周寧 沈健 唐黎群 勞迪波 孫東升

不同濃度鈉鹽飲食對自發(fā)性高血壓大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響

周寧 沈健 唐黎群 勞迪波 孫東升

目的 觀察不同濃度鈉鹽飲食對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓及左心室肥厚的影響，并探討其可能機(jī)制。方法將30只SHR大鼠隨機(jī)平均分成3組：（1）高鹽飲食（SHRh）組，飲用含4%氯化鈉溶液；（2）正常鹽飲食（SHRn）組，飲用0.9%氯化鈉溶液；（3）低鹽飲食（SHRl）組，飲用含0.4%氯化鈉溶液。另以10只Wistar大鼠作為對照組，飲用0.9%氯化鈉溶液。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗喂養(yǎng)12周。測定大鼠血壓動態(tài)變化及左室重量指數(shù)（LMI），采用RT-PCR法測定左心室心肌組織B型利鈉肽（BNP）RNA基因表達(dá)，并電鏡觀察左心室心肌組織變化。結(jié)果 SHR各組大鼠與對照組大鼠比較血壓明顯升高[SHRh組（226.33±7.81）mmHg，SHRn組（209.66±10.78）mmHg，SHRl組（223.83±9.62）mmHg，對照組（138.14±12.85）mmHg，均P＜0.05]，LMI升高（SHRh組16.35±2.54，SHRn組9.55±0.88，SHRl組11.17±2.20，對照組6.44±1.14，均P＜0.05）；SHRh組及SHRl組較SHRn組后期血壓更高，LMI也相應(yīng)升高，左心室BNP-RNA基因表達(dá)增加（SHRh組1.14±0.15，SHRl組1.22±0.51，SHRn組0.80± 0.51，均P＜0.05）。電鏡觀察顯示SHRh組及SHRl組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。結(jié)論 鈉鹽對SHR大鼠高血壓及心臟結(jié)構(gòu)功能的影響存在“J曲線”現(xiàn)象。

鈉鹽 自發(fā)性高血壓大鼠 血壓 左室肥厚 B型利鈉肽

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of dietary sodium contents on blood pressure and left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats(SHRs). Methods Thirty spontaneously hypertensive rats were randomly divided into 3 groups:high salt diet SHR group(drinking 4%NaCl solution,SHRh,n=10),normal salt diet SHR group(drinking 0.9%NaCl solution,SHRn,n=10),low salt diet SHR group(drinking 0.4%NaCl solution,SHRl,n=10).Wistar rats were used as control group (drinking 4%NaCl solution,n=10).After 1 wk of adaptive feeding,blood pressure was measured over 12 wks and left ventricular hypertrophy was examined by left ventricular mass index(LMI).RT-PCR was used to determine B-type natriuretic peptide(BNP) mRNA expression in left ventricle,and scan electron microscope(SEM)was used to observe the changes of left ventricular myocardium. Results Compared with control group,the blood pressure of SHRs increased significantly[SHRh(226.33±7.81) mmHg,SHRn(209.66±10.78)mmHg,SHRl(223.83±9.62)mmHg,control group(138.14±12.85)mmHg,P＜0.05],the left ventricular weight index was also increased (SHRh 16.35±2.54,SHRn 9.55±0.88,SHRl 11.17±2.20,controls 6.44±1.14,P＜0.05].In later period compared with SHRn,both SHRh and SHRl showed higher blood pressure and left ventricular mass index, and the expression of BNP mRNA in left ventricle increased(SHRh 1.14±0.15,SHRl 1.22±0.51,SHRn 0.80±0.51,P＜0.05).SEM showed that the myocardial cell structure was damaged in SHRh and SHRl groups. Conclusion The effects of salt stress on hypertension and left ventricular hypertrophy in SHR rats may present"J curve"phenomenon.

【 Key words】 Salt Spontaneously hypertensive rat Blood pressure Left ventricular hypertrophy B-typenatriuretic peptide

高血壓是最常見的心血管疾病之一。持續(xù)血壓升高可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)左心室肥厚，進(jìn)而影響心臟收縮功能，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。B型利鈉肽（BNP）被認(rèn)為是判斷心力衰竭的有效指標(biāo)，既往的動物實驗證實心力衰竭時心肌細(xì)胞BNP-RNA基因表達(dá)增加。眾多流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)食物中鈉鹽的含量與高血壓的發(fā)病有密切關(guān)系，不同鈉鹽含量的飲食可能導(dǎo)致不同的高血壓發(fā)生率及心血管結(jié)局[1]。既往研究表明高鹽飲食可能導(dǎo)致高血壓發(fā)病率增加，并且更容易并發(fā)左心室肥厚、心功能不全，對此認(rèn)識較為一致。然而低鹽與血壓、心臟結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系尚存爭議。通常認(rèn)為低鹽飲食可以降低高血壓的發(fā)病率，更有利于血壓的控制，進(jìn)而減輕甚至逆轉(zhuǎn)左心室肥厚。最近有研究發(fā)現(xiàn)過低的鈉鹽攝入量并不能降低高血壓的發(fā)病率，相反可能引起更多的并發(fā)癥。最近的一項薈萃分析顯示鈉鹽攝入量與高血壓發(fā)生存在“J曲線”現(xiàn)象，每日攝入鈉鹽＜2.5g或＞6g都可能使心血管事件的發(fā)生增加[2]。本實驗通過觀察不同濃度鈉鹽飲食對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）血壓、左心室肥厚以及心肌細(xì)胞BNP-RNA表達(dá)的影響，研究這種影響是否存在“J曲線”現(xiàn)象，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組和喂養(yǎng)方法 8周齡雄性Wistar大鼠及SHR購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2012-0002]。SHR大鼠30只，分為：（1）高鹽飲食組（SHRh組），飲用含4%氯化鈉溶液；（2）正常鹽飲食組（SHRn組），飲用0.9%氯化鈉溶液；（3）低鹽飲食組（SHRl組）飲用含0.4%氯化鈉溶液。以Wistar大鼠作為對照，正常鹽飲食，飲用0.9%氯化鈉溶液。每組10只，飲水25～30ml/d。各組大鼠單籠飼養(yǎng)，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動物室溫度（22±5）℃，相對濕度（45%±10%，光照12h，常規(guī)飼料，自由攝取食物，體質(zhì)量和攝食量每周記錄1次。共飼養(yǎng)12周。均于21周齡時結(jié)束實驗。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 血壓 采用RBP大鼠尾壓心率測定儀（上海高血壓研究所研制），以尾套法測量鼠尾動脈收縮壓，每只鼠測量3次，每4周測量1次。

1.2.2 左室重量指數(shù)（LMI） 開胸，取出心臟，冰0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干，去除心房、大血管及右室游離壁，將左心室+室間隔準(zhǔn)確稱量作為左心室重量（LVW），計算LVW與體質(zhì)量之比，即為LMI。

1.2.3 BNP測定 采用Trizol-離心柱法提取心肌細(xì)胞總RNA，高純總RNA快速提取試劑盒購自Generay公司，以相應(yīng)溶劑為對照（Blank），取2μl RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，設(shè)定A260/ A280＞2.0且A260/A230＜2合格，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司，熒光定量PCR擴(kuò)增,定量PCR儀為CFX Connect Real-Time PCR System，qPCR試劑 IQ SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司，引物序列Rat BNP Forward：CCAAGATGGCACATAGTTCAAGC，Rat BNP Reverse：AGAAGAGCCGCAGGCAGAGT目標(biāo)基因的Genbank ID為Gene ID：25105；PCR產(chǎn)物大小為 147 bp。使用配套分析軟件BIO-RAD CFX Manager分析BNP-mRNA表達(dá)情況。

1.2.4 電鏡觀察 動物處死后取左心室心肌，沿心肌纖維走向切1mm×1mm組織塊，放入2.5%戊二醛中固定過夜，0.1M PBS沖洗15min×2次，加入1%鋨酸后固定1h，0.1M PBS沖洗15min×2次，2%醋酸鈾水溶液染色30min，50%、70%、90%乙醇依次脫水，各15min×1次，100%乙醇脫水20 min×1次，100%丙酮脫水20 min×2次，無水丙酮與包埋劑按1:1體積混合滲透組織，震蕩2h，純包埋劑滲透組織，震蕩2h，純包埋劑包埋，并置于烘箱內(nèi)聚合，37℃聚合24h，45℃聚合24h，60℃聚合48h，修塊并超薄切片（約120nm），4%醋酸鈾染色20min，枸櫞酸鉛染色5min，將染色后的超薄切片放到單孔銅網(wǎng)上，TECNAI 10透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間血壓差異比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，左心室重量、LMI及BNP-mRNA差異比較采用協(xié)方差分析，組間死亡率的比較采用Fisher’s確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 一般情況、死亡率、體質(zhì)量及血壓 SHRh組及SHRl組與對照組相比，后期活動和進(jìn)食相對減少，反應(yīng)差，皮毛無光澤，精神不振、乏力，SHRh組與對照組比較體質(zhì)量有所下降（P＜0.05）。SHRn組與對照組相比活動和進(jìn)食無明顯差異。SHRh組5、8周時各死亡1只，死亡率為20%，SHRn組、SHRl組、對照組無死亡，組間死亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠隨年齡增長血壓進(jìn)行性升高。SHR各組較對照組升高（P＜0.05）。SHRh組、SHRl組與SHRn組相比前期血壓差異不明顯，但至第12周時升高更為明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表1。

2.2 左室重量及LMISHR各組與對照組相比，左室重量及LMI均明顯升高（均P＜0.05）；而SHRh組、SHRl組與SHRn組相比，左室重量及LMI又明顯升高（均P＜0.05），詳見表2。

2.3 左心室BNP-mRNA表達(dá)水平 SHR各組與對照組相比，BNP-mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；而SHRh組、SHRl組與SHRn組相比，BNP-mRNA表達(dá)水平又明顯升高（P＜0.05），詳見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量（g）及血壓（mmHg）變化情況

表2 各組大鼠左室重量、LMI及BNP-mRNA表達(dá)情況

2.4 不同濃度鈉鹽飲食與血壓、LMI及左心室BNP-mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系 實驗后期SHRh組、SHRl組較SHRn組血壓更高，左室肥厚更嚴(yán)重，不同濃度鈉鹽飲食與血壓、LMI及左心室BNP-mRNA表達(dá)水平之間存在“J曲線”現(xiàn)象，詳見圖1。

圖1 不同濃度鈉鹽飲食與血壓、LMI、BNP-mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系

2.5 電鏡檢查所見 （1）對照組：心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲排列整齊，緊密，肌絲間線粒體豐富，大小均一，雙層膜結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)部嵴清晰可見，無斷裂，溶解等現(xiàn)象，肌漿網(wǎng)較正常，見圖2。（2）SHRn組：心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲排列整齊，線粒體較少，排列疏松，大小差別較大，雙層膜結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部嵴斷裂、溶解，部分線粒體周圍存在空泡化，肌漿網(wǎng)與Wistar組相比無明顯差異，見圖3。（3）SHRl組：心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲排列疏松，部分肌絲斷裂，線粒體數(shù)目減少，排列不規(guī)律，呈散在狀態(tài)，線粒體結(jié)構(gòu)與SHRn組相似，膜結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部嵴溶解，肌漿網(wǎng)較正常組增多，變寬，見圖4。（4）SHRh組：心肌細(xì)胞內(nèi)肌絲排列整齊，線粒體數(shù)目減少不明顯，可見雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部嵴斷裂或部分溶解，肌漿網(wǎng)輕度變寬，見圖5。

3 討論

高血壓是常見多發(fā)的心血管疾病。鈉鹽的攝入與高血壓的發(fā)生、發(fā)展以及左心室肥厚都具有相關(guān)性。最近的一項薈萃分析顯示，鈉鹽攝入量與高血壓的發(fā)生存在“J曲線”現(xiàn)象，每日攝入鈉鹽低于2.5g或高于6g都可能使心血管事件的發(fā)生增加。O’Donnell等[3]研究發(fā)現(xiàn)在非洲人群中限制鈉鹽3g/d以下與基線相比，人群發(fā)生心血管事件，包括心血管病死亡、心肌梗死、腦卒中和心力衰竭入院的風(fēng)險明顯升高；而攝入鈉鹽＞7g/d，其心血管事件風(fēng)險則更大；由此推測人群的合理鈉鹽水平為4～5.99g/d。目前對于高鹽飲食致血壓升高作用的認(rèn)識較為一致。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)鈉鹽攝入量高的人群，其平均血壓水平和高血壓患病率也相應(yīng)較高。長期高鹽飲食可以激活交感內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）途徑，最終表現(xiàn)為醛固酮分泌增加[4]，進(jìn)而促使血壓升高。本研究同樣發(fā)現(xiàn)高鹽飲食的大鼠血壓更高，再次證實了這一觀點。低鹽對于高血壓的作用尚存爭議。對于既往高鹽飲食的高血壓患者通過低鈉、高鉀飲食能起到降壓作用已成為共識。然而同樣有研究表明，對于高血壓心力衰竭患者嚴(yán)格限制鈉鹽，當(dāng)出現(xiàn)體質(zhì)量明顯下降時，會出現(xiàn)醛固酮的升高，心血管事件反而增加[5]。推測其原因為過度的低鈉激活了RAAS，刺激腎上腺皮質(zhì)，使醛固酮分泌增加，進(jìn)而引起血壓的升高。本研究發(fā)現(xiàn)低鹽飲食組大鼠第12周體質(zhì)量較第8周有所下降，血壓較正常飲食組升高，可能為同樣原因。

圖2 對照組心肌電鏡檢查所見（a：×3700，b：×24000）

圖3 SHRn組心肌電鏡檢查所見（a：×3700，b：×24000）

圖4 SHRl組心肌電鏡檢查所見（a：×3700，b：×24000）

圖5 SHRh組心肌電鏡檢查所見（a：×3700，b：×24000）

左心室肥厚是高血壓引起的重要并發(fā)癥之一，左心室肥厚既是高血壓嚴(yán)重程度的一項指標(biāo)，又是一個獨立的高血壓患者心血管發(fā)病率和病死率的預(yù)測指標(biāo)。LMI是動物實驗中常用的衡量左心室肥厚的指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)較長時間的高鹽或低鹽飲食情況下，SHR大鼠LMI同樣明顯升高，表明SHR大鼠出現(xiàn)了明顯的左心室肥厚。過量的鈉鹽還可以作為心臟肥大及心肌纖維化的誘導(dǎo)物，直接調(diào)節(jié)心臟肌母細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的生長，導(dǎo)致心肌肥厚[6]。低鹽對于左心室肥厚的作用同樣存在爭議。一般認(rèn)為低鹽飲食在降低血壓的同時，使左心室肥厚的發(fā)生相應(yīng)減少。然而長期的低鹽飲食激活RAAS后，同樣可以使醛固酮分泌增加，導(dǎo)致左心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展[7]。同時低鹽飲食可能會增加胰島素抵抗[8]。高濃度的胰島素通過激活血管內(nèi)皮的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路，使內(nèi)皮素-1（ET-1）分泌增加，導(dǎo)致血管收縮，血壓升高。而激活的RAAS又抑制了胰島素通過IRS-1/PI3K途徑所起的抗炎、抗氧化作用，使SHR大鼠更容易發(fā)生血管硬化和左心室肥厚[9]。由于低鈉可引起細(xì)胞水腫，因此本研究觀察到低鹽飲食對心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞比正常鹽、高鹽飲食更強(qiáng)。

BNP是一種具有利鈉、利尿和血管擴(kuò)張作用的肽類激素，能抑制RAAS與抗利尿激素的分泌。BNP在心室壁應(yīng)力增加時分泌增加。左心室肥厚的過程中伴隨著BNP基因表達(dá)的增加及其編碼蛋白水平的增加[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者BNP水平高于臨界高血壓者及正常人，在伴隨左心室肥厚的高血壓患者中更高[11]。通過降壓治療逆轉(zhuǎn)左心室肥厚后，患者的BNP水平相應(yīng)降低[12]，提示BNP與高血壓左心室肥厚具有明顯的相關(guān)性。左心室心肌細(xì)胞BNP基因表達(dá)的增加受RASS介導(dǎo)。既往一項研究發(fā)現(xiàn)，大鼠注射血管緊張素Ⅱ后無論是血漿BNP水平，還是左心室心肌BNP基因的表達(dá)水平均升高，在高鹽飲食大鼠中更為明顯[13]。而在心力衰竭患者中嚴(yán)格限制鈉鹽飲食并予利尿劑治療后，一旦患者出現(xiàn)體質(zhì)量變化，其血漿腎素活性隨之升高，最終表現(xiàn)為BNP升高，180d的心血管事件增加[14]。由此可見，高鹽及低鹽飲食均可以通過激活RASS引起B(yǎng)NP水平的升高。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為高血壓患者鈉鹽攝入量越低越好。但是最新研究發(fā)現(xiàn)高鹽與低鹽都會引起血壓的升高，存在“J曲線”現(xiàn)象。對于不同人群鈉鹽的低限仍存在爭議，不同的年齡、性別、種族，以及不同的環(huán)境條件使人群適宜的鈉鹽水平具有差異性，因此WHO建議進(jìn)行更多的研究。本研究發(fā)現(xiàn)給予極低的鈉鹽負(fù)荷和高鈉鹽負(fù)荷均可導(dǎo)致SHR血壓升高，左心室肥厚加重，從動物實驗上證實了“J曲線”現(xiàn)象的存在。在實驗的初期這一作用并不明顯，后期（12周）才出現(xiàn)血壓的差異，其原因可能為低鹽或高鹽飲食需長期攝入才能影響血鈉水平，進(jìn)而激活RAAS。高鹽飲食和低鹽飲食雖然對血壓升高、左心室肥厚的發(fā)生、發(fā)展具有相似的作用，然而本研究結(jié)果提示高鹽飲食對血壓和左心室肥厚的作用更強(qiáng)。由此有理由可以確定，攝入量合理的鈉鹽飲食更有利于對血壓的控制。

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Effects of dietary sodium contents on blood pressure and left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats

ZHOU Ning, SHEN Jian,TANG Liqun,et al.Geriatrics VIP Ward，Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

2015-08-07）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃（2012KYB025）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院干部科（周寧、唐黎群、勞迪波、孫東升）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)（沈?。?/p>

孫東升，E-mail：sunds@163.com