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蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血后腦水腫的影響*

王 蔚1杜 淵2白 雪1楊思進1△

目的觀察蛭龍活血通瘀膠囊對大鼠腦出血后腦含水量、血腦屏障超微結構、血腦屏障通透性的影響。方法將195只大鼠隨機分為假手術組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊高、中、低劑量組，各組又分為12h、48h、72h三個亞組，采用自體尾部血注入法制備腦出血大鼠模型，采用干濕重法檢測腦含水量，伊文思藍法對各組進行血腦屏障通透性檢測，電子顯微鏡下觀察血腦屏障超微結構的變化。結果與模型組比較，ZL低、中、高劑量組腦含水量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，低劑量組12h(P<0.05)，其余各時間點各藥物組(P<0.01)；ZL低、中、高劑量組大鼠腦組織EB含量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對照，低、中劑量組在12h、48h及72h具有顯著性差異(P<0.01)。電鏡超微結構觀察發(fā)現(xiàn)血管周圍水腫程度較為輕微，血腦屏障的結構得到明顯改善。結論蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯減輕腦出血大鼠腦水腫，保護血腦屏障組織結構，避免其通透性破壞，改善血腦屏障功能，該作用存在一定的量效關系，ZL高劑量組作用最為明顯。

蛭龍活血通瘀膠囊；腦出血；血腦屏障功能；腦含水量

腦出血是常見的內科急癥，臨床病理研究證實[1]，腦出血急性期惡化死亡的主要原因是腦水腫及出血。腦出血后在出血區(qū)域形成血腫，對周圍腦組織造成壓迫，引起腦內的急性占位效應，并對周圍的腦組織產生進一步的損害，因此腦水腫被認為是腦出血后最重要的繼發(fā)性病理變化之一，往往成為腦出血病情加重的重要原因。腦出血后周圍組織水腫的發(fā)生機制與諸多因素有關[2]，其中，血腦屏障破壞被認為是主要的因素之一。本實驗研究觀察具有益氣活血、化瘀通絡功效的蛭龍活血通瘀膠囊對大鼠腦出血后腦組織含水量、血腦屏障通透性和血腦屏障超微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級的雄性健康SD大鼠195只，體質量250～300g，由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK(川)2013-065。動物按照每籠5只進行飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，濕度30%～40%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及試劑蛭龍活血通瘀膠囊：主要成分包括黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物，規(guī)格為0.4g/粒，相當于生藥 2.625g，由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號為20151201；水合氯醛：國藥集團化學試劑有限公司，批號：141203；肝素鈉注射液：成都市海通藥業(yè)有限公司，批號：150709；醫(yī)用碘伏消毒液：四川金山制藥有限公司，批號：150101；0.9%生理鹽水：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：B1510908；過氧化氫溶液：國藥集團化學試劑有限公司，批號：10011208；伊文思藍：上海醫(yī)藥集團上海試劑公司，批號：20150104；甲酰胺：重慶東方紅試劑廠，批號：140918。

1.3 實驗儀器大鼠腦立體定位儀：安徽正華生物儀器設備有限公司；ATPB457A小動物電子稱：深圳安普特電子科技有限公司；AUY220精密電子天平：日本島津公司；UPH-II-10T超純水機：南京優(yōu)普環(huán)保設備有限公司；GR60DR全自動高壓滅菌器：廈門致微公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：蘇州江東精密儀器有限公司；電子恒溫三用水箱：北京億百川科技發(fā)展有限公司；Model 680酶標儀：美國Bio-Rad；ANKE TGL-16B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；IMS-40全自動雪花制冰機：常熟雪珂電器有限責任公司；JEM-1400電子顯微鏡：日本電子株式會社；Leica熱膨脹式超薄切片機：河南榮程聯(lián)合科技有限公司。

1.4 動物造模及模型評估大鼠術前禁食12h，稱重麻醉后斷尾取尾部自體血50μl。將大鼠用立體定位儀俯臥位固定，備皮消毒，暴露手術區(qū)域，沿頭皮正中縱行切開約10mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，參照的Rosenber[3]的方法，并根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[4]進行尾殼核定位(矢狀縫右側旁開3.0mm，前囟前0.2mm處)，用微量進樣器按5μl/min的速度緩慢勻速注入自體血后，留針15分鐘緩慢退針，骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮。假手術組只進針，不注血。參照Zea Longa[5]“5分制法”對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。以評分為1～3 分認為造模成功，0分則認為造模失敗，4分和死亡大鼠均被剔除實驗并根據(jù)分組進行相應補充。假手術組大鼠在術后清醒后無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評分為0分。

1.5 動物分組及給藥將195只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、蛭龍活血通瘀低、中、高劑量組(分別簡稱為“ZL低劑量組”、“ZL中劑量組”、“ZL高劑量組”)，每組39只。并按指標檢測的時間劃分為12h、48h、72h三個亞組，每亞組13只。大鼠麻醉自然蘇醒后進行灌胃。各藥物組均給予蛭龍活血通瘀膠囊藥物的等體積和相應的濃度進行灌胃。蛭龍活血通瘀膠囊成人的臨床用藥量為3.6g/d，按照人體用量的5倍、10倍、20倍定為低、中、高劑量。成人體質量按60kg計算，換算成各藥物組大鼠的每日用藥量，分別為0.3g/kg/d、0.6g/kg/d、1.2g/kg/d。大鼠的灌胃體積為3ml/次，給藥次數(shù)為1次/日。模型組、假手術組給予同藥物組等體積(3ml/次)的生理鹽水灌胃，給藥次數(shù)同藥物組。

1.6 觀察指標

1.6.1 腦組織含水量大鼠稱重麻醉后快速斷頭取腦，去除軟腦膜及表面血液，切取雙側大腦半球組織置于電子天平稱重后，切取右側大腦組織稱得出血側腦濕質量，再將其移入恒溫鼓風干燥箱以110℃ 24h烘干至恒重，置于電子天平稱得出血側腦組織干質量。腦組織含水量(BWC)及腦系數(shù)計算公式為[6]：腦組織含水量(%)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%；腦系數(shù)(%)=全腦質量/體質量×100%。

1.6.2 血腦屏障超微結構樣本經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定，0.01M磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，蒸餾水漂洗，50%丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，滲透包埋，用Leica熱膨脹式超薄切片機切片，厚度為60nm；切片經(jīng)枸櫞酸鉛雙染色后，在電子顯微鏡下觀察血腦屏障的超微結構。

1.6.3 血腦屏障通透性參照Belagev等[7]的方法，采用檢測伊文思藍(evens blue，EB)法進行測定。采樣前2h，大鼠稱重麻醉，經(jīng)股靜脈以20mg/kg注入2%伊文思藍，2h后用0.9%生理鹽水心臟灌注后斷頭取腦，冠狀位切取針孔后腦組織稱取濕質量后浸于盛有3ml甲酰胺的試管中，經(jīng)電子恒溫水箱45℃加熱水浴24h，取上清1000rpm離心5 min，用酶標儀(波長620nm)測得光密度值(OD值)。以OD/g表示EB含量，反應血腦屏障的通透性。

2 結果

2.1 蛭龍活血通瘀膠囊對腦組織含水量的影響每組取5只比較腦組織含水量。假手術組組內在各時間點，腦含水量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，模型組和ZL低、中、高劑量組的腦含水量均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，ZL低、中、高劑量組大鼠腦含水量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。其中，低劑量組于12h時(P<0.05)，其余各時間點各藥物組(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對照，低、中劑量組在12h、48h及72h具有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量(%)比較 (只，

注：與模型組比較，1)P<0.01；與假手術組比較，2)P<0.01；與高劑量組比較，3)P<0.01

2.2 蛭龍活血通瘀膠囊對血腦屏障超微結構的影響血腦屏障由連續(xù)毛細血管內皮、內皮基膜、周細胞、周細胞基膜構成。周細胞環(huán)繞毛細血管，內皮組織間結構完整，內皮基膜及周細胞基膜完整，局部互相連接。見圖1。假手術組內皮胞質厚度較均勻、表面光滑，內有少量吞飲小泡，基膜走行規(guī)則、厚薄均勻、電子密度基本一致。星形膠質細胞腳板結構清楚，其內線粒體豐富。見圖2。模型組毛細血管周圍水腫明顯，血管與周圍神經(jīng)組織充滿水腫液，組織稀疏，電子密度降低，血管腔形態(tài)不規(guī)則，基膜厚薄不均，內皮局部膨出，內有吞飲泡，部分與基膜剝離，血腦屏障結構破壞。見圖3。ZL低劑量組血管周圍局部水腫明顯，血管形態(tài)不規(guī)則，內皮含較多小泡樣物質，基膜的完整性破壞，周圍神經(jīng)膠質細胞突起較少。見圖4。ZL中劑量組血管周圍水腫程度降低，毛細血管腔面粗糙，局部形成結節(jié)樣膨大，內皮含有較多吞飲小泡，基膜厚度不均勻，電子密度降低。見圖5。ZL高劑量組血管周圍水腫輕微，周細胞胞質中可見內質網(wǎng)與線粒體，局部水腫，內皮含較多泡樣物質，基膜完整，走形規(guī)則，電子密度基本均勻。見圖6。

圖1 (Figure 5)×5000

圖2 (Figure 6)×12000

圖3 (Figure 7)×12000

圖4 (Figure 8)×12000

圖5 (Figure 9)×12000

圖6 (Figure 10)×12000

2.3 蛭龍活血通瘀膠囊對各組大鼠血腦屏障通透性的影響每組取5只比較腦組織EB含量。假手術組在術后12h、48h、72h腦組織EB含量無明顯升高，組內各時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，模型組及ZL低、中、高劑量組的腦組織EB含量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，ZL低、中、高劑量組大鼠腦組織EB含量均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對照，低、中劑量組在12h、48h及72h具有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織EB含量(OD/g)比較 (只，

注：與模型組比較，1)P<0.01；與假手術組比較，2)P<0.01；與高劑量組比較，3)P<0.01。

3 討論

腦水腫是腦組織內液體過多貯積從而引起腦體積增大的一種病理狀態(tài)[8]，腦水腫時由于腦內的水分增加，從而導致腦容積增大。血腦屏障(BBB)功能受損是導致血管源性腦水腫(vasogenic brain edema， VBE)的主要因素。血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是腦與血液及腦脊液之間的一種屏障，是一個復雜的細胞系統(tǒng)。血腦屏障可以阻止血液中的某些物質進入腦組織，比如一些毒素和有害物質，但同時也能讓營養(yǎng)物質和代謝產物選擇性的順利通過，以維持腦組織內環(huán)境的相對穩(wěn)定，發(fā)揮其屏障作用。腦的毛細血管屬于連續(xù)型毛細血管，內皮細胞之間具有緊密的連接以封閉內皮，其外有完整的基膜，并有周細胞和星型膠質細胞的突起包繞[9]。構成血腦屏障的基本組織為腦毛細血管內皮細胞(BMECs)及其間緊密連接(TJ)、內皮基膜和星型膠質細胞足突[10]。當血腦屏障功能遭到破壞，水分就在滲透壓壓力梯度的作用下穿過受損的血腦屏障進入腦內，出現(xiàn)腦水腫影響顱內壓。

腦出血時血腦屏障也相應地遭到破壞，引起血腦屏障局部或廣泛的通透性改變，進而引起腦組織繼發(fā)性病理改變。腦出血性損傷以后各種因素綜合作用引起血腦屏障的通透性增高，腦組織內環(huán)境紊亂，血腦屏障遭到破壞，功能障礙，產生并加重腦水腫形成，主要與血管源性腦水腫有關。伊文思藍(Evens blue，EB)是一種偶氮基熒光染料，具有與體內外血清蛋白結合的特性，從而被廣泛應用于評價血腦屏障的通透性，通過可見的藍染區(qū)域和熒光顯微鏡下出現(xiàn)的紅色熒光可以定性反應血腦屏障的通透性，并可采用熒光分析定量檢測血管外的EB含量，目前被公認為是一種精確反應血腦屏障通透性的方法[11,12]。

本研究表明，自體血制備的腦出血大鼠在術后72h內腦含水量逐漸升高，腦水腫程度呈進行性加重的趨勢，蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯降低腦出血大鼠腦組織含水量。腦出血模型大鼠在術后12h血腦屏障的通透性即可發(fā)現(xiàn)有明顯改變，腦組織EB含量明顯升高，術后48h時升高最為明顯，72h時較之稍有下降。電鏡超微結構顯示術后48h，整個血管腔形態(tài)不規(guī)則，基膜厚薄不均，毛細血管周圍水腫明顯，組織稀疏，電子密度降低，內皮局部膨出，部分與基膜剝離，血腦屏障結構發(fā)生破壞。當給予蛭龍活血通瘀膠囊低、中、高劑量進行藥物干預治療后，在術后12h、48h及72h，大鼠血腦屏障通透性較模型組均具有不同程度的改善，腦組織EB含量較之有所下降，電鏡超微結構觀察發(fā)現(xiàn)血管周圍水腫程度較為輕微，血腦屏障的結構相對完整。說明蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠血腦屏障功能具有明顯的改善作用。

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四川省科技廳分階段中醫(yī)藥干預腦出血急性期優(yōu)化方案研究(No.14ZC0036)

1．西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科(瀘州 646000)；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院兒科(瀘州 646000)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.22.019

1003-8914(2016)-22-3271-04

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2016-09-21)