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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病生教研室，心血管病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

胞紅蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

屈順林1,朱宇凝1，潘文軍1，李維1，王宇菲1，謝黎明2，姜志勝1，范文靜3

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病生教研室，心血管病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科)

目的探討CYGB在巨噬細(xì)胞氧化損傷過程中的表達(dá)及作用。方法構(gòu)建CYGB高表達(dá)/低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型，Western blot檢測(cè)不同濃度H2O2刺激RAW264.7 12 h后CYGB的蛋白表達(dá)水平；用分光光度計(jì)觀察RAW264.7在氧化損傷過程中乳酸脫氫酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量的變化情況。結(jié)果0.5 mmol/L H2O2處理巨噬細(xì)胞12 h后CYGB表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；與0.5 mmol/L H2O2處理組相比，0.5 mmol/L H2O2對(duì)CYGB高表達(dá)組的CYGB表達(dá)升高(P<0.05)，而0.5 mmol/L H2O2對(duì)CYGB低表達(dá)組的CYGB表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.5 mmol/L H2O2+CYGB高表達(dá)組中LDH活性和MDA含量下降；0.5 mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組中LDH活性和MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論巨噬細(xì)胞氧化損傷時(shí)CYGB表達(dá)水平增加；CYGB在巨噬細(xì)胞氧化損傷過程中具有拮抗作用。

巨噬細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 胞紅蛋白； 過氧化氫

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)分子，細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化防御機(jī)制的平衡被打破，ROS及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1]。而巨噬細(xì)胞可以吞噬、殺傷和清除細(xì)菌、病毒及損傷、衰老的組織細(xì)胞有助于病變部位的康復(fù)[2]。 珠蛋白廣泛存在于動(dòng)植物中，具有獨(dú)特的蛋白結(jié)構(gòu)—血紅素輔基，其可以通過鐵卟啉環(huán)和組氨酸多肽鏈與氧分子可逆性結(jié)合[3]，在呼吸系統(tǒng)中尤為重要。在脊椎動(dòng)物中，已知的珠蛋白主要有肌紅蛋白(MGB)、血紅蛋白(HGB)、腦紅蛋白(NGB)和胞紅蛋白(CYGB)[4]。而CYGB具有攜氧與貯氧、氧感受器等生理功能[5]，同時(shí)它還具有清除自由基的作用[6-7]。然而CYGB在巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)的作用尚不清楚。

1 材料與方法

1.1材料與試劑小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室；硝酸纖維素膜(PVDF)為Millipore公司產(chǎn)品。 BCA Protein Assay Kit為Pierce公司產(chǎn)品，；ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于康為公司。CYGB抗鼠一抗購(gòu)于 Proteintech 公司；β-actin一抗購(gòu)于長(zhǎng)沙艾佳生物技術(shù)有限公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成公司； DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞用含10%的小牛血清并含10 mmol/l的HEPES的DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)70%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)棄去培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，加入5 mL含血清培養(yǎng)液終止消化，每24～72 h傳代一次。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 探討CYGB表達(dá)水平改變對(duì)RAW264.7 氧化損傷的作用，將RAW264.7細(xì)胞分為四組：①對(duì)照組；② 0.5 mmol/L H2O2處理RAW264.7 12 h組；③ 0.5 mmol/L H2O2+CYGB高表達(dá)組：先轉(zhuǎn)染CYGB表達(dá)質(zhì)粒，24 h后用0.5 mmol/L H2O2處理RAW264.7 12 h；④ 0.5 mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組：先轉(zhuǎn)染CYGB干擾質(zhì)粒，24 h后用0.5 mmol/L H2O2處理RAW264.7 12 h。

1.3蛋白印跡(Western blot) 用裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白。利用蛋白定量試劑盒定量后，100 ℃煮3～5 min使蛋白變性，分裝并于-80 ℃保存。配制并灌注10%SDS-PAGE分離膠和5%的濃縮膠，加入蛋白樣品，恒壓80 V電泳30 min，待溴酚藍(lán)染料帶進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)至120 V電泳1 h，轉(zhuǎn)膜到PVBDF膜上，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h；5%無抗脫脂奶粉封閉4 h，加一抗于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，然后將辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗與膜共同孵育1 h，TBST洗膜3次，室溫?fù)u蕩洗膜，每次10 min，顯影，定影。

1.4 CYGB表達(dá)和低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型的構(gòu)建

1.4.1 參考分子克隆CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入本課題組已有的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取，然后用于轉(zhuǎn)染[8]。

1.4.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，使用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。

1.5 LDH活性及MDA含量檢測(cè)將準(zhǔn)備好的細(xì)胞樣本采用南京建成生物工程研究所相應(yīng)試劑盒，操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書執(zhí)行，分光光度計(jì)檢測(cè)MDA及LDH含量。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞CYGB表達(dá)的影響

熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.5 mmol/L H2O2處理巨噬細(xì)胞12 h后CYGB表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2處理組相比，0.5 mmol/L H2O2+CYGB高表達(dá)組的CYGB表達(dá)顯著增加，0.5 mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組的CYGB表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 CYGB對(duì)RAW264.7細(xì)胞LDH活性影響H2O2刺激能明顯上調(diào)LDH的活性，轉(zhuǎn)染CYGB表達(dá)質(zhì)粒能下調(diào)LDH活性，而轉(zhuǎn)染CYGB干擾質(zhì)粒卻上調(diào)LDH活性。

組別H2O2(μmol/L)LDH(U/mg·prot)control組022．52±1．158H2O2處理組50052．70±1．716aH2O2+CYGB高表達(dá)組50044．91±0．925bH2O2+CYGB低表達(dá)組50060．25±0．543b

與對(duì)照組比較,a:P<0.05;與H2O2處理組比較,b:P<0.05

2.3 CYGB對(duì)RAW264.7細(xì)胞MDA含量影響H2O2刺激能明顯上調(diào)MDA的含量，轉(zhuǎn)染CYGB表達(dá)質(zhì)粒能下調(diào)MDA含量，而轉(zhuǎn)染CYGB干擾質(zhì)粒卻進(jìn)一步上調(diào)MDA含量。

圖1 H2O2處理巨噬細(xì)胞對(duì)CYGB表達(dá)的影響 A:熒光定量PCR結(jié)果；B:Western blot檢測(cè)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較,*:P<0.05；與H2O2處理組比較,#:P<0.05

圖2 CYGB對(duì)H2O2刺激巨噬細(xì)胞時(shí)LDH的影響 A：control組； B：H2O2組； C：H2O2+CYGB高表達(dá)組； D：H2O2+CYGB低表達(dá)組.與對(duì)照組比較,*P<0.05；與H2O2處理組比較,#P<0.05

表2CYGB對(duì)H2O2刺激巨噬細(xì)胞時(shí)MDA含量的影響(x±s，n=3)

組別H2O2(μmol/L)MDA(U/mg·prot)control組01．591±0．084H2O2處理組5002．142±0．062aH2O2+CYGB高表達(dá)組5001．944±0．041bH2O2+CYGB低表達(dá)組5002．358±0．069b

與對(duì)照組比較,a:P<0.05；與H2O2處理組比較,b:P<0.05

3 討 論

巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞在體內(nèi)扮演著清道夫角色，可聚集到病變部位。激活后的巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生和釋放大量ROS，ROS過多介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞功能下降，甚至細(xì)胞器損傷、溶解[9]。組織缺氧(如心肌梗死)也可造成細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的活性氧，釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致組織細(xì)胞的進(jìn)一步損傷[10]。氧化應(yīng)激可引起多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)釋放促進(jìn)細(xì)胞的活化，巨噬細(xì)胞活化后又可出現(xiàn)呼吸“爆發(fā)現(xiàn)象”[11]，產(chǎn)生大量的ROS，在氧自由基殺傷異物的同時(shí)大量的ROS也會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)功能的下降，細(xì)胞器的溶解，細(xì)胞壞死等[12]。另外H2O2可使生物膜中的多不飽和脂肪酸氧化損傷，改變膜流動(dòng)性、通透性和破壞膜的完整性，進(jìn)而造成氧化應(yīng)激損傷，在感染、缺血/再灌注損傷、休克等多種炎性疾病引起的病理性改變過程中氧化應(yīng)激扮演著重要角色[13]。

圖3 CYGB對(duì)H2O2刺激巨噬細(xì)胞時(shí)MDA含量的影響 A：control組； B：H2O2組； C:H2O2+CYGB高表達(dá)組； D:H2O2+CYGB低表達(dá)組.*:P<0.05，與對(duì)照組比較；#:P<0.05，與H2O2處理組比較

當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激的時(shí)候，NF-κB二聚體釋放出來，然后經(jīng)過翻譯后的修飾作用后進(jìn)一步被激活，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中與目的基因結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[14]。CYGB在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在氧化損傷過程中，NF-κB與CYGB都被激活且表達(dá)增高[15]。CYGB啟動(dòng)子區(qū)的CpG小島區(qū)域具有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，這意味著CYGB表達(dá)可能受到NF-κB的調(diào)控[16]。通過熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CYGB與NF-κB具有內(nèi)在的相關(guān)性，在巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中CYGB上調(diào)，NF-κB下降；而低表達(dá)CYGB后可使NF-κB上調(diào)?？紤]可能是CYGB具有抗氧化、清除ROS的功能，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中減少了ROS對(duì)細(xì)胞的損傷，降低了ROS對(duì)細(xì)胞的刺激，從而反射性的降低了NF-κB的表達(dá)[17]。本課題研究應(yīng)用H2O2構(gòu)建氧化損傷模型，以探討CYGB在H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用[18]。 CYGB具有儲(chǔ)存、運(yùn)輸O2，結(jié)合和清除NO等功能。在細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中能夠表達(dá)上調(diào)，清除過多的ROS[19]。CYGB作為新發(fā)現(xiàn)的攜氧珠蛋白，在細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中表達(dá)上調(diào)，具有清除ROS的作用[9]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CYGB在氧化應(yīng)激過程中表達(dá)升高且對(duì)巨噬細(xì)胞的氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用[20]。

CYGB作為珠蛋白家族成員，從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有十余年。CYGB含有血紅素蛋白能夠結(jié)合O2，NO和CO[21]。CYGB參與了細(xì)胞多種生理過程的調(diào)控，包括細(xì)胞增殖與分化和氧化還原平衡等[22]。CYGB的功能研究有望對(duì)慢性炎癥性疾病的防治提供一個(gè)新的方向。

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ProtectiveeffectofCYGBonMacrophageduringOxidativeDamage

QU Shunlin,ZHU Yuning,PAN Wenjun,et al
(DepartmentofPathophysiology,CollegeofMedicine,UniversityofSouthChinaHengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe change of cytoglobin(CYGB) expression and explore the protective role of CYGB during oxidative stress in macrophages.MethodsWestern blot was used to detect CYGB expression after 0.5 mmol/L H2O2treatment for 12 h.Cell model of CYGB overexpression and downexpression was constructed,then to observe the role of CYGB during oxidative stress.After treatment with H2O2for 12 h,CYGB protein levels,lactate dehydrogenase(LDH) and malondialdehyde(MDA) were detected in each group.ResultThe expression of CYGB in H2O2-treated group was increased compared with control group,the difference was significant (P<0.05).The expression of CYGB was higher in 0.5 mmol/L H2O2treatment+CYGB expression group and lower in 0.5 mmol/L H2O2treatment+CYGB interference group compared with the 0.5 mmol/L H2O2treated group (P<0.05).Results showed that LDH,MDA level was decreased in H2O2treatment+CYGB expression group and increased in H2O2treatment+CYGB interference group.ConclusionExpression of CYGB in macrophage was increased during oxidative stress.The CYGB protected against oxidative injury in macrophage.

macrophages; oxidative stress; cytoglobin; H2O2

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.002

2015-12-25；

2016-07-26

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(編號(hào):81670424)、國(guó)家安全生產(chǎn)重大事故防治關(guān)鍵技術(shù)科技項(xiàng)目(hunan-0013-2016AQ)、湖南省科技廳項(xiàng)目(編號(hào)：2015SK20203，2011TT2051)、湖南自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2015JJ2118)、湖南省教育廳重點(diǎn)課題(編號(hào)：2015JJ2118)、湖南省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(編號(hào)：B2016087)、湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2016B480)和中國(guó)博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(編號(hào)：20114324120004)。.

*通訊作者，qushunlin78@126.com.

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秦旭平)