呂哲張穎王團(tuán)徐鷗路虹

豚鼠腦缺血再灌注后聽皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)及意義△

呂哲1張穎1王團(tuán)2徐鷗1路虹1

目的 觀察豚鼠腦缺血再灌注后葡萄糖結(jié)合蛋白（glucose－regulated protein，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）在聽皮層的表達(dá)，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在腦缺血再灌注后聽皮層神經(jīng)元凋亡中的作用。方法 選取健康豚鼠50只，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、A組（缺血再灌注6 h）、B組（缺血再灌注12 h）、C組（缺血再灌注24 h）、D組（缺血再灌注72 h）。采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法建立腦缺血再灌注損傷模型，分別在腦缺血再灌注后6、12、24、72 h行聽性腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試后處死各組豚鼠，應(yīng)用HE染色法觀察聽皮層神經(jīng)元病理變化，免疫組化染色及Western－blot方法檢測(cè)各組GRP78、caspase－12的表達(dá)。結(jié)果 從正常對(duì)照組到B組豚鼠ABR反應(yīng)閾值逐漸增加，從C組到D組又逐漸下降，但D組仍比正常對(duì)照組高（P＜0.05）。HE染色示正常對(duì)照組聽皮層神經(jīng)元排列整齊，胞漿豐富，胞核大而圓，染色清晰；A、B、C、D組聽皮層神經(jīng)元均有不同程度的數(shù)量減少，且體積萎縮，胞核固縮，碎裂，核仁消失。免疫組化染色及Western－blot示正常對(duì)照組GRP78、caspase－12蛋白僅有微量或少量表達(dá)，缺血再灌注后6 h，二者表達(dá)開始上調(diào)，至12 h GRP78表達(dá)達(dá)到高峰，12 h后逐漸降低，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。caspase－12表達(dá)24 h達(dá)到峰值，后逐漸下降，缺血再灌注6 h組與12 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 腦缺血再灌注損傷可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使GRP78、caspase－12表達(dá)增加，GRP78、caspase－12可能參與了ERS介導(dǎo)的聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過(guò)程。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 缺血再灌注損傷； 凋亡

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）近年來(lái)備受國(guó)外學(xué)者的關(guān)注，尤其是其在腦缺血再灌注后聽皮層神經(jīng)元凋亡過(guò)程中的作用更是研究者關(guān)注的重點(diǎn)之一。腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未恢復(fù)，反而出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的機(jī)能障礙，稱之為缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡；聽覺皮質(zhì)接受來(lái)自大腦中動(dòng)脈的血供，在缺血缺氧情況下容易發(fā)生細(xì)胞凋亡。本研究旨在通過(guò)建立豚鼠腦缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)其聽皮層組織中葡萄糖結(jié)合蛋白（glucose－regulated protein，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）的表達(dá)，探討腦缺血再灌注對(duì)聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)及ERS介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過(guò)程，為臨床血管病變?cè)斐陕爴p傷的治療提供理論依據(jù)及新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇健康白色雄性豚鼠50只，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重400～450 g，雙耳ABR反應(yīng)閾均在10 d B SPL以內(nèi)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、A組（缺血再灌注6 h）、B組（缺血再灌注12 h）、C組（缺血再灌注24 h）、D組（缺血再灌注72 h），每組10只。

1.2 試劑和儀器 PXS－1020型體視解剖顯微鏡，ICS－CHARTR－EP型ABR電位儀（北京麥德森醫(yī)療器械），免疫組化試劑盒（河北博海生物工程有限公司），兔抗鼠GRP78抗體（美國(guó)SANTA Cruz），兔抗鼠caspase－12抗體（美國(guó)SANTA Cruz），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（碧云天生物技術(shù)公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）。

1.3 腦缺血再灌注動(dòng)物模型的建立 A、B、C、D組動(dòng)物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于頸部正中切口逐層分離暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈后用微動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，計(jì)時(shí)15 min后恢復(fù)血流灌注，沖洗創(chuàng)口對(duì)位縫合。在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后豚鼠出現(xiàn)翻正反射消失、雙側(cè)瞳孔散大、對(duì)光反射消失，呼吸平穩(wěn)無(wú)抽搐，清醒后反應(yīng)遲鈍，無(wú)偏癱或癲癇［1］，為腦缺血再灌注動(dòng)物模型建立成功。對(duì)照組動(dòng)物不作任何處理。

1.4 聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）測(cè)試 對(duì)照組及A、B、C、D組于腦缺血再灌相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行ABR檢測(cè)。動(dòng)物水合氯醛腹腔注射麻醉后置于隔聲屏蔽室內(nèi)，采用美國(guó)ICS聽性腦干誘發(fā)電位儀檢測(cè)，刺激聲為短聲，極性為交替波，速率為21.1次／秒，增益為50 k，以可引出波III的最小刺激強(qiáng)度定為ABR反應(yīng)閾。

1.5 動(dòng)物聽皮層標(biāo)本制備及染色觀察 參照《大鼠腦立體定位圖譜》［2］，確定豚鼠聽皮層區(qū)域。

完成ABR檢測(cè)后，每組取2只豚鼠麻醉后，開胸經(jīng)心尖依次灌注生理鹽水和多聚甲醛，取出整個(gè)大腦置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定后二次取材，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制成石蠟塊，確定聽皮層區(qū)域，用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，行HE染色及免疫組化檢測(cè)。各組其余8只豚鼠麻醉后迅速冰上斷頭取腦，找到聽皮層，用刀片切取后盡量切碎，－80℃冰箱保存。

1.5.1 HE染色及聽皮層神經(jīng)元觀察 二甲苯脫蠟2次，無(wú)水乙醇洗去二甲苯2次，依次浸入95%、80%、70%酒精水化，蘇木精染色。然后1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，直至輕柔甩干，中性樹脂封片。觀察聽皮層神經(jīng)元的大小、形態(tài)、分布以及胞漿、胞核、核仁變化。用Image Pro Plus 5.1彩色圖像處理軟件在40×10倍鏡下計(jì)數(shù)每張切片的凋亡細(xì)胞。

1.5.2 免疫組化染色檢測(cè)GRP78、caspase－12表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水，采用辣根過(guò)氧化物酶染色，胞漿或胞核有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。全自動(dòng)照相機(jī)顯微鏡下拍照，Image Pro Plus 5.1圖像處理軟件在40×10倍鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片采集5個(gè)具有代表性的高倍視野。

1.5.3 Western－blot檢測(cè)GRP78、caspase－12蛋白表達(dá) 聽皮層組織加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑進(jìn)行低溫勻漿，蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白樣品含量，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（兔抗鼠GRP78、caspase－12多克隆抗體）、二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG）孵育，洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X光膠片曝光，進(jìn)行條帶掃描，計(jì)算目的樣本蛋白光密度與β－actin基因條帶光密度比值，分析GRP78、caspase－12蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ABR反應(yīng)閾 正常對(duì)照組及A、B、C、D組動(dòng)物雙耳ABR反應(yīng)閾見表1，可見從正常對(duì)照組到B組雙耳ABR反應(yīng)閾值逐漸增加，從C組到D組逐漸下降，但D組ABR反應(yīng)閾仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 各組聽皮層HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組豚鼠聽皮層神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞體積較大，胞漿豐富呈紅色，胞核大而圓，核膜清楚，核仁明顯，染色清晰。A、B、C、D組（腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)）聽皮層神經(jīng)元數(shù)量減少，分布不均，有不同程度的體積萎縮，胞漿、胞核窺視不清，核膜、核仁分界不明，胞核固縮，碎裂，核仁消失（圖1）。對(duì)各組凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，除A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＝0.839），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 各組免疫組化結(jié)果 GRP78抗原陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿有棕黃色，正常對(duì)照組GRP78陽(yáng)性細(xì)胞少量表達(dá)，缺血再灌注6 h后（A組）陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)即迅速增加，至12 h（B組）達(dá)到高峰，以后表達(dá)逐漸減少，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖2）。caspase－12抗原陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，胞漿胞核均有表達(dá)，但以胞漿表達(dá)為主，正常對(duì)照組僅有微量表達(dá)，缺血再灌注6 h（A組）陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)有少量增加，之后表達(dá)逐漸增加，至24 h（C組）達(dá)高峰，然后明顯下降。除正常對(duì)照組與缺血再灌注72 h（D組）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＝0.086），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖3）。

2.4 各組聽皮層GRP78、caspase－12蛋白Western－blot檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組GRP78、caspase－12蛋白僅有微量表達(dá)，缺血再灌注6 h（A組）二者表達(dá)開始上調(diào)，至12 h（B組）GRP78表達(dá)達(dá)到高峰，以后逐漸減少，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。caspase－12表達(dá)在缺血再灌注24 h（C組）時(shí)達(dá)到峰值，后逐漸下降，A組與B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.117），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖4）。

表1 各組ABR反應(yīng)閾、凋亡細(xì)胞數(shù)及聽皮層GRP78、caspase－12表達(dá)（±s）

表1 各組ABR反應(yīng)閾、凋亡細(xì)胞數(shù)及聽皮層GRP78、caspase－12表達(dá)（±s）

－actin正常對(duì)照組9.91±3.16 2.4±1.12 13.41±1.11 4.93±0.66 0.1組別ABR反應(yīng)閾（dB SPL）凋亡細(xì)胞數(shù)（個(gè)）GRP78免疫組化表達(dá)caspase－12免疫組化表達(dá)GRP78／β－actin caspase－12／β 49±0.037 0.252±0.025 A組29.81±2.94 13.8±2.43 35.59±2.71 12.01±2.47 0.223±0.030 0.301±0.018 B組35.22±1.54 23.7±2.15 75.05±5.61 54.47±5.70 1.118±0.027 0.327±0.028 C組29.99±2.13 14.5±3.12 46.17±5.50 85.61±2.46 0.259±0.030 1.122±0.043 D組20.20±2.07 8.4±2.37 40.76±3.74 7.74±2.36 0.403±0.036 0.428±0.041 F 4 940.348 88.937 321.766 1 005.222 1 194.191 1 000.992 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾、折疊、運(yùn)輸?shù)闹饕獔?chǎng)所，在缺血缺氧、自由基損傷、毒性氨基酸等各種有害因素刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到擾動(dòng)，蛋白質(zhì)的折疊將會(huì)受到影響，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白大量增多并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，進(jìn)一步引起細(xì)胞功能障礙，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS）［3，4］。同時(shí)，ERS也將啟動(dòng)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，即通過(guò)激活分子伴侶蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，促使分子伴侶蛋白（如GRP78）表達(dá)增加，抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)加強(qiáng)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的折疊或降解，以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的負(fù)擔(dān)，從而抵抗應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞起到一定程度的保護(hù)作用［5，6］。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)程度過(guò)強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間過(guò)久時(shí)，則超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護(hù)能力范圍，此時(shí)，分子伴侶（GRP78）表達(dá)不僅不再增加，反而減少，并通過(guò)激活caspase－12前體，進(jìn)一步激活caspase－9、caspase－3等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

在缺血缺氧情況下，大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)等缺血缺氧敏感區(qū)最易發(fā)生細(xì)胞凋亡。聽覺皮質(zhì)接受大腦中動(dòng)脈的血供，當(dāng)其受到阻塞壓迫等造成血流灌注減少時(shí)，聽皮質(zhì)遭受缺血損傷，再灌注后又會(huì)造成再灌注損傷，聽皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)發(fā)生一系列的反應(yīng)，如鈣超載，大量活性氧自由基的產(chǎn)生，從而誘發(fā)ERS，使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［7，8］。本實(shí)驗(yàn)在課題組原有方法的基礎(chǔ)上［1］稍加改進(jìn)，采用夾閉動(dòng)物雙側(cè)頸總動(dòng)脈從而造成不全腦缺血，也出現(xiàn)了瞳孔散大、對(duì)光反射消失，無(wú)抽搐，術(shù)后清醒后反應(yīng)遲鈍，沒(méi)有出現(xiàn)偏癱或癲癇，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的腦缺血再灌注模型造模成功。此方法創(chuàng)傷小，動(dòng)物死亡率低，與臨床實(shí)際情況更加接近，實(shí)驗(yàn)中無(wú)動(dòng)物死亡。

圖1 各組動(dòng)物聽皮層HE染色結(jié)果（HE×400）

圖3 各組動(dòng)物聽皮層caspase－12免疫組化結(jié)果（免疫組化×400）

圖4 各組動(dòng)物聽皮層GRP78、caspase－12蛋白Western－blot結(jié)果

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最主要的分子伴侶蛋白，被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志物，能夠協(xié)助錯(cuò)誤蛋白折疊、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞漿間的鈣離子平衡，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［9］。正常狀態(tài)下，GRP78與3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白結(jié)合，包括肌醇需求激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE－1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶（phosphorylated extracellularsignal regulated kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6），處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GRP78與3個(gè)跨膜應(yīng)激感受蛋白解離，并與錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白結(jié)合，同時(shí)解離后的感受蛋白通過(guò)各自的信號(hào)傳導(dǎo)途徑啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），減少未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積，促進(jìn)其降解［10］；因此，GRP78表達(dá)量顯著增高，在一定程度上反映了ERS的啟動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，聽皮層GRP78蛋白表達(dá)逐漸增多，在再灌注后12小時(shí)最多，其后表達(dá)逐漸下降，提示腦缺血再灌注后誘發(fā)了ERS，以拮抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)細(xì)胞，但當(dāng)應(yīng)激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)（＞12 h），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能結(jié)構(gòu)受到破壞，出現(xiàn)功能障礙，超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自我保護(hù)能力，GRP78不但不繼續(xù)升高，反而下降。提示缺血再灌注12 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是比較合適的，超過(guò)此時(shí)間段則超出了細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)能力，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度，細(xì)胞凋亡及壞死將明顯增加。

caspase－12也是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)主要因素，僅在ERS時(shí)被特異性激活，非ERS相關(guān)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中不被激活。它以酶原的形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激時(shí)被活化，激活后移位到胞質(zhì)繼而激活caspase－9、caspase－3引起細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)報(bào)道，caspase－12缺陷的小鼠較有caspase－12表達(dá)的小鼠腎小管細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激更有抵抗力，而對(duì)非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，二者敏感性相似，表明caspase－12與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制有關(guān)，而與非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（死亡受體途徑和線粒體途徑）無(wú)關(guān)，即caspase－12特異性的參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡途徑，因此caspase－12被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的重要標(biāo)志物［11，12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caspase－12在腦缺血再灌注6 h后聽皮層開始表達(dá)，并隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增多，在24 h時(shí)表達(dá)最多。提示再灌注12 h后，超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護(hù)能力范圍，此時(shí)GRP78表達(dá)下降，caspase－12前體被激活，并進(jìn)一步激活凋亡相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致聽皮層神經(jīng)元凋亡。

研究顯示，噪聲、缺血、缺氧、耳毒性藥物等都可導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾［13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，因而也是腦缺血損傷聽皮層引發(fā)聽力下降的重要機(jī)制。本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使GRP78、caspase－12表達(dá)增加，GRP78、caspase－12參與了ERS介導(dǎo)的聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過(guò)程。抑制ERS，阻止其誘導(dǎo)的凋亡途徑可能為治療突發(fā)性聾，尤其是伴腦血管基礎(chǔ)疾病的突發(fā)性聾提供新的治療思路［1，14］，如：消除誘因，促進(jìn)ERS特異性保護(hù)蛋白的表達(dá)；終止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡途徑的下傳等。

1 路虹，王團(tuán)，徐鷗，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對(duì)豚鼠腦缺血再灌注后聽皮質(zhì)區(qū)損傷的作用［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2014，21：249.

2 Paxinos G，Watson C，著.諸葛啟釧，主譯.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.102～115.

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14 路虹，王團(tuán)，徐鷗，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與聽力損傷的相關(guān)研究［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2014，21：220.

（2015－10－12收稿）

（本文編輯 李翠娥）

Expression of the ERS－associated Factors on Auditory Cortex after Brain lschemia Reperfusion lnjury in Guinea Pig

Lv Zhe*，Zhang Ying，Wang Tuan，Xu Ou，Lu Hong
（*Department of Otolaryngology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To investigate the expression of GRP78 and caspase－12 on the auditory cortex and to study the effects of endoplasmic reticulum stress in the auditory cortex neuron apoptosis after the brain ischemia reperfusion injury in guinea pig.Methods Fifty healthy male guinea pigs were selected and randomly divided into 5 groups which were hormal group group A（reperfusion for 6 hours），group B（reperfusion for 12 hours），group C（reperfusion for 24 hours），group D（reperfusion for 72 hours）.The cerebral ischemia reperfusion injury model was produced by the occlusion of bilateral common carotid arteries.The guinea pigs were sacrificed at reperfusion of 6，12，24，and 72 hours respectively after they received ABR tests.The pathological changes were observed by HE and the levels of GRP78 and caspase－12 protein were detected by immunohistochemistry and Western blot.Results The hearing thresholds increased gradually from the normal group to group B，and decreased gradually from group Cto group D，but the thresholds of group D were still higher than that of the normal group.HE staining showed that the neurons in the normal control group were arranged in order，the cytoplasm was abundant，large and round.The cells were stained clearly.After reperfusion，the number of neurons in each time point was decreased，the nucleus presented atrophic，fragmented，the disappeared.The expression of GRP78 and caspase－12 protein in normal control group was only a trace or a small amount by immunohistochemistry and Western blot.The expression of GRP78 and caspase－12 began to inerease.The expression of GRP78 reached the peak at reperfusion of 12 hours and decreased gradually.There were significant statistic differences between each group comparison.The expression of caspase－12 reached the peak at reperfusion of 24 hours，then decreased gradually.There was no statistic difference between group A and group B.There were significant statistic differences anong other groups.Conclusion Endoplasmic reticulum stress（ERS）may be induced by brain ischemia reperfusion injury，and can increase the expression of GRP78 and caspase－12.GRP78 and caspase－12 participate in the process of neuron apoptosis on auditory cortex caused by ERS.

Endoplasmic reticulum stress； Ischemia reperfusion injury； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.013

時(shí)間：2016－6－29 16：11

R339.16

A

1006－7299（2016）04－0377－05

△ 河北省衛(wèi)計(jì)委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究基金（ZL20140118）資助

1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科（石家莊 050000）； 2 河北省邯鄲市第三醫(yī)院耳鼻喉科

呂哲，女，河北人，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槎萍膊〉幕A(chǔ)和臨床研究。

路虹（Email：wx_900804＠163.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1611.028.html