朱人大 李曉強(qiáng)

3-甲基腺嘌呤對(duì)EPCs超微結(jié)構(gòu)和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響研究

朱人大 李曉強(qiáng)

目的 探索3-甲基腺嘌呤（3-MA）對(duì)大鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）超微結(jié)構(gòu)和自噬體膜型（LC3-II）蛋白表達(dá)的影響。方法采用密度梯度法取大鼠骨髓EPCs，體外誘導(dǎo)分化并鑒定；分成對(duì)照組和4個(gè)3-MA濃度組（分別加入1．25、2．5、5、10mmol/L 3-MA)。采用單丹（磺）酰戊二胺（MDC）熒光染色和透射電鏡觀察3-MA給藥后EPCs自噬的發(fā)生。Western blot檢測(cè)3-MA給藥后EPCs內(nèi)LC3-II蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果MDC熒光染色和透射電鏡均觀察到5、10 mmol/L組EPCs超微結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于正常及死亡細(xì)胞，是典型的凋亡形態(tài)圖。Western blot檢測(cè)3-MA給藥24h后EPCs LC3-II蛋白表達(dá)降低；與對(duì)照組比較，5、10 mmol/L組LC3-II蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0．05）。結(jié)論5、10mmol/L的3-MA對(duì)EPCs超微結(jié)構(gòu)和LC3-II蛋白表達(dá)均有影響，推測(cè)濃度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

內(nèi)皮祖細(xì)胞 單丹（磺）酰戊二胺 3-甲基腺嘌呤

Asahara等[1]于1997年首次詳細(xì)描述了內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在缺血組織新生血管形成中的作用，近年來(lái)EPCs已成為研究熱點(diǎn)[2-4]。深靜脈血栓形成（DVT）是一種臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年至少有500萬(wàn)人患DVT，我國(guó)每年DVT新發(fā)病例超過(guò)25萬(wàn)，目前主要有保守治療和手術(shù)取栓兩種治療方法，對(duì)于7d內(nèi)急性期血栓效果尚可，對(duì)于慢性期血栓的效果欠佳。選擇更為有效的治療方法來(lái)提高DVT治愈率、降低后遺癥發(fā)生率以及促進(jìn)血栓再通是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EPCs能改變血栓的微環(huán)境，而血栓機(jī)化、再通均與微環(huán)境密切相關(guān)，將經(jīng)鑒定的EPCs移植到慢性血栓中，能有效促進(jìn)血栓機(jī)化與再通[5]。3-甲基腺嘌呤（3-MA）是當(dāng)前公認(rèn)的自噬抑制劑，前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)一定濃度的3-MA可促進(jìn)EPCs增殖，本研究進(jìn)一步檢測(cè)各種濃度3-MA對(duì)EPCs自噬的抑制作用，以探討其對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和自噬體膜型（LC3-Ⅱ）蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及檢測(cè)儀器 3周齡的Wistar大鼠20只，體重50～80g，雌雄不限，由中國(guó)生命科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；EGM-2MV EPCs培養(yǎng)基，美國(guó)Chemicon公司生產(chǎn)；3-MA、單丹（磺）酰戊二胺（MDC）、βactin（A5441）抗體、FITC-二抗，均由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；BCA蛋白定量試劑盒，美國(guó)Pierce公司生產(chǎn)；LC3抗體，美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)；TMB顯色液（TMB Stabilized Substrate for HRP），Promega公司生產(chǎn)。倒置顯微鏡（Olympus）、倒置熒光顯微鏡（eclipse TE2000-U型），由蘇州大學(xué)血液研究所提供，日本Nikon公司生產(chǎn)；切片機(jī)（LKB-1型）、透射電鏡（CM-120型）均由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室提供，荷蘭Philips公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 EPCs培養(yǎng)、鑒定 無(wú)菌條件下分離出大鼠股骨，沖出骨髓，制成單細(xì)胞懸液備用。加入EPCs培養(yǎng)基（EGM-2MV），青、鏈霉素以（0.8～1.0）×106/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶，5%CO2、37℃環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)至第12天，PBS洗滌，貼壁細(xì)胞備用。用免疫組化和免疫熒光鑒定EPCs特異性標(biāo)志VEGFR-2、CD34和CD133的表達(dá)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞培養(yǎng)12d，胰蛋白酶消化、重懸呈單細(xì)胞懸液，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即對(duì)照組（僅加入EGM-2MV）、3-MA組（分別加入1.25、2.5、5、10mmol/L 3-MA），并于24h后收集細(xì)胞，計(jì)算每組細(xì)胞數(shù)量并作及時(shí)調(diào)整，使各組細(xì)胞數(shù)量基本相等。

1.2.3 MDC熒光染色檢測(cè) （1）MDC染色液配制：取MDC粉末溶于二甲基亞砜中，終濃度為0.1mol/L，分裝后-20℃保存；臨用前用EGM-2MV培養(yǎng)基稀釋為50μmol/L。（2）MDC熒光染色：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EPCs，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于24孔板，次日給予含各濃度3-MA的EGM-2MV，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基；給藥24h后改用含MDC的新鮮培養(yǎng)基孵育10min；PBS洗滌細(xì)胞2次；用紫外線激發(fā)，在倒置熒光顯微鏡下觀察、攝片。

1.2.4 透射電鏡觀察3-MA對(duì)EPCs超微結(jié)構(gòu)的影響（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EPCs，在對(duì)照組和3-MA（5、10mmol/ L）的EGM-2MV培養(yǎng)基給藥24h后收集細(xì)胞，PBS離心洗滌，將細(xì)胞收集于離心管中；（2）固定；（3）脫水；（4）浸透；（5）固化；（6）LKB-1型超薄切片機(jī)切片（50～60nm）；（7）3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色；（8）Philips CM-120透射電鏡下觀察、攝片。

1.2.5 Western blot檢測(cè)觀察3-MA對(duì)EPCs LC3蛋白表達(dá)的影響 （1）樣品制備：對(duì)照組與不同濃度3-MA組，24h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，細(xì)胞懸液充分離心，往沉淀中加入適量含PMSF的細(xì)胞裂解液（PMSF：裂解液=1∶50），吹勻，置冰上30min以充分裂解細(xì)胞；加入5×樣品緩沖液，100℃煮沸8min，離心10min，取上清液，樣品即可使用，也可-20℃凍存?zhèn)溆?。?）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。（3）Western blot檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜。（4）蛋白質(zhì)免疫檢測(cè)：封閉、一抗、洗膜、二抗、洗膜、TMB顯色。（5）圖像分析：用Image J軟件得出圖片中目的條帶灰度值，并除以?xún)?nèi)參GAPDF灰度值，得出該樣品目的蛋白相對(duì)含量；每組數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料滿足方差齊性，用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MDC熒光染色檢測(cè)3-MA對(duì)EPCs的自噬作用給藥24h后，對(duì)照組、1.25mmol/L組和2.5mmol/L組均有點(diǎn)狀熒光顆粒散布于EPCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而5、10mmol/L組的EPCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無(wú)熒光顆粒出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組與不同濃度3-MA給藥24h后EPCs倒置熒光顯微鏡下所見(jiàn)（MDC熒光染色，×400）

2.2 透射電鏡觀察3-MA對(duì)EPCs超微結(jié)構(gòu)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)12d后電鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體、溶酶體等細(xì)胞器，細(xì)胞核及核內(nèi)染色體形態(tài)與分布均正常，見(jiàn)圖2A；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有少量明顯的獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡出現(xiàn)，見(jiàn)圖2B。5、10mmol/L組給藥24h后，可以觀察到細(xì)胞質(zhì)發(fā)生固縮，染色質(zhì)濃縮、邊集，呈境界分明的半月?tīng)罨驂K狀附于核膜，可見(jiàn)到細(xì)胞核發(fā)生固縮、斷裂，這種超微結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于正常及死亡細(xì)胞，是典型的凋亡形態(tài)圖，見(jiàn)圖2C、2D。對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡，加藥組中沒(méi)有出現(xiàn)獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡和自噬溶酶體。加藥組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體發(fā)生腫脹、變圓，個(gè)別細(xì)胞空泡化，基質(zhì)變淺，嵴變少，出現(xiàn)縱向嵴和同心圓嵴，可見(jiàn)到空泡狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在整個(gè)觀察中，未見(jiàn)細(xì)胞腫脹等壞死形態(tài)特征出現(xiàn)，見(jiàn)圖2。

2.3 不同濃度3-MA給藥24h后EPCs LC3-Ⅱ蛋白表達(dá) 給藥24h后，與對(duì)照組 （0.9936±0.052）比較，1.25mmol/L組（0.9654±0.039）、2.5mmol/L組（0.9513±0.036）LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)變化不明顯（均P＞0.05），而5mmol/L組（0.7604±0.051）、10mmol/L組（0.7007±0.020）LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）。

圖2 透射電鏡下EPCs超微結(jié)構(gòu)（A：對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)較多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細(xì)胞器形態(tài)、分布均正常；B：對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)自噬雙層膜結(jié)構(gòu)；C：5mmol/L組給藥24h后可見(jiàn)核內(nèi)染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體發(fā)生腫脹、變圓，未見(jiàn)到明顯的自噬雙層膜結(jié)構(gòu)；D：10mmol/L組給藥24h后可見(jiàn)核固縮、斷裂，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體發(fā)生腫脹，嵴變少、變圓，未見(jiàn)到明顯的自噬囊泡和自噬溶酶體）

3 討論

自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的生命現(xiàn)象，是生物發(fā)育、老化過(guò)程中凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制。由于細(xì)胞自噬的發(fā)生與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸激酶（PI3K）關(guān)系密切，PI3K的抑制劑可以干擾或阻斷自噬體形成，而特異性自噬抑制劑3-MA通過(guò)這種方式發(fā)揮作用[6]。

本研究觀察3-MA對(duì)EPCs超微結(jié)構(gòu)和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響，受當(dāng)前檢測(cè)方法的限制，全面深入研究自噬仍是一大難題。MDC是一種特異性自噬標(biāo)記物，可被細(xì)胞吸收并選擇性地聚集于自噬囊泡中，在熒光顯微鏡下可觀察到染上MDC熒光的自噬囊泡呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，散布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周?chē)?；因此可根?jù)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒變化來(lái)推斷自噬的活化[7]。透射電鏡可形象觀察到獨(dú)立雙層膜、自噬體等自噬過(guò)程中各形態(tài)變化，是可靠的自噬檢測(cè)手段[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給藥24h后，對(duì)照組、1.25mmol/L組和2.5mmol/L組細(xì)胞質(zhì)中有點(diǎn)狀熒光顆粒散布于EPCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而5、10mmol/L組均無(wú)熒光顆粒出現(xiàn)；以上提示5、10mmol/L的3-MA給藥24h后自噬囊泡和熒光顆粒明顯減少，提示已抑制EPCs自噬的發(fā)生；1.25、2.5mmol/L組細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)明顯的熒光顆粒，說(shuō)明低濃度3-MA尚不能完全抑制EPCs自噬的發(fā)生。細(xì)胞培養(yǎng)12d后電鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體、溶酶體等細(xì)胞器，細(xì)胞核及核內(nèi)染色體的形態(tài)與分布均正常，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量明顯的獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡；而5、10mmol/L組給藥24h后，可以觀察到細(xì)胞質(zhì)發(fā)生固縮，染色質(zhì)濃縮、邊集，呈境界分明的半月?tīng)罨驂K狀附于核膜，可見(jiàn)到細(xì)胞核發(fā)生固縮、斷裂，這種超微結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于正常及死亡細(xì)胞，為典型的凋亡形態(tài)圖。對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡，而加藥組無(wú)明顯的獨(dú)立雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡和自噬溶酶體出現(xiàn)。此外，加藥組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體發(fā)生腫脹、變圓，個(gè)別細(xì)胞空泡化，基質(zhì)變淺，嵴變少，出現(xiàn)縱向嵴和同心圓嵴，可見(jiàn)到空泡狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在整個(gè)觀察中，未見(jiàn)細(xì)胞腫脹等壞死形態(tài)特征的出現(xiàn)。

自噬相關(guān)蛋白Atg8是含117個(gè)氨基酸的蛋白，早期的獨(dú)立膜、自噬體及自噬小體表面均有此蛋白。LC3是Atg8的哺乳動(dòng)物類(lèi)似物，能靶向定位于自噬體膜，并始終保留在膜上，與磷脂酰乙醇胺的泛素樣結(jié)合，自噬誘導(dǎo)發(fā)生后，在Atg3的催化下，磷脂酰乙醇胺結(jié)合至LC3-ⅠC端甘氨酸殘基，生成脂溶性LC3-Ⅱ，是自噬過(guò)程中膜動(dòng)力學(xué)很好的標(biāo)志物，也是目前可靠的自噬體標(biāo)志物[9-10]。LC3-Ⅱ含量多少與自噬囊泡多少成正比，LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬標(biāo)志分子。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ含量可以判斷自噬被誘導(dǎo)或抑制[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，1.25、5mmol/L組EPCs LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)變化不明顯，5、10mmol/L組給藥24h后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低，且有濃度依賴(lài)性。故推測(cè)濃度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

本研究初步探討了幾種不同濃度的自噬抑制劑3-MA對(duì)EPCs自噬的影響，為抑制自噬來(lái)提高EPCs活力和數(shù)量、促進(jìn)血栓機(jī)化再通提供依據(jù)。

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Effect of 3-methlyadenineon ultrastructure and LC3-II expression of rat endothelial progenitor cells

ZHU Renda. LI Xiaoqiang. Department of Vascular Surgery. the Second Affiliated Hospital of Soochow University. Suzhou 215004. China

Objective To investigate the effect of 3-methlyadenine(3-MA)on ultrastructure and LC3-II protein expression in rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells(EPCs)．MethodsMononuclear cells(MNCs)were isolated from rat bone marrow;the EPCs were induced from cultured MNCs and identified．The induced rat EPCs were treated with different concentrations of 3-MA(0,1．25,2．5,5,10mmol/L)．Monodansylcadaverine staining and transmission electron microscopy(TEM) were used to examine cell autophagy induced by 3-MA in rat EPCs．Western blot analysis was used to detect the LC3-II protein expression．ResultsAutophagy inhibition was observed in EPCs by 3-MA at concentration of 5mmol/L and 10mmol/L by both MDC staining and TEM．LC3-II protein expression in EPCs was decreased aftertreatment of 5mmol/L and 10mmol/L 3-MA as detected by western blot(P＜0．05)．ConclusionHigh dose of 3-MA caninduce the ultrastructural changes and reduce LC3-II expression in rat bone marrow-derived epithelial progenitor cells．

Endothelial progenitor cellMonodansylcadaverine 3-methlyadenine

2015-04-28）

（本文編輯：陳丹）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972941）

215004 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院血管外科（朱人大、李曉強(qiáng)，朱人大系全日制研究生，現(xiàn)在海寧市人民醫(yī)院血管外科工作）

李曉強(qiáng)，E-mail：flytsg@126.com