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(解放軍第一六九醫(yī)院 湖南師范大學(xué)附屬湘南醫(yī)院感染控制科，湖南 衡陽 421002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

miR-185與PKM2在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

石宇雄，郭智維，繆莉，譚志琴

(解放軍第一六九醫(yī)院 湖南師范大學(xué)附屬湘南醫(yī)院感染控制科，湖南 衡陽 421002)

目的研究miR-185與PKM2在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測胃癌組織與癌旁正常胃粘膜組織中miR-185與PKM2的表達(dá)情況，分析miR-185與PKM2之間的相關(guān)性以及與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果原位雜交檢測顯示，在126例胃癌組織中miR-185陽性表達(dá)率為38.10%，與正常對(duì)照組56.38%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.36,P=0.000)。免疫組化結(jié)果顯示，在126例胃癌組織中PKM2陽性表達(dá)率為63.49%，與正常對(duì)照組43.59%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.74，P=0.006)。相關(guān)性分析顯示，在胃癌組織中miR-185的表達(dá)與PKM2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.09，P=0.006)；Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者miR-185的高表達(dá)率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者(P=0.001)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-185的高表達(dá)率也明顯低于無淋巴轉(zhuǎn)移者(P=0.003)；而PKM2在Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的高表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者(P=0.002)，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PKM2的高表達(dá)率也明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移者(P=0.006)，但是miR-185與PKM2在胃癌患者中的表達(dá)與患者的年齡、性別、組織分化程度以及T分期無明顯相關(guān)性。結(jié)論miR-185在胃癌組織中低表達(dá)，PKM2在胃癌組織中高表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)志。

胃癌； miR-185； PKM2； 臨床意義

miRNAs是一類在真核生物中廣泛表達(dá)的非編碼小RNA分子，與靶mRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律結(jié)合，使mRNA降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控生物體一系列生理病理過程[1]。研究表明，miRNAs調(diào)控重要的細(xì)胞過程，包括增殖、凋亡、分化以及新陳代謝等，并且參與人類多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤[2]。研究顯示miR-185在多種不同類型腫瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[3-4]。PKM2是糖酵解過程中的關(guān)鍵限速酶，其功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)產(chǎn)生丙酮酸。研究顯示，PKM2在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如胃癌、乳腺癌以及肝癌等，并且能促進(jìn)有氧糖酵解與腫瘤的發(fā)生[5-7]。本研究前期通過在線預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)PKM2是miR-185的預(yù)測靶基因，目前對(duì)于miR-185與PKM2在胃癌的表達(dá)及作用尚未完全闡明，本文旨在探討兩者在胃癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1組織樣本126例胃癌組織芯片包括78例正常組織標(biāo)本，病例年齡31～78歲，平均年齡54±13歲。病理學(xué)分類按照WHO胃癌組織學(xué)分類和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]。病理診斷結(jié)果經(jīng)兩名以上病理學(xué)專家確診。

1.2主要試劑原位雜交檢測試劑盒與ElivisionTMPlus二步法免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，DAB顯色劑購自福州新邁公司，地高辛標(biāo)記的miR-185探針序列購自美國Exiqon公司，has-miR-185:5′-agtgtgagttctaccattgccaaa-3′PKM2單克隆抗體購自CST公司，PKM2克隆號(hào)(AT4M3)。

1.3方法

1.3.1 原位雜交檢測胃癌組織與正常胃組織中miR-185表達(dá) 組織芯片脫蠟至水；3%胃蛋白酶消化15～20 min，水洗后4%甲醛固定；按miRNA探針說明，探針用無酶水稀釋，稀釋終比例為1∶600，先用預(yù)雜交液于55 ℃預(yù)雜交2 h后再用地高辛標(biāo)記的miR-185探針于55 ℃進(jìn)行雜交過夜；次日用不同濃度SSC緩沖液依次洗滌；室溫封閉30 min；生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h；鏡下進(jìn)行DAB顯色并控制顯色時(shí)間；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。

1.3.2 免疫組化檢測胃癌組織與正常胃組織中PKM2表達(dá) 采用ElivisionTMPlus二步法。組織芯片脫蠟至水；按需要對(duì)切片進(jìn)行高壓修，冷卻后PBS液洗滌；加一抗，室溫下孵育4 ℃過夜，PBS洗滌；加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS洗滌；加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS洗滌；鏡下進(jìn)行DAB顯色并控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。

1.3.3 免疫組化和原位雜交結(jié)果分析 miR-185與PKM2呈棕黃色顆粒的陽性信號(hào)定位于胃粘膜上皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核中。結(jié)合陽性信號(hào)的染色強(qiáng)度和分布范圍進(jìn)行半定量，按下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[8]：在高倍光鏡下觀察5個(gè)具有代表性的視野對(duì)陽性染色細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：①+/-，陽性染色細(xì)胞數(shù)低于10%；②+-++，陽性染色細(xì)胞數(shù)在10%～50%之間；③+++，陽性染色細(xì)胞數(shù)高于50%。顯微攝像后運(yùn)用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)光密度值進(jìn)行檢測，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-185與PKM2在胃癌組織中的表達(dá)情況

原位雜交結(jié)果顯示(圖1)，miR-185在126例胃癌組織中陽性表達(dá)48例，陽性率為38.10%，在78例正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)51例，陽性率為65.38%，兩者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.36，P=0.000)；免疫組化結(jié)果顯示(圖1)，PKM2在126例胃癌組織中陽性表達(dá)80例，陽性率為63.49%，在78例正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)34例，陽性率為43.59%，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.74，P=0.006)。

2.2 miR-185與PKM2在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析顯示(表1)，miR-185與PKM2表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、組織分化程度以及T分期無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但是miR-185在Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者中的表達(dá)高于Ⅲ-Ⅳ胃癌患者(P=0.001)，即miR-185在胃癌患者中的表達(dá)隨著臨床分期的增高而降低度。PKM2在Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者中的表達(dá)低于Ⅲ～Ⅳ胃癌患者(P=0.002)，即PKM2在胃癌患者中的表達(dá)隨著臨床分期的增高而增高。miR-185在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中表達(dá)也明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P=0.003)，而PKM2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中的表達(dá)卻明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P=0.006)。結(jié)果均表明miR-185與PKM2在胃癌中的表達(dá)改變與患者腫瘤惡性程度相關(guān)。

圖1 原位雜交檢測miR-185和PKM2在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)(400×) A:miR-185癌旁正常組織中的表達(dá)；B：miR-185在胃癌組織中的表達(dá)；C：PKM2在癌旁正常組織中的表達(dá)；D：PKM2在胃癌組織中的表達(dá)

表1miR-185與PKM2表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

臨床病理參數(shù)例數(shù)miR-185表達(dá)低高PPKM2表達(dá)低高P年齡(歲) <607344290.424490.32 ≥605334192231性別 男7046270.45326440.87 女5632212036組織分化程度 高中分化322480.05810220.48 低分化與其他類型9454403658T分期 T1～T27140310.121500.07 T3～T45538172530臨床分期 Ⅰ～Ⅱ5123280.00127240.002 Ⅲ～Ⅳ7555201956淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有8862260.00339490.006 無381622731

2.3 miR-185與PKM2在胃癌組織中的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中miR-185與PKM2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.09，P=0.006)。

3 討 論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第二大原因，調(diào)查顯示，將近一半的胃癌發(fā)生在中國人群，總體5年生存率大約為20%[9]，其中大部分患者在確診時(shí)已為晚期階段，因而失去了根治手術(shù)的機(jī)會(huì)。由于缺乏早期有效的診斷指標(biāo)以及治療策略的局限性，導(dǎo)致了疾病的不良預(yù)后。因此，預(yù)測腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的高效、新型生物標(biāo)志物的鑒定對(duì)改善患者的結(jié)局具有重要意義。

大量的研究證實(shí)miRNAs在腫瘤中異常表達(dá)并類似癌基因或抑癌基因樣作用[10-11]。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤中的表達(dá)還與腫瘤的臨床復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及患者生存密切相關(guān)。由于miRNAs在腫瘤患者的組織與血清中特異性表達(dá)模式和調(diào)控潛能，其可作為惡性腫瘤診斷與預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。miR-185位于22q11.21染色體。研究發(fā)現(xiàn)miR-185在多種惡性腫瘤中低表達(dá)并且通過靶向調(diào)控不同的基因發(fā)揮抑癌基因樣作用，包括有結(jié)腸癌、肝癌、上皮性卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌[12-16]。miR-185在結(jié)腸癌中下調(diào)RhoA與Cdc42表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[12]。miR-185在乳腺癌中下調(diào)cMet表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。miR-185在前列腺癌中靶向雄激素受體抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[16]。Akakaya等[17]研究顯示，miR-185在結(jié)腸癌中的表達(dá)與患者的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。miR-185在三陰乳腺癌中低表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、總生存期以及無病生存期相關(guān)[18]。miR-185在肝癌中低表達(dá)與患者的高復(fù)發(fā)和低生存率相關(guān)[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)，miR-185在胃癌組織中低表達(dá)，并且miR-185低表達(dá)與胃癌患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。miR-185的表達(dá)隨著臨床分期演進(jìn)而下調(diào)。

PKM2最初在胚胎組織中表達(dá)，而近年來發(fā)現(xiàn)PKM2在快速增殖的細(xì)胞中也高表達(dá)，特別是腫瘤組織，對(duì)Warburg效應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。大量的研究發(fā)現(xiàn)PKM2在多種惡性腫瘤中高表達(dá)并且與患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。如PKM2在肝癌中高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)[20]。PKM2在乳腺癌中高表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且PKM2表達(dá)越高，患者的總生存期和無病生存期越短[21]。PKM2在口腔鱗癌中高表達(dá)與腫瘤的大小、頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及生存相關(guān)，PKM2表達(dá)越高的患者其總生存期和無病生存期越短，并且可作為患者生存的獨(dú)立預(yù)后因子[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在胃癌組織中高表達(dá)，并且PKM2高表達(dá)與胃癌患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。PKM2的表達(dá)隨著臨床分期演進(jìn)而增加。相關(guān)性分析顯示miR-185與PKM2在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由此推測，在胃癌組織中miR-185低表達(dá)與PKM2高表達(dá)可能是胃癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)志。本課題組下期擬在此次的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將樣本擴(kuò)大胃癌患者的血清中檢測，以確定兩者在胃癌患者的血清中是否具有同樣的表達(dá)模式，為臨床開發(fā)新的胃癌檢測標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Esquela-Kerscher A.The lin-4 microRNA:The ultimate micromanager[J].Cell Cycle,2014,13(7):1060-1061.

[2] Garzon R,Calin GA,Croce CM.MicroRNAs in cancer[J].Annu Rev Med,2009,60:167-179.

[3] Tang H,Wang Z,Liu X,et al.LRRC4 inhibits glioma cells growth and invasion by miR-185 mediating pathway[J].Current Cancer Drug Targets,2012,12(8):1032-1042.

[4] Zhang Z,Tang H,Wang Z,et al.MiR-185 Targets the DNA Methyltransferases 1 and Regulates Global DNA Methylation in Human Glioma[J].Mol Cancer,2011,10(1):124.

[5] Christofk HR,Vander Heiden MG,Harris MH,et al.The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumourgrowth[J].Nature,2008,452(7184):230-233.

[6] Sun Q,Chen X,Ma J,et al.Mammalian target of rapamycin up-regulation of pyruvate kinase isoenzyme type M2 is critical for aerobic glycolysis and tumor growth[J].ProcNatlAcadSci USA,2011,108(10):4129-4134.

[7] Yang W,Xia Y,Hawke D,et al.PKM2 phosphorylates histone H3 and promotes gene transcription and tumorigenesis[J].Cell,2012,150(4):685-696.

[8] Tang H,Deng M,Tang Y,et al.miR-200b and miR-200c as Prognostic Factors and Mediators of Gastric Cancer Cell Progression [J].Clin Cancer Res,2013,19:5602-5612.

[9] Hartgrink HH,Jansen EP,van Grieken NC,et al.Gastric cancer[J].Lancet,2009,374(9688):477-490.

[10] Ventura A,Jacks T.MicroRNAs and cancer:short RNAs go a long way[J].Cell,2009,136(4):586-591.

[11] Slack FJ,Weidhaas JB.MicroRNA in cancer prognosis[J].N Engl J Med,2008,359(25):2720-2722.

[12] HurstDR,Edmonds MD,Welch DR.Metastamir:thefieldofmetastasisregulatory microRNA is spreading[J].Cancer Res,2009,69(19):7495-7498.

[13] Liu M,Lang N,Chen X,et al.miR-185 targets RhoA andCdc 42 expressionandinhibits the proliferation potential of human colorectal cells[J].Cancer Lett,2011,301(2):151-160.

[14] Zhi Q,Zhu J,Guo X,et al.Metastasis-related miR-185 is a potentialprognostic biomarker for hepatocellular carcinoma in early stage[J].Biomed Phar -acother,2013,67(5):393-398.

[15] Xiang Y,Ma N,Wang D,et al.MiR-152 and miR-185 co-contributetoovariancancer cells cisplatin sensitivity by targeting DNMT1 directly:anovel epigenetictherapy independent of decitabine[J].Oncogene,2014,33(3):378-386.

[16] Imam JS,Buddavarapu K,Lee-Chang JS,et al.MicroRNA-185 suppressestumorgrowth and progression by targeting the Six1 oncogene in human cancers[J].Oncogene,2010,29(35):4971-4979.

[17] Qu F,Cui X,Hong Y,et al.MicroRNA-185 suppresses proliferation,invasion,migration,and tumorigenicity of humanprostatecancercells throughtargeting androgen receptor[J].Mol Cell Biochem,2013,377(1-2):121-130.

[19] Tang H,Liu P,Yang L,et al.miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer[J].Mol Cancer Ther,2014,13(12):3185-3197.

[20] Chaneton B,Gottlieb E.Rocking cell metabolism:revised functions of the key glycolytic regulator PKM2 in cancer[J].Trends Biochem Sci,2012,37(8):309-316.

[21] Liu AM,Xu Z,Shek FH,et al.miR-122 targets pyruvate kinase M2 and affects metabolism of hepatocellular carcinoma[J].PLoS One,2014,9(1):e86872.

[22] Lluo W,Semenza GL.Emerging roles of PKM2 in cell metabolism and cancer progression[J].Trends in Endocrinology & Metabolism,2012,23(11):560-566.

ExpressionofmiR-185andPKM2inGastricCanceranditsClinicalSignificance

SHI Yuxiong,GUO Zhiwei,MIU Li,et al

(DepartmentofDiseaseControlandPrevention,the169thHospitalofPLA)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-185 and PKM2 in gastric cancer and its clinical significance.MethodsIn situ hybridization and immunohistochemistry were used to detect the expression of miR-185 and PKM2 in gastric cancer and normal stomach tumour specimens,respectively.The correlations among the miR-185,PKM2,and clinicopathological parameters of gastric cancer patients were analyzed.ResultsIn situ hybridization showed that the positive rate of miR-185 was 38.10% in gastric cancer,and 65.38% in normal stomach tumour specimens,the difference was statistically significant (χ2=14.36,P=0.000).Immunohistochemistry showed that the positive rate of PKM2 was 63.49% in gastric cancer,and 43.59% in normal stomach tumour specimens,the difference was statistically significant (χ2=7.74,P=0.006).The correlation analysis indicated that the expression of miR-185 had a negative correlation with that of PKM2 in gastric cancer(P<0.01).The positive rate of miR-185 in Ⅲ～Ⅳ stage gastric cancer was strongly lower than in Ⅰ～Ⅱ stage(P=0.001),the expression of miR-185 was also lower with lymph node metastasis than without lymph node metastasis in gastric carcinoma(P=0.003).The positive rate of PKM2 in Ⅲ～Ⅳ stage gastric cancer was strongly higher than in Ⅰ～Ⅱstage(P=0.002),the expression of PKM2 was also higher with lymph node metastasis than without lymph node metastasis in gastric carcinoma(P=0.006).However,there were no significant difference between different age,gender,histological grade as well as T stage group (P>0.05).ConclusionThe low expression of miR-185 and the high expression of the PKM2 protein may be important biological markers for malignant transformation in gastric cancer.

gastric cancer; miR-185; PKM2; clinical significance

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.007

2016-01-28；

2016-04-27

湖南省衛(wèi)生廳課題(B2014-067).

R735.2

A

蔣湘蓮)