朱敏 王建芳 徐秋蓮 薛洪燕 金彥 章根琴 徐攀
IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10及其受體在子癇前期孕婦血清和胎盤(pán)組織中的表達(dá)
朱敏 王建芳 徐秋蓮 薛洪燕 金彥 章根琴 徐攀
目的 探討子癇前期孕婦血清及胎盤(pán)組織中IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)及其受體CXCR3的表達(dá)情況。方法 選擇同期住院的晚期正常妊娠、輕度子癇前期和重度子癇前期孕婦各20例。采用ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot等方法檢測(cè)血清IP-10水平、CXCR3 mRNA表達(dá)水平,以及胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3蛋白和mRNA表達(dá)水平;并對(duì)子癇前期孕婦IP-10與CXCR3進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果 與正常妊娠組比較,輕、重度子癇前期孕婦血清IP-10水平和CXCR3 mRNA表達(dá)水平均有不同程度的增高(均P<0.05),且均為重度子癇前期組高于輕度子癇前期組(均P<0.05)。此外,輕、重度子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3蛋白和mRNA水平均明顯高于正常妊娠組(均P<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示,子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.914,P<0.05);子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10 mRNA表達(dá)水平與CXCR3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.907,P<0.05)。結(jié)論 IP-10及其受體CXCR3表達(dá)上調(diào)參與子癇前期病程,子癇前期孕婦血清、胎盤(pán)組織中IP-10與CXCR3均呈正相關(guān),可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān)。
IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10 CXCR3 子癇前期 血清 胎盤(pán)
子癇前期是導(dǎo)致孕婦和圍生兒病死率的主要原因之一,應(yīng)予以重視,特別是重度子癇前期。子癇前期的病因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,可能與螺旋動(dòng)脈異常變形、慢性子宮胎盤(pán)缺血、上皮細(xì)胞功能不良、血管生成障礙、血管內(nèi)炎癥和Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡等因素有關(guān)[1]。IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(inducible protein 10,IP-10)是新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,由IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IP-10具有重要的生物學(xué)功能,能介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng),還能抑制血管新生[2]。Gotsch等[3]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清IP-10水平明顯高于正常妊娠婦女,提示IP-10可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān)。故本文通過(guò)檢測(cè)子癇前期孕婦血清及胎盤(pán)組織中IP-10及其受體CXCR3的表達(dá),旨在探討與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。
1.1 對(duì)象 選取2013年6月至2014年6月住院的子癇前期孕婦40例為研究對(duì)象,子癇前期的診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]:輕度子癇前期孕婦20例,年齡24~32歲,平均(27.03±2.68)歲,孕周37~39周,平均(37.89±3.47)周;重度子癇前期孕婦20例,年齡26~34歲,平均(29.46±3.78)歲,孕周32~37周,平均(35.91± 1.47)周。選擇同期血壓正常的晚期正常妊娠婦女20例為正常妊娠組,年齡22~30歲,平均(26.93±2.11)歲,孕周38~40周,平均(39.19±1.56)周。3組孕婦均為單胎妊娠,既往無(wú)心、肝、腎及內(nèi)分泌疾病史,無(wú)其他妊娠合并癥及并發(fā)癥;此外,在年齡、孕周方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并取得患者知情同意。
1.2 主要儀器和試劑 IP-10 ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma公司),酶標(biāo)儀(VARIOSKAN FLASH Elx800型,美國(guó)Thermo公司),全自動(dòng)熒光定量RT-PCR儀(美國(guó)羅氏公司),RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本東洋紡公司),RNA試劑盒(美國(guó)Promega公司),IP-10抗體(美國(guó)CST公司),CXCR3抗體(美國(guó)Abcam公司),兔二抗(美國(guó)Santacruze公司),PVDF膜(美國(guó)Sigma公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 ELISA檢測(cè)血清IP-10水平 抽取孕婦清晨空腹靜脈血2ml,分離出1.5ml血清,置于離心管,-70℃冰箱儲(chǔ)存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IP-10水平。
1.3.2 Western blot檢測(cè)胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3的蛋白表達(dá) 提取胎盤(pán)組織總蛋白,采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,并調(diào)整各標(biāo)本至相同蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,4℃封閉過(guò)夜。用平皿以1∶200的比例在封閉液中稀釋一抗,4℃封閉孵育過(guò)夜。孵育一抗完畢,次日TBST緩沖液洗膜3次。在自封袋中按照1∶4 000的比例用封閉液稀釋二抗,將漂洗好的膜置于稀釋好的二抗中,37℃,于搖床上水平搖動(dòng),孵育50min,ECL顯示膠片感光顯影。使用Image J軟件掃描膠片上的圖像并得到灰度值,采用積分光密度法統(tǒng)計(jì)Western blot結(jié)果,以Actin光密度值作為內(nèi)參,兩者的積分光密度比值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。
1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)外周血CXCR3以及胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3的mRNA相對(duì)表達(dá)量(1)提取總RNA:抽取靜脈血4ml,均為EDTA抗凝;采用淋巴細(xì)胞分離液分離出有核細(xì)胞;使用Trizol試劑盒,按照操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA。并用相同方法提取胎盤(pán)組織中總RNA。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。(3)引物設(shè)計(jì)與合成:按照Genbank中人的CXCR3、(內(nèi)參照)基因序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物由杭州赫貝科技有限公司合成。IP-10,5′-GTGGCATTCAAGGAGTACCTC-3′(正義)和5′-TGATGGCCTTCGATTCTGGATT-3′(反義);CXCR3,5′-CCACCTAGCTGTAGCAGACAC-3′(正義)和 5′-AGGGCTCCTGCGTAGAA GTT-3′(反義);β-actin 5′-TGACCCAGATCATGTTTGAGA-3′(正義)和5′-TACGGCCAGAGGCGTACAGC-3′(反義)。(4)PCR擴(kuò)增:采用全自動(dòng)熒光定量RT-PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。20μl反應(yīng)體系中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)預(yù)混液(2×)10.0μl,上下游引物各0.4μl,cDNA 2.0μl(終濃度為0.2μmol/L)。(5)擴(kuò)增條件:95.0°C預(yù)變性3min,95.0°C變性10s,61.0°C退火/延伸20s,共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件:從70°C到95°C,每10s上升0.5℃。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析和測(cè)序以確定產(chǎn)物的特異性,產(chǎn)物測(cè)序由杭州赫貝科技有限公司完成。(6)使用BIO-RAD CFX Manager軟件進(jìn)行自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。循環(huán)閾值(Ct)與mRNA PCR初始表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。△Ct代表目的基因相對(duì)于內(nèi)參照基因的表達(dá)量?!鰿t=Ct5-脂氧化酶-CtGAPDH。先將不同組別的△Ct值樣本均數(shù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則用2-ΔΔCt公式進(jìn)行相對(duì)定量。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料滿足正態(tài)分布,用表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。
2.1 血清IP-10水平 與正常妊娠組(94.8±14.5)pg/ml比較,輕、重度子癇前期[(118.8±29.0)、(169.3±28.8)pg/ ml]孕婦血清IP-10水平明顯增高(均P<0.05);重度子癇前期孕婦血清IP-10水平明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05)。
2.2 外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平比較 與正常正常妊娠組10.07±5.66比較,輕、重度子癇前期(26.93± 6.48、50.15±6.06)孕婦外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平明顯增高(均P<0.05);重度子癇前期孕婦外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平亦明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05)。
2.3 胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3的蛋白表達(dá)水平比較Western blot結(jié)果顯示,3組孕婦胎盤(pán)組織中均有IP-10、CXCR3蛋白表達(dá),見(jiàn)圖1。輕、重度子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3蛋白表達(dá)水平均高于正常妊娠組(均P<0.05);此外,重度子癇前期組孕婦胎盤(pán)中CXCR3表達(dá)水平明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05),見(jiàn)表1。
圖1 Westernblot檢測(cè)胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3蛋白表達(dá)電泳圖(A:正常妊娠組;B:輕度子癇前期組;C:重度子癇前期組)
表1 3組孕婦胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3的蛋白表達(dá)水平比較
2.4 胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3 mRNA表達(dá)水平比較輕、重度子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3 mRNA表達(dá)水平均高于正常妊娠組(均P<0.05);此外,重度子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3 mRNA表達(dá)水平均高于輕度子癇前期組(均P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 3組孕婦胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3mRNA表達(dá)水平比較
2.5 子癇前期孕婦血清IP-10與CXCR3的相關(guān)性分析 子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.914,P<0.05),見(jiàn)圖2;子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10 mRNA表達(dá)水平與CXCR3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.907,P<0.05),見(jiàn)圖3。
圖2 40例子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平的散點(diǎn)圖
圖3 40例子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10 mRNA水平與CXCR3mRNA表達(dá)水平的散點(diǎn)圖
本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清IP-10水平明顯升高,且隨著病情加重而增高,提示血清IP-10水平可在一定程度上反映子癇前期孕婦的炎性損害程度。進(jìn)一步檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中CXCR3 mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清IP-10水平與外周血CXCR3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中能檢測(cè)到IP-10、CXCR3的蛋白和mRNA表達(dá),且明顯高于正常妊娠組;隨著病情加重,IP-10、CXCR3的蛋白和mRNA水平均明顯上升。Pearson相關(guān)分析顯示,子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中IP-10 mRNA表達(dá)水平與CXCR3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。筆者推測(cè)IP-10、CXCR3參與子癇前期疾病的發(fā)生、發(fā)展。
IP-10屬于CXC家族趨化因子,來(lái)源于活化的成纖維細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和各種淋巴細(xì)胞等30余種細(xì)胞。人體IP-10 mRNA表達(dá)需要IFN-γ的刺激,且對(duì)IFN-γ有劑量和時(shí)間的依賴性。因此,IP-10與IFN-γ在某種程度上具有相互促進(jìn)作用[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IP-10具有重要的生物學(xué)功能,能介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng),還能抑制血管新生[2]。目前臨床研究發(fā)現(xiàn),在Th1型炎癥反應(yīng)為主的肺結(jié)核、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、病毒性肝炎和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中,Th1細(xì)胞高度表達(dá)CXCR3,并能被其配體IP-10激活,產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)IP-10作為一種抗血管生成的潛在性因子,能增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附、遷移和浸潤(rùn),能抑制造血干細(xì)胞功能,抑制血管新生,參與血管重鑄等。體內(nèi)外研究表明IP-10能有效抑制血管新生[6]。朱雪娟等[7]、Gotsch等[3]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕鼠子宮及胎盤(pán)組織中IP-10水平明顯高于正常妊娠孕鼠,與本研究結(jié)果一致。
CXCR3是IP-10的受體,兩者在子宮均有表達(dá),兩者的相互作用發(fā)揮著獨(dú)特的生物學(xué)功能。Hanna等[8]、Hirota等[9]應(yīng)用免疫組化和流式細(xì)胞儀分析,發(fā)現(xiàn)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)CXCR3,且證實(shí)人體子宮內(nèi)膜上皮及基質(zhì)細(xì)胞中蛻膜自然殺傷細(xì)胞表達(dá)IP-10,通過(guò)結(jié)合CXCR3誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移。Dominguez等[10]發(fā)現(xiàn)人體子宮內(nèi)膜細(xì)胞上有IP-10和CXCR3 mRNA表達(dá)。Romagnani等[11]研究發(fā)現(xiàn)CXCR3在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性。在細(xì)胞活化和增生情況下,特別在內(nèi)皮細(xì)胞周期的S/G2-M期,CXCR3表達(dá)較為明顯。以上提示CXCR3能夠調(diào)節(jié)IP-10抑制血管生成的活性,并控制內(nèi)皮細(xì)胞增生。本研究發(fā)現(xiàn)隨著病情加重,胎盤(pán)組織中IP-10、CXCR3的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高,可推測(cè)IP-10、CXCR3參與子癇前期病程。
Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡是關(guān)于子癇前期發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要學(xué)說(shuō)[12]。子癇前期孕婦Th1型細(xì)胞比例和Th1/Th2明顯升高,且Th2型細(xì)胞比例明顯低于晚期正常妊娠婦女[1]。Th1型細(xì)胞高度表達(dá)CXCR3,并能被其配體IP-10激活,產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng),因此IP-10-CXCR3或者通過(guò)參與調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞比例來(lái)參與子癇前期病程。子癇前期的病理生理過(guò)程,實(shí)際上是促血管生成因子和抗血管生成因子的不平衡所致[13]。IP-10具有抑制血管新生的作用,將IP-10與人臍帶靜脈上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),IP-10能抑制上皮細(xì)胞分化成管樣結(jié)構(gòu),并降低血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的覆蓋范圍[2]。因此,IP-10、CXCR3或通過(guò)抑制血管新生來(lái)參與子癇前期發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程。
綜上所述,IP-10及其受體CXCR3表達(dá)上調(diào)參與子癇前期病程,子癇前期孕婦血清、胎盤(pán)組織中IP-10與CXCR3均呈正相關(guān),可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān);這為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)子癇前期發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù),也為子癇前期臨床檢測(cè)與治療開(kāi)拓了新思路。
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Expression and significance of IFN-γ inducible protein 10 and its receptor CXCR3 in serum and placenta in pregnant women with preeclampsia
ZHU Min,WANG Jianfang,XU Qiulian,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,Jinhua People's Hospital, Jinhua 321000,China
【 Abstract】 Objective To investigate the expression of IFN-γ inducible protein 10(IP-10)and its receptor CXCR3 in placenta and serum of gravidas with preeclampsia. Methods Samples of placenta and serum were collected from normal gravidas,gravidas with mild preeclampsia and gravidas with severe preeclampsia with 20 cases in each group.The protein and mRNA expression of IP-10 and CXCR3 in placenta and serum was detected by ELISA,real-time PCR and Western blot, respectively. Results ELISA showed that serum IP-10 levels in patients with severe or mild preeclampisa were significantly higher than those in normal pregnancy group (P<0.05).The mRNA expression of CXCR3 in peripheral blood of patients with severe or mild preeclampisa was significantly higher than that in normal pregnancy group(P<0.05).Real-time PCR and Western blot showed that the expression levels of IP-10 and CXCR3 mRNA and protein in the placenta of severe or mild preeclampisa groups were significantly higher than those in normal pregnancy group(P<0.05).Conclusion The elevated expressions of IP-10 and its receptor CXCR3 in the placenta and serum may be involved in the pathogenesis ofpreeclampsia.
IFN-γ inducible protein 10 CXCR3 Preeclampsia Serm Placenta
2016-01-14)
(本文編輯:陳丹)
浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013KYD276)
321000 金華市人民醫(yī)院產(chǎn)科
王建芳,E-mail:jefayeking@163.com