屠苗英 王秀敏 董關(guān)萍 傅君芬 毛立英

●論 著

小于胎齡兒Clock、Bmal1基因表達與胰島素、胰島素樣因子-1水平的臨床研究

屠苗英 王秀敏 董關(guān)萍 傅君芬 毛立英

目的 探討小于胎齡兒（SGA）胎盤血、臍帶血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達及與胰島素、胰島素樣因子-1（IGF-1）的相關(guān)性。方法 選擇2013年1—12月新生兒67例，其中SGA 31例，適于胎齡新生兒（AGA）36例；采用酶化學發(fā)光法測定臍帶血、胎盤血胰島素、IGF-1，采用競爭性RT-PCR法測定胎盤血、臍帶血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平。結(jié)果SGA組出生體重、BMI、身高、胎盤血胰島素和IGF-1水平、臍帶血胰島素和IGF-1水平均低于AGA組（均P＜0.05）；胎盤血、臍帶血胰島素水平，臍帶血IGF-1水平與出生體重均存在相關(guān)性（均P＜0.01）。SGA組胎盤血、臍帶血淋巴細胞中Bmal1基因表達水平均高于AGA組（均P＜0.01）；而Clock基因表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平與出生體重、胰島素、IGF-1水平均無相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)論 SGA血清胰島素和IGF-1水平較低，臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Bmal1基因表達水平較高；新生兒生理節(jié)奏性的發(fā)展受母體生物鐘節(jié)奏的影響。

小于胎齡兒 胰島素 胰島素樣因子-1 Clock Bmal1

我國小于胎齡兒（small for gestational age，SGA）發(fā) 生率約為9.1%[1]，以低出生體重兒為主。研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)環(huán)境異常導致胎兒宮內(nèi)發(fā)育異常的人群，其成人期糖代謝異常、2型糖尿病、心血管疾病等發(fā)病率明顯增高，可能與生物鐘基因表達異常有關(guān)[2-6]。營養(yǎng)物質(zhì)、胰島素和胰島素樣生長因子-1（insulin-likegrowthfactor type-1，IGF-1）等是調(diào)控胎兒生長發(fā)育的重要內(nèi)分泌因素，通過營養(yǎng)物質(zhì)-胰島素-IGF-1代謝軸調(diào)節(jié)胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育。生物鐘系統(tǒng)功能的完整性對葡萄糖的調(diào)節(jié)和胰島素的分泌有著重要影響。Clock、Bmal1基因是生物鐘基因的核心基因，Clock、Bmal1蛋白涉及葡萄糖的動態(tài)平衡和胰島素抵抗[7]。本研究主要探究SGA母體及其出生時Clock、Bmal1基因表達特點，以及與影響胎兒宮內(nèi)能量代謝因子如胰島素和IGF-l的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年1—12月在諸暨市婦幼保健院產(chǎn)科出生的SGA 31例，其中男16例，女15例；胎齡37~40周，平均（38.39±1.05）周；剖宮產(chǎn)10例，陰道分娩21例。隨機選取同期出生、孕周匹配的適于胎齡新生兒（AGA）36例作為對照組，其中男18例，女18例；胎齡37~40周，平均（38.22±1.57）周；剖宮產(chǎn)13例，陰道分娩23例。兩組新生兒在性別、胎齡方面，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。AGA、SGA診斷標準參照1988年中國15城市新生兒體格發(fā)育科研協(xié)作組提出的不同胎齡新生兒出生體重值[8]，即出生體重在同胎齡兒平均體重的第10百分位以下為SGA，出生體重在同胎齡兒平均體重的第10百分位至第90百分位為AGA。兩組新生兒均為單胎，無外觀畸形，無窒息搶救史，母親無原發(fā)性心肝腎疾病史、甲狀腺疾病史、妊娠期糖耐量異常、妊娠期糖尿病、原發(fā)性糖尿病。

1.2 方法

1.2.1 BMI計算 根據(jù)護士測量并記錄的新生兒體重、身高，計算BMI。

1.2.2 標本采集 （1）臍帶血采集：新生兒娩出斷臍后，立即從臍帶新生兒端抽取靜脈血1、3ml[9]，分別注入抗凝的乙二胺四乙酸（EDTA）管、促凝劑+分離膠管，送檢驗科。對抗凝的EDTA管血清標本1ml離心處理來提取淋巴細胞后，置-80℃冰箱保存，待標本收集全后統(tǒng)一作基因RNA檢測；對促凝劑+分離膠管的血清標本3ml常溫離心15min（3 000r/min，離心半徑9.5cm），留取血清1ml，直接檢測胰島素及IGF-l。（2）胎盤血采集：胎盤娩出后用相同方法從胎盤母體面靜脈中抽取靜脈血1、3ml[10]，分別注入抗凝的EDTA管、促凝劑+分離膠管，立即送檢驗科，處理方法同上。

1.2.3 標本檢測 采用酶化學發(fā)光法測定臍血、胎盤血胰島素及IGF-1水平。臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1的mRNA水平測定：（1）總RNA提取和cDNA合成：參照Trizol LS reagent（美國，Invitrogen，10296010）試劑說明書提取RNA，再參照RevertAidTMFirstStrandcDNA SynthesisKit（加拿大，F(xiàn)ermentas，K1621）說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成。（2）用計算機輔助設(shè)計競爭性RT-PCR目的基因Clock、Bmal1擴增片段的引物。Clock上游引物序列為5′-CACAAGGCATGTCCCAGTTTC-3′，下游引物序列為 5′-ATTTGATTGT TGCA AAAACATCTG-3′；Bmal1上游引物序列為5′-CTTCTCCAGGAGGCAAGAAGATT-3′， 下 游 引 物 序 列 為 5′-CTATGTGGGGGTTCTCACCAAG-3′；參照基因組GAPDH上游引物序列為5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，下游引物序列為5′-CTGCAAATGAGCCCCAGC-3′。（3）RT-PCR反應體積為10ml，體系中含cDNA 1.5μl、上游引物 0.4μl，下游引物 0.4μl。熱循環(huán)條件：95℃2min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，76℃5s；40個循環(huán)，最后收集熒光信號。（4）記錄CT值，即基因表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料符合正態(tài)分布，用表示，組間比較采用t檢驗；胰島素、IGF-1水平與出生體重的相關(guān)性采用多元線性回歸分析；Clock、Bmal1基因表達水平與臨床指標的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組新生兒臨床指標檢測結(jié)果比較 SGA組出生體重、BMI、身高、胎盤血胰島素和IGF-1水平、臍帶血胰島素和IGF-1水平均低于AGA組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。胎盤血、臍帶血胰島素水平，臍帶血IGF-1水平與出生體重均存在相關(guān)性（均P＜0.01），見表2。

表1 兩組新生兒臨床指標比較

2.2 兩組新生兒臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平比較 SGA組臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Bmal1基因表達水平均高于AGA組（均P＜0.01）；而兩組新生兒臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock基因表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。

表2 胰島素、IGF-1水平與出生體重的多元線性回歸分析

表3 兩組新生兒臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平比較

2.3 新生兒臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平與臨床指標的關(guān)系 新生兒臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平與出生體重、胰島素、IGF-1等臨床指標間均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表4。

表4 新生兒臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Clock、Bmal1基因表達水平與臨床指標的相關(guān)性分析

3 討論

相關(guān)研究表明母親妊娠期受外界環(huán)境的影響如貧困、產(chǎn)前用藥、社會壓力、輪班制等，會對胎兒正常發(fā)育產(chǎn)生持久影響，并持續(xù)到其成年[2-4]。某小鼠實驗發(fā)現(xiàn)持續(xù)干擾小鼠生物鐘，會增加流產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重兒等風險[2-6]。營養(yǎng)物質(zhì)、胰島素和IGF-l是調(diào)控胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的重要內(nèi)分泌因素[11-15]。胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，而葡萄糖是胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的能量來源，有動物實驗證實藥物抑制胰島素分泌后，胎兔重量和骨骼長度均減少7%~13%[16]。因此，胎兒胰島素分泌異常會影響胎兒對葡萄糖的利用，改變胎兒生長發(fā)育速率，從而導致低出生體重兒或巨大兒。Yuan等[17]研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎鼠胰島素水平較低；Chiesa等[15]研究發(fā)現(xiàn)大于胎齡兒（LGA）臍帶血胰島素水平高于AGA；而本研究顯示胎盤血、臍帶血胰島素，臍帶血IGF-l水平與出生體重均呈正相關(guān)，與以上結(jié)果相似。胰島素能促進胎盤中IGF-1合成，IGF-1可影響胎盤葡萄糖氨基酸轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)胎兒胰島素釋放[18]。本研究發(fā)現(xiàn)臍帶血SGA的IGF-1明顯低于AGA，與Vatten等[19]研究發(fā)現(xiàn)足月新生兒IGF-1水平與出生體重呈正相關(guān)的結(jié)果相似。

母體宮內(nèi)生物鐘機制調(diào)節(jié)異常，可能會損害胎兒發(fā)育，生物鐘調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)、碳水化合物代謝，炎癥持續(xù)的代謝性疾病發(fā)生、發(fā)展的進程[20]。本研究表明SGA組臍帶血淋巴細胞中Bmal1基因表達水平高于AGA組，但Clock基因表達差異無統(tǒng)計學意義。Clock、Bmal1是生物鐘核心基因，其蛋白產(chǎn)物Clock、Bmal1具有bHLH-PAS域的轉(zhuǎn)錄因子，可形成異二聚體Clock/Bmal1與Per、Cry基因啟動子的E-box CACGTG序列結(jié)合，激活3種Per、2種Cry基因的轉(zhuǎn)錄[21]；此外，Clock/Bmal1二聚體可轉(zhuǎn)移活化的Rev-erba、Rora基因，其蛋白產(chǎn)物通過競爭性結(jié)合Bmal1的啟動子元件Rev-erba/Rora來驅(qū)動Bmal1周期節(jié)律性轉(zhuǎn)錄與關(guān)閉該回路[22]。妊娠期母體時鐘與代謝間潛在聯(lián)系可能來自組織氧化還原狀態(tài)細胞的差異[23]；本研究表明了母體胎盤血與新生兒臍血生物鐘基因的同步性，提示新生兒生理節(jié)奏性的發(fā)展受母體生物鐘節(jié)奏的影響。SGA組母親營養(yǎng)不良環(huán)境使得生物鐘基因節(jié)律紊亂，導致糖代謝紊亂，從而影響胎兒生長發(fā)育。Rev-erbα是調(diào)節(jié)生物過程的鐘因子，暴露于壓力大、營養(yǎng)不良環(huán)境中的小鼠，其Rev-erbα表達明顯減少[24]；在敲除小鼠Rev-erbα改變時鐘機制的功能后，其Bmal1和Clock基因表達增強[25]。本研究發(fā)現(xiàn)Bmal1、Clock基因表達水平與新生兒出生體重、胰島素和IGF-1均未見相關(guān)，可能與新生兒生物鐘基因與胰島素、IGF-1間尚未建立穩(wěn)定聯(lián)系有關(guān)[22]，亦可能與中樞生物鐘基因、調(diào)節(jié)胎兒生長發(fā)育的其他因素如糖皮質(zhì)激素、瘦素等有關(guān)。

綜上所述，SGA血清胰島素和IGF-1水平較低，臍帶血、胎盤血淋巴細胞中Bmal1基因表達水平較高；新生兒生理節(jié)奏性的發(fā)展受母體生物鐘節(jié)奏的影響。建議動態(tài)追蹤SGA血清淋巴細胞中Clock、Bmal1基因動態(tài)表達特點，以明確生物鐘基因與成年后代謝性疾病患病風險的關(guān)聯(lián)與機制。

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Expression of Clock,Bmal1 mRNA and levels of Insulin,IGF-1 in umbilical and placental blood of small for gestational age newborns

TU Miaoying,WANG Xiumin,DONG Guanping,et al.Department of Endocrinology，the Children's Hospital of Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Clock,Bmal1 mRNA and the levels of insulin,Insulin-like growth factor type-1(IGF-1)in umbilicaland placentalblood smallfor gestationalage(SGA)newborns. Methods Sixty-seven cases of newborns delivered in Zhuji Maternal and Child Health Care Hospital from January to December 2013 were enrolled in the study, including 31 SGAinfants and 36 appropriate for gestationalage(AGA)infants.The levels ofinsulin and IGF-1 in cord and placental blood were measured by enzymology bioluminescence;the expressions of Clock and Bmal1 mRNA in cord and placental lymphocytes were tested by competitive RT-PCR in both groups. Results The weight and BMI in SGA group were significantly lower than those in the AGA group(P＜0.05).The levels of Insulin,IGF-1 and expression of in SGA were significantly lower than those in AGA group(P＜0.05).The expression ofBmal1 mRNA in SGA group was significantly higher than that in AGA group(P＜0.05),while there was no significant difference in expression of Clock mRNA between two groups(P＞0.05).The expression of Bmal1 mRNA was not correlated with the weight of newborn,insulin and IGF-1 levels in umbilical and placental blood(P＞0.05). Conclusion SGA newborns have lower insulin,IGF-1 levels and higher expression of Bmal1 mRNA.The maternal Clock rhythm influences the neonatalcircadian rhythm.

Smallfor gestationalage Insulin Insulin-like growth factor type-1 Clock Bmal1

2015-07-27）

（本文編輯：陳丹）

國家自然科學基金資助項目（81370930）

310003 杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科（屠苗英、董關(guān)萍、傅君芬，屠苗英系浙江大學醫(yī)學院在職研究生，現(xiàn)在諸暨市婦幼保健院兒科工作）；上海兒童醫(yī)學中心內(nèi)分泌科（王秀敏）；諸暨市婦幼保健院兒科（毛立英）

王秀敏，E-mail：wangxiumin1019@126.com