潘瓊慧 黃凌霄 朱雪燕 林濤 朱雪瓊

HR-HPV E6/E7 mRNA在宮頸細胞學ASCUS分流診斷中的意義

潘瓊慧 黃凌霄 朱雪燕 林濤 朱雪瓊

目的 探討高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）E6/E7 mRNA在宮頸不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）分流診斷中的意義。方法 選擇2014年1月至2015年7月就診且行液基薄層細胞學檢測（TCT）結果為ASCUS的205例患者為研究對象，并且行陰道鏡下活檢、HR-HPVE6/E7 mRNA檢測和HR-HPV分型DNA檢測。結果 根據陰道鏡活檢結果，將205例ASCUS患者分為慢性宮頸炎105例、低度宮頸鱗狀上皮內病變（LSIL）48例、高度宮頸鱗狀上皮內病變（HSIL）48例和宮頸鱗狀細胞癌（SCC）4例。慢性宮頸炎、LSIL、HSIL和SCC組HR-HPVE6/E7 mRNA陽性檢出率分別為56.2%、79.2%、85.4%和100.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；HSIL+SCC組HR-HPVE6/E7 mRNA陽性檢出率為86.5%，高于慢性宮頸炎+LSIL組的63.4%（P＜0.01）。HR-HPVE6/E7 mRNA水平為SCC＞HSIL＞LSIL＞慢性宮頸炎癥，4組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。＜30歲組與≥30歲組HR-HPV E6/E7 mRNA水平分別為292.23（109.77～903.34）copy/ml和175.26（0.00～1 032.90）copy/ml，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HR-HPV E6/E7 mRNA水平與宮頸病變程度呈正相關（r=0.379，P＜0.01）。HR-HPV E6/E7 mRNA檢測方法的AUC為0.702（0.617～0.786），診斷閾值為185.74copy/ml，檢測ASCUS患者HSIL+SCC的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為76.9%、60.8%、40.0%和88.6%，而HR-HPVDNA的檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為88.5%、31.3%、30.5%和88.9%；其中HR-HPVE6/E7 mRNA檢測特異度明顯高于HR-HPVDNA（P＜0.05）。結論 HR-HPVE6/E7 mRNA檢測在ASCUS篩查中特異度較高，有望成為宮頸細胞學ASCUS分流的新方法。

高危人乳頭瘤病毒 E6/E7 mRNA 宮頸不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞

【 Abstract】 Objective To evaluate the significance of high-risk human papilloma virus E6/E7 mRNA test in patients with atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS)of cervical cytology. Methods Two hundred and five gynecologicaloutpatients underwent cervicalthinpre cytologicaltest(TCT)and diagnosed as ASCUS in Wenzhou People's Hospital from January 2014 to July 2015.High risk human papilloma virus(HR-HPV)E6/E7 mRNAtest,HPVDNAtest and histopathological examination were also performed in allpatients.Results Among 205 patients,there were 105 cases ofchronic cervicitis,48 cases oflow-grade squamous intraepitheliallesion(LSIL),48 cased ofhigh-grade squamous intraepithelis lesion(HSIL)and 4 cases of cervical carcinoma.The positive rate of HPVE6/E7 mRNA in chronic cervicitis,LSIL,HSIL and the cervical carcinoma groups were 56.2%,79.2%,85.4%and 100.0%,respectively(P＜0.01).HPV E6/E7 mRNA positive rate in HSIL+carcinoma group was significantly higher than that in LSIL+cervicitis group (86.5%vs 63.4%,P＜0.01).Rank analysis demonstrated that the severity of cervical lesions was correlated the expression of HPVE6/E7 mRNA(r=0.379,P＜0.01).When HPVE6/E7 mRNA≥185.74 copy/ml was used as criteria for screening HSIL and above lesions,the sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of HPV E6/E7 mRNA were 76.9%,60.8%,40.0%and 88.6%,respectively in patients with ASCUS,while those parameters of HR-HPV DNA were 88.5%,31.3%,30.5%and 88.9%,respectively.The specificity of HPV E6/E7 mRNA was significantly higher than that ofHPVE6/E7 DNA(P＜0.05).Conclusion The specificity ofHPVE6/E7 mRNAtest are higher than thatofhigh-risk HPVDNAfor diagnosis ofHSIL+in patients with ASCUS.

子宮內膜組織（腺體和間質）出現在子宮體以外的部位時，稱為子宮內膜異位癥（endomertilsis，EMT）[1-3]。EMT是一種良性疾病，其復發(fā)率較高，影響著女性健康與生活質量。筆者對本院100例EMT患者臨床資料進行分析，以探究EMT術后復發(fā)的影響因素。

宮頸不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）是介于正常宮頸鱗狀上皮細胞與宮頸鱗狀上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）之間的一種宮頸細胞學診斷，其組織學可以表現為CIN和宮頸浸潤癌。2012年美國國立綜合癌癥網絡宮頸癌篩查指南[1]指出ASCUS有3種處理方式：（1）高危型人乳頭瘤病毒（high-risk virushuman papilloma virus，HR-HPV）DNA檢測，陽性者行陰道鏡檢查，陰性者行常規(guī)細胞學篩查；（2）6個月后復查細胞學，陰性者行常規(guī)細胞學篩查，陽性者行陰道鏡活檢；（3）直接陰道鏡檢查。由于人乳頭瘤病毒（HPV）感染是發(fā)生宮頸癌的危險因素，建議探索更好的檢查手段來提高特異度，以減少不必要的陰道鏡檢查。HR-HPV致癌基因為E6/E7[2]，且HR-HPV E6/E7 mRNA含量能較好反映E6/E7的活動度，直觀評估宮頸鱗狀上皮病變、宮頸癌發(fā)病風險及預后[3-4]。故本研究檢測205例宮頸ASCUS患者的HR-HPV E6/E7 mRNA，并與HR-HPV DNA檢測結果作比較，以探討其對ASCUS患者分流的價值。

1 對象和方法

1.1對象 選擇2014年1月至2015年7月液基薄層細胞學檢測（TCT）為ASCUS的205例患者為研究對象，年齡21～78歲，平均（42.7±10.3）歲。ASCUS診斷標準：（1）細胞核增大，是正常中層細胞的2.5～3倍，核質比例輕度增大；（2）可能有細胞核形改變或有雙核；（3）核染色質輕度增加，但均勻分布、無顆粒樣改變；（4）細胞核外形光滑規(guī)則，有時稍有不規(guī)則。所有患者無急性生殖道炎癥和其他婦科合并癥，均簽署知情同意書，研究所得數據均經處理，以尊重患者隱私權。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 囑受試者檢查前72h禁止性生活和陰道沖洗。婦產科醫(yī)師用窺器暴露子宮頸，擦凈宮頸口分泌物，用宮頸刷在宮頸外口稍用力順時針旋轉3圈后取出，將宮頸脫落細胞標本放入專用保存管中，4℃保存。

1.2.2 陰道鏡下活檢 臨床醫(yī)師對所有患者進行陰道鏡檢查，對可疑病灶進行陰道鏡下定位活檢，對無明顯異常者則采取3、6、9、12點活檢。根據WHO 2014年版國際疾病分類標準進行病理學診斷，所有病理切片由2位資深病理學專家復核。

1.2.3 HR-HPV E6/E7 mRNA檢測 使用Quanti Virus@ HPV E6/E7 mRNA診斷試劑盒（河南Kodia生物技術公司生產）、采用以實時多重核酸序列擴增（NABSA）技術為基礎的PreTect HPVProofer檢測法，針對14種HRHPV亞型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）進行檢測。

1.2.4 HR-HPV分型DNA檢測 使用HR-HPV分型檢測試劑盒（凱普生物化學有限公司生產）、采用導流雜交基因芯片技術進行檢測，可一次性快速檢測21種HR-HPV亞型的基因分型，包括13種高危亞型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5種低危亞型 6、11、42、43、44，3種中國人群常見亞型53、66和CP8304型。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，對HRHPV E6/E7 mRNA水平進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗，數據不服從正態(tài)分布，故用M（P25，P75）表示。不同宮頸病理類型患者HR-HPV E6/E7 mRNA水平比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，不同年齡組HR-HPV E6/ E7 mRNA水平比較采用Mann-Whitney U檢驗；宮頸病變程度與HR-HPV E6/E7 mRNA水平的相關性采用Spearman等級相關分析。HR-HPV E6/E7 mRNA與HRHPV DNA檢測的比較采用ROC曲線分析，計算靈敏度、特異度和陰/陽性預測值，兩組特異度比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 不同宮頸病理類型患者HR-HPV E6/E7 mRNA檢出率比較 205例ASCUS患者經陰道鏡活檢，按泊塞斯達系統(tǒng)（TBS）上皮細胞病理學改變的級別分為慢性宮頸炎105例、低度宮頸鱗狀上皮內病變（LSIL）48例、高度宮頸鱗狀上皮內病變（HSIL）48例和宮頸鱗狀細胞癌（SCC）4例。HR-HPV E6/E7 mRNA陽性標準為＞0copy/ml，其在慢性宮頸炎癥、LSIL、HSIL和SCC組陽性檢出率分別為56.2%（59/105）、79.2%（38/48）、85.4%（41/48）和100.0%（4/4），4組宮頸病理類型患者HRHPV E6/E7 mRNA陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 16.68，P＜0.01）。此外，慢性宮頸炎+LSIL組和HSIL+SCC組HR-HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率分別為63.4%（97/153）和86.5%（45/52），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.76，P＜0.01）。

2.2 不同宮頸病理類型患者HR-HPV E6/E7 mRNA水平比較 HR-HPV E6/E7 mRNA水平為SCC＞HSIL＞LSIL＞慢性宮頸炎，4組比較差異有統(tǒng)計學意義（H= 34.21，P＜0.01），見表1。

表1 不同宮頸病理類型患者HR-HPV E6/E7mRNA水平

2.3 不同年齡組患者HR-HPV E6/E7 mRNA水平比較將205例患者按照年齡分為＜30歲17例和≥30歲188例，其HR-HPV E6/E7 mRNA水平分別為292.23（109.77～903.34）copy/ml和175.26（0.00～1 032.90）copy/ ml，兩組差異無統(tǒng)計學意義（Z=-0.86，P＞0.05）。

2.4 宮頸病變程度與HR-HPV E6/E7 mRNA水平的相關性 宮頸病變程度與HR-HPV E6/E7 mRNA水平存在正相關（r=0.379，P＜0.01）。

2.5HR-HPVE6/E7mRNA與HR-HPVDNA檢測HSIL+ SCC的診斷效能 HR-HPV E6/E7 mRNA檢測方法的AUC為0.702（0.617～0.786），診斷閾值為185.74copy/ml，見圖1。HR-HPV E6/E7 mRNA檢測HSIL+SCC的靈敏度為76.9%，特異度為60.8%，陽性預測值為40.0%，陰性預測值為88.6%；HR-HPV DNA檢測HSIL+SCC的靈敏度為88.5%，特異度為31.3%，陽性預測值為30.5%，陰性預測值為88.9%。其中HR-HPV E6/E7 mRNA檢測特異度明顯高于HR-HPV DNA（χ2=26.63，P＜0.05）。

圖1 HSIL+SCC患者HR-HPV E6/E7mRNA檢測的ROC曲線

3 討論

宮頸癌嚴重危害婦女健康與生命，近年來發(fā)病率呈逐年升高和年輕化趨勢[5]。自從1949年Sttauss首次觀察到HPV顆粒，大量流行病學和分子生物學研究證實HPV持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生的必要但非充分的原因[6]。目前以HPV DNA為基礎的檢測在宮頸病變篩查中發(fā)揮著重要作用，其具有較高的靈敏度和陰性預測值，但特異度和陽性預測值較低[7]；HPV DNA檢測無法區(qū)別是疾病潛伏期、亞臨床期和臨床表現期。臨床上往往因HPV假陽性而進行不必要的陰道鏡及宮頸活組織檢查，對患者造成不必要的傷害和經濟負擔，特別是細胞學診斷為ASCUS的患者。美國國立腫瘤研究院對ASCUS患者進行多中心研究顯示，HPV DNA分型檢測對發(fā)現CIN及以上病變的靈敏度為96.3%，其中約56.1%的患者需行陰道鏡下宮頸活組織檢查。因此，需要探索一種能簡便、準確識別ASCUS病例宮頸高級別病變、識別宮頸病變進展風險的檢測方法，以有效進行ASCUS分流并指導隨訪管理。

HR-HPV致癌基因主要為E6、E7和E2，HPV DNA整合于宿主染色體脆弱區(qū)，破壞編碼特異度DNA束縛蛋白的E2區(qū)，而E6、E7轉化作用受E2調控，因此會導致E6、E7基因過表達[8]。E6、E7蛋白能使細胞生長抑制劑失活，其中以腫瘤抑制基因p53和pRB最為重要[9]。同時，E6與E7共同表達具有協(xié)同作用，可以增強轉化能力，使細胞過度增殖，最終導致宮頸癌的發(fā)生。檢測HRHPV E6/E7 mRNA轉錄物能發(fā)現HPV癌基因的活化狀態(tài)，與HPV DNA檢測相比，更有利于判斷HPV感染與預測病變進展的風險，是宮頸病變篩查的有效方法。

Trope等[10]對643例病理檢查證實為CINⅡ+的患者和736名宮頸細胞學正常女性進行HR-HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測，發(fā)現隨著宮頸鱗狀上皮病變程度加重，HR-HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA陽性率明顯升高，但是HPV DNA與組織學分級無關，故認為HR-HPV E6/E7 mRNA可作為宮頸鱗狀上皮病變進展的生物學標志物；與本研究結果相似。此外，本研究顯示宮頸組織學病變程度與HR-HPV E6/E7 mRNA水平存在正相關（r=0.379），與Coquillard等[11]研究結果一致。Hovland等[7]對343名女性進行傳統(tǒng)細胞學、TCT、HPV E6/ E7 mRNA和HPV DNA檢測，發(fā)現檢測CINⅡ+的靈敏度分別為66.7%、73.3%、81.3%和100.0%，特異度分別為96.2%、96.9%、96.6%和85.9%，提示HPV E6/E7 mRNA特異度與傳統(tǒng)細胞學相似，但高于HPV-DNA；這與本研究發(fā)現的HPV E6/E7 mRNA檢測HSIL+SCC特異性高于HR-HPV DNA一致。Johansson等[12]對宮頸細胞學輕度異常（包括ASCUS或LSIL合并HR-HPV（+）的女性隨訪4～5年，發(fā)現HPV E6/E7 mRNA在預測宮頸進展為CINⅡ+的靈敏度較高，但特異度差；對CINⅢ的陰性預測值為100.0%。Pierry等[13]對3 133名女性進行宮頸細胞學篩查，并對ASCUS/LSIL患者進行HPV E6/E7 mRNA研究，發(fā)現≥30歲、＜30歲組檢出CINⅡ+的HPV E6/E7 mRNA靈敏度分別為89%和88%，2個年齡組細胞學靈敏度分別為89%和96%；2個年齡組HPV E6/E7 mRNA特異度均＞80%，而細胞學特異度均＜10%；這說明HPV E6/E7 mRNA的特異度高于細胞學，可認為HR-HPV E6/E7 mRNA檢測為ASCUS/ LSIL患者（包括＜30歲）提供了一種分流措施，這與本文研究結果相似。2012版美國陰道鏡檢查與宮頸病理學會宮頸篩查指南將21～24歲女性列為特殊人群，認為處理該年齡段ASCUS患者時，HPV DNA檢測并非最佳方案，即使結果陽性仍不建議直接行陰道鏡檢查；因此，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測用于該年齡段ASCUS患者篩查分流可作進一步研究。

綜上所述，對HPV E6/E7 mRNA陽性的ASCUS患者立即行陰道鏡活檢，對陰性ASCUS患者進行隨訪是可行的。HR-HPV E6/E7 mRNA與宮頸病變程度呈正相關，能早期預測HR-HPV持續(xù)感染導致病變進展的風險，并有望成為宮頸細胞學ASCUS分流的新方法。

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（本文編輯：陳丹）

《浙江醫(yī)學》對計量單位的要求

本刊執(zhí)行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關量、單位和符號的規(guī)定及其書寫規(guī)則，具體執(zhí)行可參照中華醫(yī)學會雜志社編寫的《法定計量單位在醫(yī)學上的應用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應采用負數冪的形式表示，組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應先列出法定計量單位數值，括號內寫舊制單位數值；如果同一計量單位反復出現，可在首次出現時注出法定與舊制單位換算系數，然后只列法定計量單位數值。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

High-risk human papilloma virus E6/E7 mRNA test in patients with atypical squamous cells of undetermined significance of cervical cytology

PAN Qionghui,HUANG Lingxiao,ZHU Xueyan,et al.Department of Gynecology，the Third Clinical Institute Affiliated to Wenzhou Medical University，Wenzhou People's Hospital，Wenzhou 325000,China

High-risk human papilloma virus E6/E7 mRNA Atypicalsquamous cells ofundetermined significance

2015-10-26）

325000 溫州醫(yī)科大學溫州市第三臨床學院、溫州市人民醫(yī)院婦產科（潘瓊慧、黃凌霄、朱雪燕、林濤）；溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科（朱雪瓊）

朱雪瓊，E-mail：zjwzzxq@163.com