周史思 呂杰強 鄭胡忠

脂聯(lián)素及AMPKα2基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征易感性的相關(guān)性研究

周史思 呂杰強 鄭胡忠

目的 探討血清脂聯(lián)素水平及腺苷酸活化蛋白激酶（AMP）Kα2基因多態(tài)性（rs2796516）與多囊卵巢綜合征（PCOS）易感性的相關(guān)性。方法 以住院確診為PCOS的80例患者為PCOS組，選擇同期與其種族、年齡、BMI、空腹血糖、空腹胰島素等因素相匹配的健康體檢婦女為對照組，檢測并比較臨床及生化指標，同時分析AMPK α2基因多態(tài)性與PCOS易感性的關(guān)系。結(jié)果 PCOS組血清脂聯(lián)素水平為（25.99±9.59）mg/L，明顯低于對照組（14.99±7.23）mg/L（P＜0.01）。PCOS組AMPK α2基因多態(tài)性G等位基因頻率為67.5%，低于對照組的86.5%（P＜0.01）。多因素logistic回歸分析提示促黃體素（OR=2.390，95%CI：1.536～3.719）、GA/AA基因型（OR=3.613，95%CI：1.283～10.174）為正相關(guān)因素，脂聯(lián)素（OR=0.778，95%CI：0.697～0.869）、促卵泡激素（OR=0.186，95%CI：0.087～0.397）為負相關(guān)因素。logistic回歸模型判斷PCOS易感性的能力一致率為82.78%，ACU為0.875（95%CI：0.824～0.926），擬和能力中等；最大Youden指數(shù)為0.645，對應(yīng)的預(yù)測概率為0.489，確定該點為最佳診斷點，其靈敏度為0.775，特異度為0.870。結(jié)論 血清脂聯(lián)素水平、AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）與PCOS易感性存在一定的相關(guān)性，本研究建立的遺傳-激素模型對PCOS易感性的評估能力中等。

多囊卵巢綜合征 腺苷酸活化蛋白激酶 α2基因多態(tài)性 脂聯(lián)素 風(fēng)險模型

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期婦女常見的生殖內(nèi)分泌和代謝紊亂疾病，其影響因素有肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、動脈粥樣硬化過早形成等。國內(nèi)研究證實PCOS患者本身存在低水平血清脂聯(lián)素狀態(tài)，且獨立于胰島素抵抗和肥胖[1]。脂聯(lián)素是近年來發(fā)現(xiàn)的新型脂肪細胞分泌的肽類激素[1]，可能通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號傳導(dǎo)通路參與細胞能量代謝，相關(guān)研究證實AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）與脂聯(lián)素存在關(guān)聯(lián)[2]。筆者推測AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）可能與PCOS易感性相關(guān)，但目前鮮有報道；故本文均衡年齡、BMI、空腹血糖、空腹胰島素和穩(wěn)態(tài)模型評估法計算的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）等影響因素后，比較PCOS患者與健康婦女血清脂聯(lián)素水平差異和AMPK α2基因多態(tài)性，旨在探討PCOS易感性與AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 以2014年1月至2015年12月溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院住院確診為PCOS的80例患者為PCOS組，診斷依據(jù)為鹿特丹標準[3]，即稀發(fā)排卵或不排卵、高雄激素血癥或高雄激素的臨床表現(xiàn)、超聲下卵巢多囊樣改變，滿足以上3項中至少2項且排除其他疾病。選擇同期來醫(yī)院體檢的100例健康婦女為對照組，剔除月經(jīng)周期＜24d或＞32d者。兩組受試者均無腫瘤、代謝性疾病和心血管疾病，均無溢乳或任何可能影響生育功能的疾?。慌懦焉?、甲狀腺功能低下、高催乳素血癥、庫欣綜合征、先天性腎上腺皮質(zhì)增生以及正在使用或近半年內(nèi)使用過口服避孕藥、糖皮質(zhì)激素、降雄激素藥物、促排卵藥物、抗糖尿病藥物、抗肥胖藥物、其他激素類藥物者。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準，且所有受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 問卷調(diào)查 問卷內(nèi)容包括一般情況、健康相關(guān)行為、飲酒、吸煙、飲食習(xí)慣、運動情況、疾病史等。

1.2.2 體格檢查 測量身高、體重和血壓等。

1.2.3 實驗室檢查 采集早卵泡期（自然月經(jīng)或孕酮撤退性出血的第2～5天）血清，檢測性激素水平；采集清晨空腹血清作血生化、空腹血糖、血脂、糖化血紅蛋白（HbA1c）等檢查；采用ELISA法測定血清脂聯(lián)素水平，試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 AMPK α2基因型檢測 抽取晨起外周靜脈血2ml，使用DNA試劑盒提取人類白細胞基因組DNA，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆??；蛞铮荷嫌我?5′-CAT AGA TTA GCA GCA TTG AAA GC-3′，下游引物：5′-AAT ACA CCC ACC AGA ATA GCA CA-3′。采用直接測序方法讀取個體基因型，所有測序過程由華大基因公司完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性，基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗。計量資料符合正態(tài)分布用表示，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布則用M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。將單因素分析結(jié)果P＜0.05的變量納入多因素非條件logistic回歸分析，計算OR值及其95%CI。用對照組的暴露率代替總?cè)巳罕┞堵蕘碛嬎闳巳簹w因危險度百分比。以logistic回歸模型計算得出的預(yù)測概率為檢驗變量，實際應(yīng)變量為“金標準”狀態(tài)變量值=1，進行ROC曲線分析，判斷模型擬合能力的指標采用ROC曲線一致率、AUC，Youden指數(shù)=靈敏度+特異度，根據(jù)最大Youden指數(shù)確定最佳診斷點。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料及生化指標比較 PCOS組血清脂聯(lián)素水平明顯低于對照組（P＜0.01）；此外，兩組平均年齡、BMI、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR和HbA1c比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；兩組TG、TC、LDL-C、HDL-C、Hb、ALT、AST、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、TBil、白蛋白、肌酐、尿酸等血生化指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。PCOS組腰臀比（WHR）高于對照組（P＜0.01）；PCOS組與對照組的睪酮、促卵泡激素（FSH）、促黃體素（LH）和LH/FSH比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）與PCOS易感性的關(guān)系 人群中攜帶GG基因型的個體患PCOS的危險度為0.299倍，95%CI：0.158～0.566；攜帶GA基因型的個體患PCOS的危險度為2.296倍，95%CI：1.164～4.525；攜帶AA基因型的個體患PCOS的危險度為4.235倍，95%CI：1.310～13.693。PCOS組G等位基因頻率為67.5%，低于對照組的86.5%（P＜0.01），見表2。Hardy-Weinberg平衡檢驗PCOS組與對照組AMPK α2基因多態(tài)性，結(jié)果顯示PCOS組χ2=3.27，P=0.07；對照組χ2=3.48，P=0.06；可認為兩組趨向于遺傳平衡，基因型測序圖見圖1-3。

2.3 多因素logistic回歸分析 將單因素分析篩選出的可能危險因素納入多因素logistic回歸分析，最終進入模型的因素有脂聯(lián)素、睪酮、FSH、LH和AMPK α2基因多態(tài)性。logistic回歸模型如下：logit（p）=-3.358-0.251X1-1.68X2+0.871X3+1.284X4，其中LH（OR=2.390，95%CI：1.536～3.719）、GA/AA基因型（OR=3.613，95%CI：1.283～10.174）為正相關(guān)因素；脂聯(lián)素（OR=0.778，95%CI：0.697～0.869）、FSH（OR=0.186，95%CI：0.087～0.397）為負相關(guān)因素，見表3。

2.4 模型擬合能力分析及最佳診斷點確定 ROC曲線一致率為82.78%，AUC為0.875，95%CI：0.824～0.926，標準誤為0.026（P＜0.01）；該模型擬合能力中等，見圖4。根據(jù)ROC曲線，靈敏度為0.775，特異度為0.870；最大Youden指數(shù)為0.645，對應(yīng)的預(yù)測概率為0.489，確定該點為最佳診斷點。即影響因素根據(jù)logistic回歸模型計算的概率≥0.489時，與PCOS發(fā)病的相關(guān)性較大。

表1 兩組臨床及生化指標的比較

表2 兩組AMPK α2基因多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率分布[例（%）]

表3 PCOS影響因素的多因素logistic回歸分析

圖1 單核苷酸基因多態(tài)性rs2796516測序GG基因型

圖2 單核苷酸基因多態(tài)性rs2796516測序AG基因型

圖3 單核苷酸基因多態(tài)性rs2796516測序AA基因型

3 討論

血清脂聯(lián)素水平與肥胖、胰島素抵抗的關(guān)系目前已被證實。有研究認為雄烯二酮和BMI是決定脂聯(lián)素水平的唯一重要因素[4]。關(guān)于PCOS與脂聯(lián)素之間的關(guān)系目前觀點不一，一些研究者認為PCOS的低脂聯(lián)素水平是胰島素抵抗的結(jié)果，而不能認為是PCOS特征[5-6]。國內(nèi)大部分病例對照研究認為PCOS患者的低脂聯(lián)素狀態(tài)與胰島素抵抗相關(guān)。金燕等[7]對中國漢族女性血清脂聯(lián)素水平與PCOS關(guān)系進行Meta分析，發(fā)現(xiàn)在BMI匹配的情況下，PCOS患者血清脂聯(lián)素水平仍低于對照組，認為PCOS的低脂聯(lián)素狀態(tài)獨立于超重、肥胖。

圖4 logistic回歸模型擬合效果的ROC曲線

本研究在均衡年齡、BMI、胰島素抵抗影響的情況下，比較PCOS組與對照組血清脂聯(lián)素水平和各項指標的差異，結(jié)果顯示PCOS組血清脂聯(lián)素水平明顯低于對照組。此外，PCOS組與對照組之間性激素水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）人群中攜帶GG基因型的個體患PCOS的危險度是正常人群的0.299倍，GA基因型的個體患PCOS的危險度是2.296倍，AA基因型的個體患PCOS的危險度是4.235倍。由此推出AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）與PCOS易感性存在一定的相關(guān)性。其次，本研究采用多因素logistic回歸分析PCOS患者易感性的影響因素，為使模型更具有針對性，故建立基于基因多態(tài)性、激素等多項影響因素的風(fēng)險模型，該模型判斷PCOS易感性的能力一致率達82.78%，AUC為0.875，提示該基因遺傳-激素模型判斷PCOS易感性的能力中等。其中GA/AA基因型（OR=3.613）、LH（OR=2.390）為正相關(guān)因素，而脂聯(lián)素（OR=0.778）、FSH（OR=0.186）為負相關(guān)因素。其中AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）GA/AA基因型在一定程度上會影響PCOS易感性，推測AMPK α2基因多態(tài)性、脂聯(lián)素可能與PCOS特有的激素合成狀態(tài)有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在卵巢的甾體激素合成中發(fā)揮一定的作用，脂聯(lián)素可刺激LH受體、類固醇生成快速調(diào)節(jié)因子蛋白和3β-脫氫酶的表達，并可調(diào)節(jié)卵巢甾體激素的合成[8]。Comim等[9]發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在PCOS患者高雄激素的形成中發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)相關(guān)資料報道rs2796516位點A型等位基因可以通過增加胰島素抵抗的趨勢、使胰島β細胞分泌功能下降，從而影響AMPK通路，導(dǎo)致血脂代謝異常，降低脂聯(lián)素水平[10]。由于傳統(tǒng)模型在個體影響因素的預(yù)測性和提供個體化治療策略上有所欠缺；而分子流行病學(xué)的模型有利于PCOS監(jiān)測和干預(yù)策略。因此，本研究建立的模型引入遺傳因素，以加強PCOS易感危險性的預(yù)測精度，增強評估能力。本文采用多因素logistic回歸方法篩選變量，在確定高危個體和篩檢上具有一定的價值，當個體將其危險因素的狀況代入logistic回歸模型時，若計算得到的概率≥0.489，即可對個體PCOS易感性進行預(yù)警，該診斷點靈敏度為0.775，特異度為0.870。

綜上所述，浙南地區(qū)人群中AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）、脂聯(lián)素水平與PCOS易感性存在相關(guān)性。但本研究尚存在局限性，如樣本量偏小，未能直接證實AMPK α2基因多態(tài)性（rs2796516）下游相關(guān)蛋白激酶磷酸化指標及其在PCOS發(fā)生機制；研究對象的飲食習(xí)慣及血脂代謝情況控制欠佳等因素，有待進一步研究證實。

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Correlation of serum adiponectin level and AMPK α2 gene polymorphism with polycystic ovary syndrome

ZHOU Shisi,LYU Jieqiang,ZHENG Huzhong.Department of Gynecology,the Second College of Clinical Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the correlation of AMPKα2 gene(rs2796516)polymorphism and serum adiponectin level with polycystic ovary syndrome. Methods Eighty patients with PCOS and 100 race,age,BMI,fasting plasma glucose and insulin levels-matched healthy subjects(controlgroup)were enrolled in the study.AMPKα2 gene(rs2796516)polymorphism was examined with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and sequence-based typing, serum adiponectin levels were measured with ELISA. Results Serum adiponectin level was significantly higher in PCOS group than that in controls(25.99±9.59mg/L vs 14.99±7.23mg/L,P＜0.01).The frequency of G allele of AMPKα2 gene(rs2796516)in PCOS group and control group were 67.5%and 86.5%,respectively(P＜0.05).Logistic analysis showed that LH(OR=2.390,95% CI:1.536～3.719),GA/AA genotype(OR=3.613,95%CI:1.283～10.174)were positively correlated with PCOS,while adiponectin (OR=0.778,95%CI:0.697～0.869),FSH (OR=0.186,95%CI:0.087～0.397)were negatively correlated with POCS.The logistic regression genetic-hormone model showed the area under ROC curve for predicting PCOS was 0.875(95%CI:0.824～0.926). Conclusion The level ofserum adiponectin and AMPKα2 gene polymorphism(rs2796516)are correlated with PCOS susceptibility, and the genetic-hormone modelhas moderate ability in assessment ofPCOS susceptibility.

Polycystic ovary syndrome AMPK α2 gene polymorphism Adiponectin Risk model

2016-04-07）

（本文編輯：陳丹）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（周史思現(xiàn)在溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科工作）

呂杰強，E-mail：542015771@qq.com