進一步研究。

KLF9最初發(fā)現(xiàn)與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)，既有轉(zhuǎn)錄抑制活性，又具有轉(zhuǎn)錄激活活性[10]。但KLF9與脂肪組織炎癥的關(guān)系尚未報道。有文獻表明，在巨噬細(xì)胞中KLF9能夠抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的抗炎性因子KLF2的表達(dá)水平[10]。本研究結(jié)果表明，維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織OB組KLF9 mRNA表達(dá)水平高于NC組，且KLF9與炎癥因子NF-κB和IL-6正相關(guān)。此外，KLF9與血脂水平并無顯著相關(guān)性，與KLF15恰好相反。提示，肥胖狀態(tài)下脂代謝紊亂可能間接上調(diào)KLF9的表達(dá)，而KLF9作為轉(zhuǎn)錄激活因子可能通過調(diào)控下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進炎癥因子的表達(dá)和釋放。TLRs樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，在先天性免疫反應(yīng)的炎癥信號通路中有重要作用，而脂肪細(xì)胞炎癥因子的釋放與FFA水平升高導(dǎo)致的TLRs/NF-κB 信號通路激活有關(guān)[11]。在肥胖始動炎癥過程中，是否高的血脂水平通過影響TLR4信號通路，進而促進KLF9的表達(dá)有待進一步研究。

綜上所述，KLF15可能通過調(diào)控脂代謝發(fā)揮抗炎作用；肥胖狀態(tài)下脂代謝紊亂可能間接上調(diào)KLF9的表達(dá)，而KLF9作為轉(zhuǎn)錄激活因子可能通過調(diào)控下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進炎癥因子的表達(dá)和釋放。

[1] Chathyan P,Clifford JB,Helen RG.Aging,adipose tissue,fatty acids and inflammation[J].Biogerontology,2015,16(2):235-248.

[2] Bieker JJ.Krüppel-like factors:three fingers in many pies[J].J BioChem,2001,276(37):34355-34358.

[3] Enomoto T,Ohashi K,Shibata R,etal.Transcriptional regulation of an insulin-sensitizing adipokine adipolin/CTRP12 in adipocytes by Krüppel-like factor 15[J].PLoS One,2013,8(12):e83183.

[4] McConnell BB,Yang VW.Mammalian Krüppel-like factors in health and diseases[J].Physiol Rev,2010,90(4):1337-1381.

[5] 張宏武，蔣 升，徐焱成.新疆維吾爾族、哈薩克族和漢族糖尿病前期人群血清尿酸及代謝綜合征分布的橫斷面研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2013，34(10)：958-960.

[6] 周 玲,李南方,洪 靜,等.新疆維漢哈三民族人群肥胖的流行病學(xué)調(diào)查研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2011,12(2):139-142.

[7] Zhang J,Zhang Z,Ding Y,etal.Adipose tissues characteristics of normal,obesity,and type 2 diabetes in uygurs population[J].J Diabetes Res,2015，2015:905042.

[8] Ruixing Y,Qiming F,Dezhai Y,etal.Comparison of demography,diet,lifestyle,and serum lipid levels between the Guangxi Bai Ku Yao and Han populations[J].J Lipid Res,2007,48(12):2673-2681.

[9] Lu Y,Zhang LS,Liao XD.Kruppel-like factor 15 is critical for vascular inflammation[J].J Clin Invest,2013,123(10):4232-4241.

[10] Chinenov Y,Coppo M,Gupte R,etal.Glucocorticoid receptor coordinates transcription factor-dominated regulatory network in macrophages[J].BMC Genomics,2014,15:656.

[11] Menghini R,Campia U,Tesauro M,etal.Toll-like receptor 4 mediates endothelial cell activation through NF-κB but is not associated with endothelial dysfunction in subjects with rheumatoid arthritis[J].PLoS One,2014,9(6):e99053.

[收稿2015-12-28]

(編輯 倪 鵬)

KLF9,KLF15 expression in omental adipose tissue and correlation with inflammatory of an Uygur population

WANG Cui-Zhe,HA Xiao-Dan,XIE Jian-Xin,XU Peng,LI Wei,ZHANG Jun.

The Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Medical College of Shihezi University,Shihezi 832000,China

Objective:To detect KLF9 and KLF15 mRNA expression of the omental adipose tissue,and analyze the relationship between KLF9,KLF15 and inflammatory in an Uygur population.Methods: The Uygur subjects were selected and divided into NC group (n=50) and OB group (n=45).The mRNA level of KLF9,KLF15 and the critical factors of NF-κB inflammatory signaling pathways were detected by RT-PCR.Results: Compared with NC group,the level of BMI,WC,HC,WHR,TG and LDL were significantly higher in the OB group(P<0.05);the mRNA level of NF-κB,TNF-α and IL-6 were significantly higher in the OB group(P<0.05);NF-κB mRNA expression level was significantly positive correlated with weight and TG(P<0.05);TNF-α mRNA expression level was significantly correlated with TG and TC;IL-6 mRNA expression level was significantly correlated with HC,TG and LDL(P<0.05).The KLF15 mRNA expression level of the omental adipose tissue in OB group was significantly higher than the NC group(P<0.05);and significantly positive correlated with BMI,WC and WHR (P<0.05),positive correlated with HDL,while negative correlated with TG.Conclusion: KLF15 probably plays the important role of anti-inflammatory by regulating lipid metabolism;under the obesity condition,Lipid metabolism disorders may indirectly increase KLF9 expression,and KLF9 may be act as an activating transcription factor to promote the expression and release of inflammatory cytokines through regulating the transcription activity of inflammatory factors downstream.

Uygur;Omental adipose tissue;KLF9;KLF15;Inflammation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.019

王翠喆(1992年-)，女，碩士，主要從事分子遺傳學(xué)方面研究，E-mail：wangcuizhe905@163.com。

及指導(dǎo)教師：張 君(1979年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肥胖、炎癥及代謝相關(guān)性疾病的發(fā)病機制研究，E-mail:zhangjunyc@163.com。

R34

A

1000-484X(2016)11-1653-05

①本文為兵團應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(2015AG016)、石河子大學(xué)重大科技攻關(guān)計劃項目(gxjs2012-zdgg02)、石河子大學(xué)高層次人才科研啟動資金專項(RCZX201230)和石河子大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計劃(SRP2015246)。

②同時就職于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，石河子832000。