張曉嵐 龔卉

肝動脈插管化療栓塞后肝癌HIF3α的表達與患者臨床病理特征及新生微血管密度的相關性

張曉嵐 龔卉

目的 探討肝動脈插管化療栓塞（TACE）治療對肝癌組織HIF3α表達的影響及其與患者臨床病理特征及新生微血管密度（MVD）的相關性。方法 采用免疫組織化學染色（IHC）檢測128例原發(fā)性肝細胞癌患者實施TACE（72例）后二期手術切除的肝癌組織及未實施TACE（56例）手術切除的肝癌組織的HIF3α及CD34蛋白表達，根據(jù)HIF3α陽性染色計分，CD34陽性染色計數(shù)MVD，登記相關肝細胞癌患者的臨床病理參數(shù)。采用t檢驗比較實施與未實施TACE患者肝癌組織HIF3α蛋白表達差異；采用Pearson相關檢驗分析實施TACE治療患者肝癌組織中HIF3α蛋白表達水平與臨床病理特征及MVD的相關性。結果 與未實施TACE患者的癌旁組織相比，實施TACE患者癌旁組織HIF3α蛋白表達顯著增強（t=-22.789，P＜0.01），未實施TACE者癌旁組織中心區(qū)呈低表達（低表達者占95.83%）；實施TACE者肝癌組織栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達與腫瘤直徑（r=0.250，P＜0.05）、原發(fā)灶浸潤深度（r=0.275，P＜0.05）、TNM分期（r=0.430，P＜0.01）及MVD（r=0.799，P＜0.01）均呈正相關，與其他臨床病理參數(shù)無明顯相關。結論 TACE治療可增強肝臟栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達，HIF3α表達與TACE治療后肝臟栓塞區(qū)周圍血管重建及腫瘤進展有密切關聯(lián)，HIF3α可作為肝癌TACE治療后血管重建及腫瘤進展的一種標志分子。

HIF3α 肝細胞癌 肝動脈插管化療栓塞 臨床病理特征

【 Abstract】 Objective To investigate the correlation of HIF3α expression with histopathological features and microvessel density(MVD)in patients with hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization(TACE). Methods One hundred and twenty eight patients with primary hepatocellular carcinoma were enrolled,including 72 cases undergoing TACE (TACE group)and 56 cases without TACE(non-TACE group).The expressions of HIF3α and CD34(marker for MVD)proteins in hepatocellular carcinoma tissues were detected by immunohistochemistry(IHC),HIF3α positive staining score and MVD were calculated.The difference between groups was analyzed by t-test;the correlation of HIF3α protein expression with histopathological parameters and MVD was analyzed by Pearson correlation test. Results Compared to non-TACE liver tissue, HIF3α protein expressed in TACE hepatocellular carcinoma tissue was significantly increased (t=-22.789,P＜0.01),while the central area of most non-TACE carcinoma(95.83%)showed low HIF3α expression.HIF3α protein expression was positively correlated with tumor size(r=0.250,P＜0.05),primary tumor invasion depth(r=0.275,P＜0.05),TNMstaging(r=0.430,P＜0.01)and MVD(r=0.799,P＜0.01)in the area ofsurrounding TACE embolism.Conclusion The expression ofHIF3α protein in hepatocellular carcinoma is increased after TACE treatment,and is correlated with angiogenesis and treatment response.

【 Key words】 HIF3α Hepatocellular carcinoma Transcatheter arterial chemoembolization Clinicopathological features

原發(fā)性肝細胞癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是世界常見的惡性腫瘤之一，我國目前發(fā)病人數(shù)約為34.7萬人，約占全球總發(fā)病人數(shù)的55%，死亡約32.3萬人，約占全球總死亡人數(shù)的45%[1]。因多數(shù)患者在診斷確立時不能耐受手術切除，以肝動脈插管化療栓塞（TACE）為代表的姑息性治療手段成為治療PHC的重要手段之一，但實施TACE治療患者5年生存率仍低于10%[2]。TACE造成的腫瘤局部低氧環(huán)境可能促進了新生血管的生成進而增加了肝癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移的機會[3]。

目前已證實在缺氧微環(huán)境下，缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）的表達對腫瘤順利完成局部微血管生成、保障腫瘤快速增殖的營養(yǎng)需求至關重要[4]。近年來對于HIF3α在缺氧微環(huán)境下扮演的角色成為新的研究熱點，其功能及臨床意義尚不十分明確[5]。本研究將分析實施TACE治療肝癌組織HIF3α蛋白表達水平與肝癌患者臨床病理特征、栓塞周圍組織微血管密度（microvessel density，MVD）的相關性，驗證TACE治療對肝癌栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達的影響，分析HIF3α與TACE治療后血管生成及患者臨床病理特征的關聯(lián)，探討HIF3α作為TACE治療肝癌治療分子標靶的可能性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取我院2005至2015年收治的128例PHC患者，均經(jīng)臨床檢查、甲胎蛋白（AFP）測定、B超及CT檢查或經(jīng)皮肝穿刺活檢診斷為PHC。登記上述患者性別、年齡、腫瘤部位、直徑、瘤體數(shù)量、浸潤深度、組織學分型、分化程度等臨床病理參數(shù)。TNM分期參照2010年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）肝癌TNM分期系統(tǒng)登記。

1.2 方法

1.2.1 臨床治療 72例實施TACE患者參照衛(wèi)生部《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》操作，采用Seldinger技術選擇肝動脈及其分支行化療栓塞術，注入含有氟尿嘧啶1 000mg、順鉑40mg、絲裂霉素20mg和超液態(tài)碘油8～20ml的混合劑。1個療程栓塞3～5次，每次間隔時間為30d左右，在療程中獲手術機會者行二期外科手術切除。56例未實施TACE者按衛(wèi)生部診療規(guī)范行擇期手術切除。所有患者病理組織常規(guī)取材、蠟塊包埋及切片。

1.2.2 免疫組化染色檢測肝細胞癌組織目的蛋白原位表達 取上述蠟塊組織，切片、貼片，65℃烘片過夜，二甲苯脫蠟、酒精洗脫、水洗，3%H2O2溶液中避光浸泡15min，置入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）的高壓鍋內(nèi)抗原修復3min，自來水沖洗冷卻，PBS清洗，濕盒內(nèi)分別滴加一抗HIF3α（abcam，ab10134，稀釋度1∶100）、CD34（福州邁新，MAB-0034，稀釋度1∶100）置4℃冰箱孵育過夜；次日PBS充分洗滌，分別滴加多克隆HRP羊抗兔IgG二抗（MaxVision，福州邁新，150601407）室溫孵育15min，PBS清洗，滴加DAB顯色液鏡下控制顯色，清洗、終止反應；蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，溶性樹脂封片，顯微鏡觀察、拍照，根據(jù)染色結果分析評分，由2位高年資病理醫(yī)師分別進行雙盲閱片。HIF3α陽性表達為細胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒。在組織背景清晰的前提下，根據(jù)陽性細胞染色強度及其所占實質(zhì)細胞百分比進行半定量結果判斷評分（參照文獻[6]）：先根據(jù)陽性細胞染色強度評分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分；再根據(jù)陽性細胞數(shù)占實質(zhì)細胞百分比評分：每張切片觀察5個視野（×100），陽性細胞數(shù)百分比評分：陰性為0分；＜10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分；兩項評分結果相乘即為陽性等級：陰性（-）為0分；弱陽性（+）為1～4分；陽性（++）為6～8分；強陽性（+++）為9～12分。計數(shù)資料分組統(tǒng)計：≤4分（-～+）歸為低表達組，≥6分（++～+++）歸為高表達組。MVD結果判定及分析：CD34標記血管內(nèi)皮細胞染成棕黃色為陽性，由兩位高年資病理醫(yī)師分別在低倍鏡下選取腫瘤浸潤區(qū)域微血管數(shù)量最密集的視野，再在200倍視野范圍計算18個視野的微血管數(shù)目，取其平均值作為MVD（個/HP）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，比較采用t檢驗，變量間相關性分析采用Pearson相關檢驗。

2 結果

2.1 實施及未實施TACE肝細胞癌組織HIF3α蛋白原位表達比較 采用IHC法檢測肝癌組織中HIF3α蛋白原位表達，結果顯示：與未實施TACE肝癌癌旁組織相比，實施TACE肝癌栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達（高表達者占87.50%）顯著增強（t=-22.789，P＜0.01），主要表達為肝細胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)分布面積較廣、顏色較深的棕褐色顆粒。未實施TACE者肝癌組織中心區(qū)域HIF3α蛋白較癌旁組織增高（t=-4.193，P＜0.01），但亦以低表達為主（低表達者占95.83%）；實施TACE者癌中心組織為栓塞壞死區(qū)，HIF3α蛋白無陽性染色（圖1，表1）。

2.2 實施與未實施TACE治療肝癌組織HIF3α蛋白表達與MVD的相關性 采用IHC法檢測TACE肝癌組織CD34蛋白表達計數(shù)MVD，結果顯示：與未實施TACE治療肝癌癌旁組織相比，肝癌腫瘤中心組織中的MVD明顯增高（t=18.807，P＜0.01），實施TACE治療栓塞壞死周圍組織MVD顯著增高（t=-29.965，P＜0.01）；與未實施TACE治療肝癌腫瘤中心組織相比，栓塞壞死周圍組織MVD無統(tǒng)計學差異（t=-0.541，P＞0.05，圖2，表2）。

采用Pearson相關檢驗分析實施TACE治療肝癌栓塞壞死周圍組織HIF3α蛋白表達水平與MVD的相關性，顯示HIF3α蛋白表達水平與MVD呈顯著正相關（r=0.799，P＜0.01）。

2.3 肝細胞癌組織HIF3α蛋白原位表達與臨床病理特征的相關性 Pearson相關檢驗72例患者實施TACE治療肝癌組織HIF3α蛋白表達與臨床病理特征的相關性，結果發(fā)現(xiàn)：實施TACE者肝癌組織栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達與腫瘤直徑（r=0.250，P＜0.05）、原發(fā)灶浸潤深度（r=0.275，P＜0.05）、TNM分期（r=0.430，P＜0.01）及MVD（r=0.799，P＜0.01）均呈正相關，與其他臨床病理參數(shù)無明顯關聯(lián)（P＞0.05，表3）。

圖1 實施與未實施TACE治療原發(fā)性肝癌HIF-2α表達比較（A：未實施TACE肝癌中心組織；B：未實施TACE癌旁組織；C：TACE栓塞周圍組織，×100）

表1 實施與未實施TACE肝癌中心及癌旁組織HIF3α蛋白表達比較

圖2 實施與未實施TACE治療原發(fā)性肝癌MVD檢測比較（A：未實施TACE肝癌中心組織；B：未實施TACE癌旁組織；C：TACE栓塞周圍組織，×100）

表2 實施與未實施TACE的肝癌中心及癌旁組織MVD比較

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的HIF成員有HIF1α、HIF2α、HIF3α三種，其中HIF3α是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體，1998年由Gu等[7]首先發(fā)現(xiàn)。目前國內(nèi)外對HIF3α研究較少。HIF3α廣泛存在于人和動物體內(nèi),主要在心臟、胎盤組織、骨骼肌以及肺組織中表達,而在肝臟和腎臟組織中表達量較低[8]。有研究報道HIF3α在肝癌組織中表達相對較高[9]，但HIF3α在肝動脈插管化療栓塞肝癌中的表達水平與臨床病理學特征及MVD的相關性研究尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，與未實施TACE肝癌癌旁組織相比，實施TACE肝癌栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達顯著增強，而HIF3α蛋白在未實施TACE肝癌組織中心區(qū)及癌旁正常組織均呈低表達，癌旁表達相對更低（圖1，表1），表明TACE治療后造成的局部缺氧微環(huán)境有利于增強HIF3α蛋白表達。

本研究通過臨床病理學分析，發(fā)現(xiàn)實施TACE者肝癌組織栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達與肝癌腫瘤直徑、原發(fā)灶浸潤深度、TNM分期及MVD均呈正相關，而與其他臨床病理參數(shù)無明顯關聯(lián)，提示TACE治療后造成的局部缺氧微環(huán)境通過增加HIF3α蛋白表達進一步促進栓塞周圍殘存的肝癌細胞生長及栓塞周圍肝組織的血管重建，但對于未進行TACE治療的原發(fā)灶并無此促進作用。

綜上所述，我們的研究表明TACE治療可增強肝臟栓塞周圍組織HIF3α蛋白表達，HIF3α可能與TACE治療后肝臟栓塞區(qū)周圍血管重建及肝癌患者腫瘤直徑、原發(fā)灶浸潤深度、TNM分期有關，HIF3α可作為一種有價值的評估肝癌TACE治療后血管重建及腫瘤進展的標志分子。

表3 原發(fā)性肝癌TACE治療HIF3α蛋白表達與臨床病理特征的相關性分析（例）

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Correlation of HIF3α expression with histopathological features and microvessel density in patients with hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization

ZHANG Xiaolan,GONG Hui.Department of Pathology,Huzhou First People's Hospital, Huzhou 313000,China

2016-01-07）

（本文編輯：田云鵬）

313000 湖州市第一人民醫(yī)院病理科