蔡建勇 林群 巴華君 陸川 陳獻(xiàn)東 陳茂華 孫軍

●論 著

FTY720對(duì)顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用

蔡建勇 林群 巴華君 陸川 陳獻(xiàn)東 陳茂華 孫軍

目的 探討FTY720對(duì)顱腦損傷大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用。方法 30只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組和治療組，每組10只，采用改進(jìn)的Feeney自由落體損傷裝置建立大鼠顱腦損傷模型，假手術(shù)組大鼠切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作外力打擊。治療組大鼠按1mg/kg劑量予FTY720腹腔注射，其他組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml。24h后斷頭處死大鼠，分離海馬組織，采用TUNEL法檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞，Western-blotting檢測(cè)pro-caspase 3/9蛋白表達(dá)，四肽熒光底物法檢測(cè)caspase-3/9蛋白活性。結(jié)果 模型組大鼠海馬組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、pro-caspase 3/9蛋白表達(dá)和caspase-3/9蛋白活性較假手術(shù)組顯著升高，而治療組大鼠海馬組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例、pro-caspase 3/9蛋白表達(dá)和caspase-3/9蛋白活性較模型組顯著下降。結(jié)論 FTY720可顯著抑制顱腦損傷大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有腦保護(hù)作用。

FTY720 大鼠 神經(jīng)細(xì)胞凋亡 腦保護(hù)作用

免疫反應(yīng)是顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷機(jī)制的重要組成部分[1]。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，是將冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成的，在體內(nèi)代謝為具有生物活性的物質(zhì)而發(fā)揮作用。其免疫抑制具有雙向調(diào)節(jié)作用，在體內(nèi)抑制免疫反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)不破壞機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答及免疫記憶能力，不良反應(yīng)少，生物利用度高[2]。目前，F(xiàn)TY720用于治療多發(fā)性硬化癥已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，治療腎移植排斥反應(yīng)已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究階段[3]。筆者采用FTY720腹腔注射治療大鼠顱腦損傷，觀察其對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而評(píng)價(jià)其腦保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重250～300g，雄性，清潔級(jí)；FTY720（美國Biovision公司）臨用時(shí)根據(jù)1mg/kg用量以0.9%氯化鈉溶液配成1ml注射液；TUNEL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；caspase-3/9蛋白活性檢測(cè)試劑盒（美國Livemore公司）；小型垂直電泳槽（型號(hào)：164-8001，美國Biorad公司）；轉(zhuǎn)印槽（型號(hào)：Trans-Blot，美國Biorad公司）；脫色搖床（型號(hào)：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；電泳儀（型號(hào)：EPS-200，上海天能科技有限公司）；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：BECKMAN，北京普瑞麥迪實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）。

1.2 方法 將30只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組和治療組，每組10只。予50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，在右側(cè)冠狀縫后1mm、中線旁開2mm處切開頭皮，鉆一直徑5mm骨孔，采用改進(jìn)的Feeney自由落體損傷裝置，用40g重的擊錘從25cm處自由墜落沖擊撞桿，打擊深度5 mm，縫合頭皮。假手術(shù)組大鼠切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作外力打擊。假手術(shù)組和模型組大鼠手術(shù)操作完成前或模型形成前0.5h予0.9%氯化鈉注射液1ml腹腔注射，治療組大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg劑量予FTY720腹腔注射；24h后，大鼠以80 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細(xì)胞染色陽性，在Olympus-CH光學(xué)顯微鏡下計(jì)算10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均凋亡率（%）。

1.4 pro-caspase 3/9蛋白的檢測(cè) 采用Western-blotting檢測(cè)大鼠海馬組織pro-caspase 3/9蛋白的表達(dá)。取部分組織按1∶10（密度：體積）加入細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，13 000 g離心20min收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白（20～50μg）經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1h；加入相應(yīng)山羊抗大鼠一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標(biāo)記的兔抗大鼠二抗（1∶10 000）室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗膜3次；ECL試劑作用5min，X光膠片曝光。沖洗并掃描后結(jié)果用quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內(nèi)對(duì)照，比較相對(duì)灰度值。

1.5 caspase-3/9蛋白活性的檢測(cè) 采用四肽熒光底物法檢測(cè)caspase-3/9蛋白活性。取腦組織勻漿100μl與caspase-3底物AC-DEVD-AMC和caspase-9底物ACLEHD-AFC混合反應(yīng)，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以未加腦組織時(shí)的熒光強(qiáng)度為參照值，計(jì)算熒光強(qiáng)度，最終比較相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較應(yīng)用單變量方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為（7.1±1.7）%，模型組為（23.5±3.2）%，治療組為（16.7±2.3）%，假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率不高，模型組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高，而治療組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較模型組顯著下降（均P＜0.001），詳見圖1。

圖1 FTY720對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL法，×100）

2.2 FTY720對(duì)pro-caspase 3/9蛋白表達(dá)的影響 顱腦損傷后，大鼠海馬組織pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表達(dá)明顯增加，使用FTY720后，這些蛋白表達(dá)明顯回調(diào)（均P＜0.001），詳見圖2和表1。

2.3 FTY720對(duì)caspase 3/9蛋白活性的影響 顱腦損傷后，大鼠海馬組織caspase 3和caspase 9蛋白活性明顯增加，使用FTY720后，這些蛋白活性明顯下降（均P＜0.001），詳見表2。

3 討論

顱腦損傷發(fā)生率高，預(yù)后不佳。顱腦損傷后腦組織局部免疫應(yīng)答增強(qiáng)加重腦組織的繼發(fā)性腦損傷[1]，為臨床應(yīng)用免疫抑制療法治療顱腦損傷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但另一方面，臨床上顱腦損傷患者有50%～70%合并繼發(fā)性感染，而應(yīng)用常規(guī)免疫抑制劑可致全身免疫功能低下，加重繼發(fā)性感染[4]。因此尋找一種安全有效的免疫抑制劑對(duì)于減少顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷具有重要意義。

圖2 FTY720對(duì)pro-caspase 3/9蛋白表達(dá)的影響

表1 FTY720對(duì)pro-caspase 3/9蛋白表達(dá)的影響

FTY720是一種新合成的免疫抑制劑，為鞘氨醇-1-磷酸鹽（S1P）受體阻滯劑[5]。在細(xì)胞內(nèi)FTY720被鞘氨醇激酶2磷酸化為具有生物活性的（S）-FTY720-P異構(gòu)體而發(fā)揮作用。（S）-FTY720-P與5種1-磷酸鞘氨醇受體中的S1P1、S1P4、S1P5有高的親合力，與S1P3有低的親合力，不與SlP2結(jié)合。根據(jù)1-磷酸鞘氨醇受體亞型和靶細(xì)胞/組織的不同，F(xiàn)TY720功能表現(xiàn)為拮抗或激動(dòng)[6]。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反應(yīng)，還可以用于治療皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病及某些轉(zhuǎn)移性癌癥[7]。

pro-caspase 3和pro-caspase 9是凋亡蛋白caspase 3和caspase 9的無活性前體形式，當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激后，會(huì)酶解成caspase 3和caspase 9活性二聚體形式。其中蛋白caspase 3為凋亡執(zhí)行者，可直接降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡；而caspase 9是凋亡啟動(dòng)者，受到凋亡信號(hào)刺激后，caspase 9自剪接激活，引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8-10]。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中FTY720用于腦損傷治療的劑量均選用1mg/kg，且一般在腦損傷動(dòng)物模型形成前短時(shí)間內(nèi)腹腔或靜脈注射使用[11-13]。既往動(dòng)物研究證實(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡一般在腦損傷后24～72h達(dá)到高峰[8-10]，且有關(guān)FTY720用于腦損傷治療的研究也一般選擇在腦損傷后24h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)和腦組織取樣[11-13]?；谝陨弦蛩兀狙芯吭谀X外傷模型形成前短時(shí)間（0.5h）內(nèi)采用1mg/kg FTY720腹腔注射治療腦損傷大鼠，且神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)的時(shí)間選擇在外傷后24h。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顱腦損傷后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、procaspase 3和pro-caspase 9蛋白表達(dá)和caspase 3和caspase 9蛋白活性后發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表達(dá)增加，caspase 3和caspase 9蛋白活性增強(qiáng)，且凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例增高，表明顱腦損傷后腦內(nèi)發(fā)生凋亡；給予FTY720處理后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡、pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表達(dá)和caspase 3和caspase 9蛋白活性表現(xiàn)出不同程度的回調(diào)，顯示FTY720可降低顱腦損傷后凋亡的發(fā)生。最近有研究顯示，F(xiàn)TY720可抑制體外培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性因子釋放[14]，阻止腦外傷大鼠外傷皮層炎性細(xì)胞的聚集，從而降低腦炎癥反應(yīng)[15]。FTY720可以抑制動(dòng)物腦出血后腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤[11]，也能有效抑制短暫性腦缺血導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡[12]和降低腦出血大鼠腦水腫，改善腦功能[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720用于治療腦缺血后大鼠的同時(shí)并沒有提高機(jī)體的細(xì)菌感染率[16]。目前，少有研究揭示FTY720對(duì)顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及caspase 3/9通路的影響，本研究揭示了FTY720對(duì)顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用。既往研究提示FTY720可顯著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[14－15]。因此，筆者推測(cè)FTY720可能通過抑制腦炎癥反應(yīng)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善顱腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙，而且安全可靠。然而，藥效往往與用藥時(shí)間和用藥劑量密切相關(guān)，本研究沒有進(jìn)一步分析不同劑量FTY720和不同時(shí)間點(diǎn)用藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用，這方面的數(shù)據(jù)需要今后深入研究。

[1] de Rivero VaccariJ C,Brand FJ 3rd,BertiAF,et al.Mincle signaling in the innate immune response after traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2015,32(4):228-236.

[2] Pitman M R,Woodcock J M,Lopez A F,et al.Molecular targets of FTY720(fingolimod)[J].Curr MolMed,2012,12(10):1207-1219.

[3] Patmanathan S N,Yap L F,Murray P G,et al.The antineoplastic properties of FTY720:evidence for the repurposing of fingolimod [J].J CellMolMed,2015,19(10):2329-2340.

[4] Brune K,PatrignaniP.New insights into the use of currently available non-steroidalanti-inflammatory drugs[J].J Pain Res,2015,8 (1):105-118.

[5] Zhang L,Wang H D,Ji XJ,et al.FTY720 for cancer therapy(Review)[J].OncolRep,2013,30(6):2571-2578.

[6] Estella-Hermoso de Mendoza A,Castello-Cros R,Imbuluzqueta E,et al.Lipid Nanosystems Enhance the Bioavailability and the Therapeutic Efficacy of FTY720 in Acute Myeloid Leukemia[J].J Biomed Nanotechnol,2015,11(4):691-701.

[7] Yoshida Y,Tsuji T,Watanabe S,et al.Efficacy of combinationtreatment with fingolimod(FTY720)plus pathogenic autoantigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide(GPI325-339)-induced arthritis mouse model[J].Biol Pharm Bull,2013,36(11): 1739-1746.

[8] Creagh E M.Caspase crosstalk:integration of apoptotic and innate immune signalling pathways[J].Trends Immunol,2014,35 (12):631-640.

[9] Park H H.Structural features of caspase-activating complexes [J].Int J MolSci,2012,13(4):4807-4818.

[10] Kuranaga E.Beyond apoptosis:caspase regulatory mechanisms and functions in vivo[J].Genes Cells,2012,17(2):83-97.

[11] Rolland W B,Lekic T,Krafft P R,et al.Fingolimod reduces cerebral lymphocyte infiltration in experimental models of rodent intracerebralhemorrhage[J].Exp Neurol,2013,241(1):45-55.

[12] Hasegawa Y,Suzuki H,Sozen T,et al.Activation of sphingosine 1-phosphate receptor-1 by FTY720 is neuroprotective after ischemic stroke in rats[J].Stroke,2010,41(2):368-374.

[13] Rolland W B 2nd,Manaenko A,Lekic T,et al.FTY720 is neuroprotective and improves functional outcomes after intracerebral hemorrhage in mice[J].Acta Neurochir Suppl,2011,111(2): 213-217.

[14] Janssen S,Schlegel C,Gudi V,et al.Effect of FTY720-phosphate on the expression of inflammation-associated molecules in astrocytes in vitro[J].MolMed Rep,2015,12(4):6171-6177.

[15] Zhang Z,Zhang Z,Fauser U,et al.FTY720 attenuates accumulation of EMAP-II+and MHC-II+monocytes in early lesions of rat traumatic brain injury[J].J CellMolMed,2007,11(2):307-314.

[16] Pfeilschifter W,Czech-Zechmeister B,Sujak M,et al.Treatment with the immunomodulator FTY720 does not promote spontaneous bacterial infections after experimental stroke in mice[J]. Exp TranslStroke Med,2011,3:2.

Inhibitory effect of FTY720 on cell apoptosis of neurons in rats with experimental traumatic brain injury

CAI Jianyong,LIN Qun, BA Huajun,et al.Department of Neurosurgery,Wenzhou Central Hospital,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of FTY720 on cell apoptosis in hippocampus of rats with experimental traumatic brain injury. Methods Thirty rats were randomly divided into sham-operation group,model group and treatment group with 10 in each.Modified Feeney free fall injury device was used to induce craniocerebral injury in rats of model and treatment groups.Rats in sham-operation group underwent scalp incision,cranial drilling and scalp suture,but no traumatic impact.Rats in treatment group were administrated intraperitoneally with 1 mg/kg FTY720.Rats in other two groups were given an intraperitoneal injection of 1 mL normal saline.After 24 hours,rats were sacrificed by decapitation and their hippocampus tissues were dissected.TUNEL staining,Western-blotting and four peptide fluorescence substrate method were used to determine the apoptotic neuronal cells,expressions of pro-caspase 3/9 proteins and activities of caspase 3/9 proteins,respectively. Results Compared with sham-operation group,the percentage of apoptotic neuronal cells,expressions of pro-caspase 3/9 proteins and activities of caspase 3/9 proteins were significantly elevated in the hippocampus of model group;while these indicators in treatment group were significantly lower than those of model group. Conclusion FTY720 can markedly suppress cell apoptosis of hippocampus neurons in rats after trauma brain injury and shows cerebral protective effect.

FTY720 RatNeuronalcellapoptosis Cerebralprotective effect

2015-11-21）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C37029）

325000 溫州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科

蔡建勇，E-mail：cjy19761976@126.com