鄭榮宗 樓超 童勇駿 黃淑明 吳泉州

IL-1β、IL-6和TNF-α在肩袖損傷大鼠肩峰下滑囊中的表達(dá)及作用

鄭榮宗 樓超 童勇駿 黃淑明 吳泉州

目的 觀察肩袖損傷大鼠肩峰下滑囊（SAB）中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，并探討其在肩袖損傷后疼痛發(fā)生中的作用。方法 雌性SD大鼠在減少干擾SAB的情況下，切斷同側(cè)前肢岡上肌腱，建立大鼠肩袖損傷的模型作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)行假手術(shù)作為對(duì)照組。根據(jù)大鼠肩袖損傷時(shí)間不同，分別于造模后2、4、8周對(duì)大鼠SAB進(jìn)行取樣，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行切片，HE染色觀察SAB組織病理變化，采用免疫組化及實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SAB中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞數(shù)量和血管分布的增加。免疫組化及實(shí)時(shí)RT-PCR顯示實(shí)驗(yàn)組的IL-1β、IL-6和TNF-α在SAB中的表達(dá)水平在各時(shí)間段均明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論 肩袖損傷后大鼠SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高可能是肩袖損傷后肩關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的病理機(jī)制之一。

細(xì)胞因子 肩袖 肩峰下滑囊 大鼠模型

肩袖損傷是引起肩周疼痛、肩關(guān)節(jié)功能障礙最常見(jiàn)的疾病之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前對(duì)肩袖損傷引起肩關(guān)節(jié)疼痛的病因還沒(méi)有很好的認(rèn)識(shí)。肩峰下滑囊（subacromial bursa，SAB）被認(rèn)為與肩袖損傷引起的肩關(guān)節(jié)疼痛密切相關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，肩袖損傷引起肩關(guān)節(jié)疼痛的發(fā)生、發(fā)展與SAB內(nèi)炎癥因子IL-1α、IL-1β和TNF-α等的高表達(dá)有關(guān)[4-6]。但Lho等[7]在凍結(jié)肩患者的SAB中僅發(fā)現(xiàn)IL-1α和TNF-α高表達(dá)。Szomor等[8]研究了17例肩袖損傷患者的SAB標(biāo)本，均有表達(dá)IL-6，僅1例表達(dá)TNF-α mRNA，其余均無(wú)IL-1β mRNA的表達(dá)。而Ko等[9]對(duì)14例僵硬肩的肩袖損傷患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SAB中IL-1β高表達(dá)。Yoshida等[10]發(fā)現(xiàn)，有粘連的凍結(jié)肩或肩袖損傷患者中，SAB中IL-8基因的表達(dá)增加，均未檢測(cè)到IL-1α、IL-1β和TNF-α等的表達(dá)。可見(jiàn)，臨床中受多因素影響，對(duì)于SAB內(nèi)IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)與否，是否與肩關(guān)節(jié)疼痛的發(fā)生有關(guān)等問(wèn)題還存在爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步深入研究。本研究旨在建立大鼠肩袖損傷模型，進(jìn)而探討IL-1β、IL-6和TNF-α在肩袖損傷大鼠SAB中的表達(dá)及作用。

1 材料和方法

1.1 材料 骨骼成熟的清潔級(jí)SD大鼠12只，雌性，鼠齡3個(gè)月，平均體重270（250～300）g，術(shù)前觀察1周，確認(rèn)體健無(wú)疾病。大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)倫理審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠肩袖損傷模型制備：12只SD大鼠稱(chēng)重后，按40mg/kg體重量腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉[11]，將其以俯臥位固定于鼠類(lèi)固定器上。術(shù)區(qū)備皮、清潔，常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌單。肩袖損傷組（實(shí)驗(yàn)組）建立肩袖損傷模型，手術(shù)入路采用大鼠右側(cè)前肢肩胛岡肩峰端1cm皮膚切口，沿肩胛岡上緣向肩峰方向?qū)ふ也⑻羝饘霞‰?，在不影響SAB的情況下銳性切斷岡上肌肌腱，造成全層肩袖損傷模型。檢查無(wú)活動(dòng)性出血后采用5-0可吸收縫線（強(qiáng)生公司）關(guān)閉切口。假手術(shù)組（對(duì)照組）作左側(cè)前肢肩關(guān)節(jié)后外側(cè)1cm切口，暴露岡上肌腱后同樣方式縫合關(guān)閉切口。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，無(wú)活動(dòng)限制。

1.3 標(biāo)本采集及處理 分別于術(shù)后2、4、8周各取4只大鼠注射過(guò)量的戊巴比妥處死，兩側(cè)（肩袖損傷模型建立側(cè)及假手術(shù)側(cè)）SAB進(jìn)行觀察。原切口進(jìn)入，仔細(xì)分離軟組織，尋找SAB并予切除作為標(biāo)本。每1例標(biāo)本分為2部分，一部分置于深低溫冰箱中保存，用于后續(xù)細(xì)胞總RNA和蛋白的提取，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。另一部分立即置于10%多聚甲醛溶液中，固定48h，石蠟包埋。沿標(biāo)本縱軸切片，片厚度4μm。石蠟切片行HE染色和免疫組化。同時(shí)切取岡上肌腱斷端處部分肌腱作HE染色觀察造模情況。

1.4 HE染色 用HE染色觀察SAB組織病理變化。切片置二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染液染色5min，自來(lái)水沖洗，分化液分化30s，自來(lái)水浸泡15min，伊紅染液染2min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化 用免疫組化分別觀察IL-1β、IL-6和TNF-α在SAB中的表達(dá)。石蠟切片（厚4μm）逐級(jí)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS緩沖液洗，分別經(jīng)PBS、雙氧水室溫孵育10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用胰蛋白酶37℃孵育30min修復(fù)抗原，正常山羊血清室溫下封閉30min，滴加一抗兔抗人單克隆抗體（美國(guó)Thermo公司），4℃孵育過(guò)夜。第2天復(fù)溫后經(jīng)山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）37℃孵育30min，然后用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）37℃孵育30min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)

1.6.1 RNA提取 將標(biāo)本從液氮中取出，立刻稱(chēng)重。將組織置于預(yù)冷的研缽中，邊加液氮邊研磨，直至成為碎末狀。每100mg組織加入TRIZOL試劑（美國(guó)Sigma公司）200μl至樣品中，裂解后15～30℃孵育5min。將裂解產(chǎn)物移至RNase.free的1.5ml離心管中，每管1ml。加入預(yù)冷的氯仿，200μl/管，渦旋混勻，冰浴10min，4℃，12 000r/min離心15min，小心吸取上層水相至新管。加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，-80℃沉淀1h。4℃，12 000 000r/min離心30min，棄上清液。加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇1ml/管，4℃，12 000 000r/min離心10min，棄上清。吸凈殘液，開(kāi)蓋，晾干5min，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水20μl/管，溶解沉淀。使用NanoDrop@ND-1000紫外吸收法測(cè)定RNA濃度和純度。

1.6.2 cDNA合成 配制退火混合物：RNA3μg，0.5g/L Oligo（dT）（美國(guó)Thermo公司）1μl，加無(wú)RNA酶的H2O至總體積10μl。在70℃水?。―K-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）3min，降到37℃放置10min。

1.6.3 SYBR Green熒光定量RT-PCR 按照SYBR Green熒光定量RT-PCR試劑盒說(shuō)明，RT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2μl，ddH2O 8.5μl，SYBR Green PCR Mix 12.5μl，引物2μl,總體系為25μl。IL-1β、IL-6和TNF-α引物的正反義序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：95℃60s，95℃15s，60℃15s，72℃45s，共36個(gè)循環(huán)。同時(shí)作65～95℃溶解曲線（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。所有樣本均作3次檢測(cè)，取平均值進(jìn)行分析。RT-PCR數(shù)據(jù)的收集主要由7000 Sequence De-tection System自帶軟件完成，通過(guò)軟件計(jì)算所有樣品的Ct值，用相對(duì)定量的方法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算各組目的基因表達(dá)的差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，RT-PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的 mRNA表達(dá)量采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 12只SD大鼠在術(shù)后健康狀況良好，均于造模當(dāng)天開(kāi)始自主進(jìn)食，術(shù)后進(jìn)食情況良好。觀察期間無(wú)傷口感染及非預(yù)計(jì)性死亡發(fā)生。在建模操作過(guò)程中，手術(shù)入路的相關(guān)解剖位置比較恒定，模型建立的操作過(guò)程可重復(fù)性高。所有大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。

表1 RT-PCR使用引物序列

2.2 局部組織學(xué)肉眼觀察 術(shù)后2、4、8周，各實(shí)驗(yàn)組大鼠肩袖損傷處均有不同程度的瘢痕組織填補(bǔ)修復(fù)，周?chē)尺B均可見(jiàn)。可見(jiàn)岡上肌斷端肌腱瘢痕組織明顯增生，且隨時(shí)間增加瘢痕組織范圍逐漸增大。對(duì)照組無(wú)瘢痕組織填補(bǔ)修復(fù)，無(wú)周?chē)尺B。

2.3 HE染色光學(xué)顯微鏡觀察 肩袖損傷側(cè)在第4周和第8周時(shí)岡上肌腱中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞積聚，膠原排列相對(duì)紊亂。而對(duì)側(cè)假手術(shù)只見(jiàn)極少量的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，膠原呈波浪狀，單軸性（圖2，見(jiàn)插頁(yè)）。

在實(shí)驗(yàn)組所有肩袖損傷大鼠的SAB組織，均可見(jiàn)成纖維細(xì)胞數(shù)量和血管分布的增加。而對(duì)側(cè)假手術(shù)SAB中成纖維細(xì)胞數(shù)量和血管分布均很少（圖3，見(jiàn)插頁(yè)）。

2.4 免疫組化普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組肩袖損傷大鼠SAB組織細(xì)胞均能檢測(cè)到IL-1β、IL-6和TNF-α陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)分布高于對(duì)照組（圖4-6，見(jiàn)插頁(yè)）。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA在術(shù)后2、4、8周時(shí)的表達(dá)量明顯較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖7-9。

圖7 兩組SAB中IL-1βmRNA在術(shù)后2、4、8周的表達(dá)量

圖8 兩組SAB中IL-6 mRNA在術(shù)后2、4、8周的表達(dá)量

圖9 兩組SAB中TNF-α mRNA在術(shù)后2、4、8周的表達(dá)量

3 討論

SAB位于三角肌深面筋膜、肩峰及喙肩韌帶的下方，覆蓋在岡上肌腱、二頭肌間溝的淺層。為了造成大鼠肩袖全層撕裂損傷，若按Soslowsky等[12]的肩袖損傷模型切斷肩袖肌腱，必然要顯露和切開(kāi)SAB的頂部和底部，這樣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果就會(huì)造成影響，因?yàn)榍虚_(kāi)SAB會(huì)激活相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。為了減少對(duì)SAB的干擾，本研究在造模時(shí)沿大鼠前肢肩胛岡肩峰端切斷岡上肌，避免肱骨大結(jié)節(jié)、肩峰下進(jìn)入對(duì)SAB的干擾。根據(jù)組織學(xué)肉眼及HE染色光學(xué)顯微鏡觀察損傷肩袖造模術(shù)后不同時(shí)期各實(shí)驗(yàn)組大鼠肩袖損傷處均有不同程度的瘢痕組織填補(bǔ)修復(fù)，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞積聚。本研究認(rèn)為，通過(guò)這種方式建模，手術(shù)入路的相關(guān)解剖位置比較恒定，模型建立的操作過(guò)程可重復(fù)性高。

肩袖損傷患者疼痛的機(jī)制目前尚不清楚，關(guān)于肩袖損傷患者疼痛機(jī)制的研究主要集中在炎癥性疼痛和神經(jīng)源性疼痛兩個(gè)方面。炎癥是機(jī)體對(duì)體內(nèi)外致炎因素引起的損傷所發(fā)生的防御反應(yīng)，最近研究發(fā)現(xiàn)，肩關(guān)節(jié)疼痛的發(fā)生、發(fā)展與SAB的炎癥有密切的聯(lián)系[5-7，13]。IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子已被證實(shí)與疼痛有關(guān)，同時(shí)在肩袖損傷患者的肩袖和SAB中可以檢測(cè)到有炎癥因子存在[9，14-15]。Voloshin等[5]在一項(xiàng)對(duì)104例患者SAB進(jìn)行活檢的組織學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，肩峰撞擊綜合征和肩袖損傷患者的急慢性炎癥因子相比較而言在組織學(xué)上更常見(jiàn)，而且這種細(xì)胞因子水平的高低與損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)，翻修手術(shù)與全層肩袖撕裂患者中表達(dá)水平更高。本研究發(fā)現(xiàn)，在肩袖損傷造模的2周其SAB的IL-1β、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯高于4周和8周，這可能與肩袖在修復(fù)過(guò)程有關(guān)。因此可以認(rèn)為SAB中炎癥因子的表達(dá)水平升高可能是肩袖損傷疾病的一個(gè)重要病理生理過(guò)程。

IL-1β和TNF-α作為始動(dòng)因子，通過(guò)改變COX-2水平來(lái)調(diào)節(jié)疼痛[16]。IL-6作為炎癥介質(zhì)被認(rèn)為是TNF-α等某些生物效應(yīng)的放大因子。SAB中IL-1β的表達(dá)增加與肩袖損傷患者疼痛增加相關(guān)[4]。SAB組織同骨關(guān)節(jié)炎滑膜具有相似的滑膜細(xì)胞微環(huán)境（基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞），相似的細(xì)胞類(lèi)型和病理特征。因此，可以想象，這些炎癥因子也可能與肩袖損傷患者SAB發(fā)生病理改變相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SAB中可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量和血管分布的增加。免疫組化及實(shí)時(shí)RT-PCR顯示實(shí)驗(yàn)組的IL-1β、IL-6和TNF-α在SAB中的表達(dá)水平在各時(shí)間段均明顯升高，這與Voloshin等[5]在肩袖損傷患者的SAB研究發(fā)現(xiàn)基本相符。因此，本研究認(rèn)為肩袖損傷導(dǎo)致的SAB慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肩袖疾病患者肩痛及功能障礙的重要原因。

當(dāng)然本研究也存在一些不足，如研究的樣本量相對(duì)偏小，研究中所使用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)還不夠精確及完善，而且只納入IL-1β、IL-6和TNF-α 3個(gè)炎癥因子，還不能完全證實(shí)本研究的結(jié)論。此外，沒(méi)有檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶和生長(zhǎng)因子水平，而這兩個(gè)指標(biāo)被證實(shí)與肩袖損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖有上述不足，但本研究較早且相對(duì)完整地研究肩袖損傷后SAB中炎癥因子的變化，對(duì)臨床上解釋肩袖損傷后疼痛的發(fā)生、發(fā)展有重要的參考意義。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，肩袖損傷后SAB中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，提示該變化可能是肩袖損傷后引起肩關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的發(fā)病機(jī)制之一。后期需要更多的研究進(jìn)一步明確上述炎癥因子通過(guò)何種通路誘發(fā)肩關(guān)節(jié)疼痛。

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Expression of IL-1β，IL-6，TNF-α in subacromial bursa of rat rotator cuff tear model

ZHENG Rongzong,LOU Chao,TONG Yongjun,et al.Department of Orthopedics,Lishui Central Hospital,Lishui 323000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of interleukin-1β (IL-1β),interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor α(TNF-α)in subacromial bursa(SAB)of rat rotator cuff tear model. Methods The rotator cuff tear model was induced by SAB sparing supraspinatus tenotomy in the right shoulders of 12 adult female Sprague-Dawley rats(experimental group),and 12 left shoulders underwent sham surgery as control group.The subacromial bursas were obtained from 4 rats each time at postoperative 2,4,8 weeks.The histological changes were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining.The expression of IL-1β,IL-6 and TNF-α proteins and mRNA were measured by immunohistochemistry and real-time reverse transcriptasepolymerase chain reaction(RT-PCR),respectively. Results HE staining showed that there were increase of cell numbers and vascularization in experimental group compared with control group.The expressions of IL-1β,IL-6 and TNF-α proteins and mRNA were significantly higher in experimental group than those in control groups at all time points(P＜0.05). Conclusion These findings suggest that elevated levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the subacromial bursa might be correlated with the pain and limited range of motion in ratator cuff tear.

Cytokine Rotator cuffSubacromialbursa Mouse model

2016-02-21）

（本文編輯：陳麗）

浙江省自然科學(xué)基金（Y16H060027）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃（2012KYB249）

323000 麗水市中心醫(yī)院骨科（鄭榮宗、樓超、黃淑明、吳泉州）；浙江醫(yī)院骨科（童勇駿）

黃淑明，E-mail：smhuang001@163.com