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        IFN-γ誘導蛋白10及其受體在子癇前期孕婦血清和胎盤組織中的表達

        2016-12-26 11:36:51朱敏王建芳徐秋蓮薛洪燕金彥章根琴徐攀
        浙江醫(yī)學 2016年13期
        關(guān)鍵詞:子癇外周血胎盤

        朱敏 王建芳 徐秋蓮 薛洪燕 金彥 章根琴 徐攀

        IFN-γ誘導蛋白10及其受體在子癇前期孕婦血清和胎盤組織中的表達

        朱敏 王建芳 徐秋蓮 薛洪燕 金彥 章根琴 徐攀

        目的 探討子癇前期孕婦血清及胎盤組織中IFN-γ誘導蛋白10(IP-10)及其受體CXCR3的表達情況。方法 選擇同期住院的晚期正常妊娠、輕度子癇前期和重度子癇前期孕婦各20例。采用ELISA、實時熒光定量RT-PCR和Western blot等方法檢測血清IP-10水平、CXCR3 mRNA表達水平,以及胎盤組織中IP-10、CXCR3蛋白和mRNA表達水平;并對子癇前期孕婦IP-10與CXCR3進行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果 與正常妊娠組比較,輕、重度子癇前期孕婦血清IP-10水平和CXCR3 mRNA表達水平均有不同程度的增高(均P<0.05),且均為重度子癇前期組高于輕度子癇前期組(均P<0.05)。此外,輕、重度子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10、CXCR3蛋白和mRNA水平均明顯高于正常妊娠組(均P<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示,子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達水平呈正相關(guān)(r=0.914,P<0.05);子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10 mRNA表達水平與CXCR3 mRNA表達水平呈正相關(guān)(r=0.907,P<0.05)。結(jié)論 IP-10及其受體CXCR3表達上調(diào)參與子癇前期病程,子癇前期孕婦血清、胎盤組織中IP-10與CXCR3均呈正相關(guān),可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān)。

        IFN-γ誘導蛋白10 CXCR3 子癇前期 血清 胎盤

        子癇前期是導致孕婦和圍生兒病死率的主要原因之一,應(yīng)予以重視,特別是重度子癇前期。子癇前期的病因及發(fā)病機制較為復雜,可能與螺旋動脈異常變形、慢性子宮胎盤缺血、上皮細胞功能不良、血管生成障礙、血管內(nèi)炎癥和Th1/Th2型細胞因子失衡等因素有關(guān)[1]。IFN-γ誘導蛋白10(inducible protein 10,IP-10)是新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,由IFN-γ誘導產(chǎn)生。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IP-10具有重要的生物學功能,能介導Th1型炎癥反應(yīng),還能抑制血管新生[2]。Gotsch等[3]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清IP-10水平明顯高于正常妊娠婦女,提示IP-10可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān)。故本文通過檢測子癇前期孕婦血清及胎盤組織中IP-10及其受體CXCR3的表達,旨在探討與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。

        1 對象和方法

        1.1 對象 選取2013年6月至2014年6月住院的子癇前期孕婦40例為研究對象,子癇前期的診斷和分類標準參照《婦產(chǎn)科學》[4]:輕度子癇前期孕婦20例,年齡24~32歲,平均(27.03±2.68)歲,孕周37~39周,平均(37.89±3.47)周;重度子癇前期孕婦20例,年齡26~34歲,平均(29.46±3.78)歲,孕周32~37周,平均(35.91± 1.47)周。選擇同期血壓正常的晚期正常妊娠婦女20例為正常妊娠組,年齡22~30歲,平均(26.93±2.11)歲,孕周38~40周,平均(39.19±1.56)周。3組孕婦均為單胎妊娠,既往無心、肝、腎及內(nèi)分泌疾病史,無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥;此外,在年齡、孕周方面比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,并取得患者知情同意。

        1.2 主要儀器和試劑 IP-10 ELISA試劑盒(美國Sigma公司),酶標儀(VARIOSKAN FLASH Elx800型,美國Thermo公司),全自動熒光定量RT-PCR儀(美國羅氏公司),RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本東洋紡公司),RNA試劑盒(美國Promega公司),IP-10抗體(美國CST公司),CXCR3抗體(美國Abcam公司),兔二抗(美國Santacruze公司),PVDF膜(美國Sigma公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 ELISA檢測血清IP-10水平 抽取孕婦清晨空腹靜脈血2ml,分離出1.5ml血清,置于離心管,-70℃冰箱儲存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測IP-10水平。

        1.3.2 Western blot檢測胎盤組織中IP-10、CXCR3的蛋白表達 提取胎盤組織總蛋白,采用Bradford法測定蛋白濃度,并調(diào)整各標本至相同蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,4℃封閉過夜。用平皿以1∶200的比例在封閉液中稀釋一抗,4℃封閉孵育過夜。孵育一抗完畢,次日TBST緩沖液洗膜3次。在自封袋中按照1∶4 000的比例用封閉液稀釋二抗,將漂洗好的膜置于稀釋好的二抗中,37℃,于搖床上水平搖動,孵育50min,ECL顯示膠片感光顯影。使用Image J軟件掃描膠片上的圖像并得到灰度值,采用積分光密度法統(tǒng)計Western blot結(jié)果,以Actin光密度值作為內(nèi)參,兩者的積分光密度比值即為蛋白相對表達量。

        1.3.3 實時熒光定量RT-PCR檢測外周血CXCR3以及胎盤組織中IP-10、CXCR3的mRNA相對表達量(1)提取總RNA:抽取靜脈血4ml,均為EDTA抗凝;采用淋巴細胞分離液分離出有核細胞;使用Trizol試劑盒,按照操作說明書提取總RNA。并用相同方法提取胎盤組織中總RNA。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。(3)引物設(shè)計與合成:按照Genbank中人的CXCR3、(內(nèi)參照)基因序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,引物由杭州赫貝科技有限公司合成。IP-10,5′-GTGGCATTCAAGGAGTACCTC-3′(正義)和5′-TGATGGCCTTCGATTCTGGATT-3′(反義);CXCR3,5′-CCACCTAGCTGTAGCAGACAC-3′(正義)和 5′-AGGGCTCCTGCGTAGAA GTT-3′(反義);β-actin 5′-TGACCCAGATCATGTTTGAGA-3′(正義)和5′-TACGGCCAGAGGCGTACAGC-3′(反義)。(4)PCR擴增:采用全自動熒光定量RT-PCR儀進行反應(yīng)。20μl反應(yīng)體系中實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)預(yù)混液(2×)10.0μl,上下游引物各0.4μl,cDNA 2.0μl(終濃度為0.2μmol/L)。(5)擴增條件:95.0°C預(yù)變性3min,95.0°C變性10s,61.0°C退火/延伸20s,共40個循環(huán)。溶解曲線條件:從70°C到95°C,每10s上升0.5℃。擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析和測序以確定產(chǎn)物的特異性,產(chǎn)物測序由杭州赫貝科技有限公司完成。(6)使用BIO-RAD CFX Manager軟件進行自動分析并計算結(jié)果。循環(huán)閾值(Ct)與mRNA PCR初始表達量呈負相關(guān)?!鰿t代表目的基因相對于內(nèi)參照基因的表達量?!鰿t=Ct5-脂氧化酶-CtGAPDH。先將不同組別的△Ct值樣本均數(shù)用SPSS13.0軟件進行分析,發(fā)現(xiàn)差異均有統(tǒng)計學意義,則用2-ΔΔCt公式進行相對定量。

        1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料滿足正態(tài)分布,用表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

        2 結(jié)果

        2.1 血清IP-10水平 與正常妊娠組(94.8±14.5)pg/ml比較,輕、重度子癇前期[(118.8±29.0)、(169.3±28.8)pg/ ml]孕婦血清IP-10水平明顯增高(均P<0.05);重度子癇前期孕婦血清IP-10水平明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05)。

        2.2 外周血CXCR3 mRNA表達水平比較 與正常正常妊娠組10.07±5.66比較,輕、重度子癇前期(26.93± 6.48、50.15±6.06)孕婦外周血CXCR3 mRNA表達水平明顯增高(均P<0.05);重度子癇前期孕婦外周血CXCR3 mRNA表達水平亦明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05)。

        2.3 胎盤組織中IP-10、CXCR3的蛋白表達水平比較Western blot結(jié)果顯示,3組孕婦胎盤組織中均有IP-10、CXCR3蛋白表達,見圖1。輕、重度子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10、CXCR3蛋白表達水平均高于正常妊娠組(均P<0.05);此外,重度子癇前期組孕婦胎盤中CXCR3表達水平明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05),見表1。

        圖1 Westernblot檢測胎盤組織中IP-10、CXCR3蛋白表達電泳圖(A:正常妊娠組;B:輕度子癇前期組;C:重度子癇前期組)

        表1 3組孕婦胎盤組織中IP-10、CXCR3的蛋白表達水平比較

        2.4 胎盤組織中IP-10、CXCR3 mRNA表達水平比較輕、重度子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10、CXCR3 mRNA表達水平均高于正常妊娠組(均P<0.05);此外,重度子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10、CXCR3 mRNA表達水平均高于輕度子癇前期組(均P<0.05),見表2。

        表2 3組孕婦胎盤組織中IP-10、CXCR3mRNA表達水平比較

        2.5 子癇前期孕婦血清IP-10與CXCR3的相關(guān)性分析 子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達水平呈正相關(guān)(r=0.914,P<0.05),見圖2;子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10 mRNA表達水平與CXCR3 mRNA表達水平呈正相關(guān)(r=0.907,P<0.05),見圖3。

        圖2 40例子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達水平的散點圖

        圖3 40例子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10 mRNA水平與CXCR3mRNA表達水平的散點圖

        3 討論

        本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清IP-10水平明顯升高,且隨著病情加重而增高,提示血清IP-10水平可在一定程度上反映子癇前期孕婦的炎性損害程度。進一步檢測外周血單核細胞中CXCR3 mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達水平呈正相關(guān)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦胎盤組織中能檢測到IP-10、CXCR3的蛋白和mRNA表達,且明顯高于正常妊娠組;隨著病情加重,IP-10、CXCR3的蛋白和mRNA水平均明顯上升。Pearson相關(guān)分析顯示,子癇前期孕婦胎盤組織中IP-10 mRNA表達水平與CXCR3 mRNA表達水平呈正相關(guān)。筆者推測IP-10、CXCR3參與子癇前期疾病的發(fā)生、發(fā)展。

        IP-10屬于CXC家族趨化因子,來源于活化的成纖維細胞、單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和各種淋巴細胞等30余種細胞。人體IP-10 mRNA表達需要IFN-γ的刺激,且對IFN-γ有劑量和時間的依賴性。因此,IP-10與IFN-γ在某種程度上具有相互促進作用[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IP-10具有重要的生物學功能,能介導Th1型炎癥反應(yīng),還能抑制血管新生[2]。目前臨床研究發(fā)現(xiàn),在Th1型炎癥反應(yīng)為主的肺結(jié)核、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、病毒性肝炎和動脈粥樣硬化等疾病中,Th1細胞高度表達CXCR3,并能被其配體IP-10激活,產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時IP-10作為一種抗血管生成的潛在性因子,能增強滋養(yǎng)層細胞黏附、遷移和浸潤,能抑制造血干細胞功能,抑制血管新生,參與血管重鑄等。體內(nèi)外研究表明IP-10能有效抑制血管新生[6]。朱雪娟等[7]、Gotsch等[3]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕鼠子宮及胎盤組織中IP-10水平明顯高于正常妊娠孕鼠,與本研究結(jié)果一致。

        CXCR3是IP-10的受體,兩者在子宮均有表達,兩者的相互作用發(fā)揮著獨特的生物學功能。Hanna等[8]、Hirota等[9]應(yīng)用免疫組化和流式細胞儀分析,發(fā)現(xiàn)人絨毛滋養(yǎng)細胞及絨毛外滋養(yǎng)細胞表達CXCR3,且證實人體子宮內(nèi)膜上皮及基質(zhì)細胞中蛻膜自然殺傷細胞表達IP-10,通過結(jié)合CXCR3誘導滋養(yǎng)細胞遷移。Dominguez等[10]發(fā)現(xiàn)人體子宮內(nèi)膜細胞上有IP-10和CXCR3 mRNA表達。Romagnani等[11]研究發(fā)現(xiàn)CXCR3在內(nèi)皮細胞的表達具有細胞周期依賴性。在細胞活化和增生情況下,特別在內(nèi)皮細胞周期的S/G2-M期,CXCR3表達較為明顯。以上提示CXCR3能夠調(diào)節(jié)IP-10抑制血管生成的活性,并控制內(nèi)皮細胞增生。本研究發(fā)現(xiàn)隨著病情加重,胎盤組織中IP-10、CXCR3的蛋白和mRNA表達水平均明顯升高,可推測IP-10、CXCR3參與子癇前期病程。

        Th1/Th2型細胞因子失衡是關(guān)于子癇前期發(fā)病機制的一個重要學說[12]。子癇前期孕婦Th1型細胞比例和Th1/Th2明顯升高,且Th2型細胞比例明顯低于晚期正常妊娠婦女[1]。Th1型細胞高度表達CXCR3,并能被其配體IP-10激活,產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng),因此IP-10-CXCR3或者通過參與調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞比例來參與子癇前期病程。子癇前期的病理生理過程,實際上是促血管生成因子和抗血管生成因子的不平衡所致[13]。IP-10具有抑制血管新生的作用,將IP-10與人臍帶靜脈上皮細胞共同培養(yǎng)時,IP-10能抑制上皮細胞分化成管樣結(jié)構(gòu),并降低血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的覆蓋范圍[2]。因此,IP-10、CXCR3或通過抑制血管新生來參與子癇前期發(fā)生、發(fā)展的過程。

        綜上所述,IP-10及其受體CXCR3表達上調(diào)參與子癇前期病程,子癇前期孕婦血清、胎盤組織中IP-10與CXCR3均呈正相關(guān),可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān);這為進一步認識子癇前期發(fā)病機制提供了依據(jù),也為子癇前期臨床檢測與治療開拓了新思路。

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        Expression and significance of IFN-γ inducible protein 10 and its receptor CXCR3 in serum and placenta in pregnant women with preeclampsia


        ZHU Min,WANG Jianfang,XU Qiulian,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,Jinhua People's Hospital, Jinhua 321000,China

        【 Abstract】 Objective To investigate the expression of IFN-γ inducible protein 10(IP-10)and its receptor CXCR3 in placenta and serum of gravidas with preeclampsia. Methods Samples of placenta and serum were collected from normal gravidas,gravidas with mild preeclampsia and gravidas with severe preeclampsia with 20 cases in each group.The protein and mRNA expression of IP-10 and CXCR3 in placenta and serum was detected by ELISA,real-time PCR and Western blot, respectively. Results ELISA showed that serum IP-10 levels in patients with severe or mild preeclampisa were significantly higher than those in normal pregnancy group (P<0.05).The mRNA expression of CXCR3 in peripheral blood of patients with severe or mild preeclampisa was significantly higher than that in normal pregnancy group(P<0.05).Real-time PCR and Western blot showed that the expression levels of IP-10 and CXCR3 mRNA and protein in the placenta of severe or mild preeclampisa groups were significantly higher than those in normal pregnancy group(P<0.05).Conclusion The elevated expressions of IP-10 and its receptor CXCR3 in the placenta and serum may be involved in the pathogenesis ofpreeclampsia.

        IFN-γ inducible protein 10 CXCR3 Preeclampsia Serm Placenta

        2016-01-14)

        (本文編輯:陳丹)

        浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2013KYD276)

        321000 金華市人民醫(yī)院產(chǎn)科

        王建芳,E-mail:jefayeking@163.com

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