陳軍 夏武杰 薛楊靜 胡建堅(jiān)

●論 著

黃芪甲苷對(duì)3，4苯并芘介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

陳軍 夏武杰 薛楊靜 胡建堅(jiān)

目的 觀察黃芪甲苷對(duì)3，4苯并芘（BaP）介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。方法 采用密度梯度離心法收集人臍血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)EPCs，消化收集第4代細(xì)胞，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組：不作任何處理；Bap組：予BaP，濃度為20μmol/L；3種濃度黃芪甲苷各組（先加入濃度分別為2、10、50μg/ml的黃芪甲苷，2h后再加入濃度為20μmol/L的Bap）。分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，黏附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)其超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量，免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞活性氧（ROS）的表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，BaP組細(xì)胞的增殖、黏附以及遷移能力均明顯降低（均P＜0.01），黃芪甲苷預(yù)保護(hù)可呈濃度依賴(lài)性地提高EPCs增殖、黏附及遷移能力（均P＜0.05）；BaP組培養(yǎng)上清液中MDA含量與正常對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.01），SOD含量明顯下降（P＜0.01），ROS表達(dá)明顯上升（P＜0.01），不同濃度的黃芪甲苷可降低培養(yǎng)上清液中MDA含量（P＜0.05），提高SOD含量（P＜0.05），并且呈濃度依賴(lài)性地降低細(xì)胞ROS表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論 黃芪甲苷對(duì)BaP介導(dǎo)的EPCs損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

3，4苯并芘 內(nèi)皮祖細(xì)胞 黃芪甲苷 氧化應(yīng)激

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性病變，它的主要特點(diǎn)是脂質(zhì)和纖維成分在大血管長(zhǎng)期堆積，最終導(dǎo)致冠心病的發(fā)生[1]。而冠心病已經(jīng)成為全球發(fā)病率、病死率最高的疾病[2]。目前，人們廣泛認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣化的啟動(dòng)和進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用[3]。動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷可以導(dǎo)致血管屏障功能的喪失，進(jìn)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及脂質(zhì)推積。1997年，Asahara第1次分離培養(yǎng)到內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），它是一群能分化成內(nèi)皮細(xì)胞的干/祖細(xì)胞[4]。大量研究表明，它參與內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過(guò)程，其數(shù)量和功能與動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性呈負(fù)相關(guān)。吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，與腦卒中和冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)病率的增加相關(guān)。香煙煙霧中含有大量的有害物質(zhì)，3，4苯并芘（BaP）就是其中的一種[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，BaP對(duì)EPCs的多項(xiàng)生物學(xué)功能有損傷作用[6]。因此，尋找一種能降低煙草對(duì)心血管損傷，并且改善BaP對(duì)EPCs損傷的藥物，已引起醫(yī)學(xué)科研人員的高度重視。黃芪甲苷作為黃芪的一種活性成分，已被發(fā)現(xiàn)有很強(qiáng)的心血管保護(hù)作用[7-8]，但其對(duì)BaP介導(dǎo)的EPCs是否有保護(hù)作用以及潛在機(jī)制尚未清楚，對(duì)此筆者進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 BaP（美國(guó)Sigma-Aldrichg公司），黃芪甲苷(上海融禾公司)，EGM-2培養(yǎng)基（瑞士Lonza公司），人淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），胰酶、Hank's液（美國(guó)Gibco公司），F(xiàn)BS、FITC-UEA-I（美國(guó)Sigma-Aldrichg公司），Dil-ac-LDL（美國(guó) Molecular Probe公司），Ⅷ因子相關(guān)抗原細(xì)胞化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所），超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、細(xì)胞活性氧（ROS）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定 采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)EPCs。臍帶血來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康的順產(chǎn)產(chǎn)婦，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，每次采血50ml，采用密度梯度離心法從臍血中分離獲取單個(gè)核細(xì)胞，以5×106個(gè)/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶中加入4ml含有10%的FBS、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）（10ng/ml）的EGM-2培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48h更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞集落長(zhǎng)成80%匯集度即可用0.05%含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。采用Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)、Dil-ac-LDL/FITC-UEA-I lectin雙熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞；采用免疫組化法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的Ⅷ因子相關(guān)抗原，步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。空白對(duì)照不加一抗，陰性對(duì)照采用胃癌細(xì)胞株GSC7901。為鑒定培養(yǎng)細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-I lectin，將細(xì)胞制成5×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液，加入終濃度2.4μg/ml的Dil-ac-LDL，在培養(yǎng)箱中避光孵育2h。吸棄上清液，4%多聚甲醛固定15min，加入FITC-UEA-I lectin（10mg/ml），繼續(xù)孵化1h，取出蓋玻片，用PBS輕輕沖洗2次，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 EPCs生長(zhǎng)至70%～90%匯合度時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，以低FBS（含2%FBS）的EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化，然后以0.05%含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞，并以含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成5×106個(gè)/ml密度的單個(gè)細(xì)胞懸液。制成細(xì)胞懸液，以同等數(shù)量細(xì)胞接種，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組：不作任何處理；BaP組：加入濃度為20μmol/L的BaP；3種濃度黃芪甲苷各組（先加入濃度分別為2、10、50μg/ml的黃芪甲苷，2h后再加入濃度為20μmol/L的BaP），各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞功能檢測(cè)

1.3.1 增殖能力測(cè)定 消化收集第4代EPCs并以含2%FBS的培養(yǎng)基重懸，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，各組均以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種至預(yù)先包被hFN的96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)調(diào)零孔，同樣設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔只添加含2%FBS的EGM-2培養(yǎng)液；然后將96孔板置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，吸棄培養(yǎng)基，重新添加含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，置酶標(biāo)儀450nm處測(cè)OD值。

1.3.2 黏附能力測(cè)定 各組細(xì)胞均按5 000個(gè)/孔的密度接種至預(yù)先包被hFN的96孔板中，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，洗去未貼壁細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野（×200），倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 遷移能力測(cè)定 按上述方法收集并重懸細(xì)胞，在24孔板中放入transwell小室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入用含2%FBS培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后，取出transwell小室，用多聚甲醛固定微孔膜下層的細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色，顯微鏡計(jì)數(shù)遷移至小室底部的細(xì)胞。

1.4 測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD及MDA含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，SOD測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD含量；MDA測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA含量。上述操作嚴(yán)格依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后置于可見(jiàn)光分光光度儀測(cè)各組吸光度，最后按說(shuō)明書(shū)中換算公式得出測(cè)量數(shù)據(jù)。

1.5 測(cè)定各組EPCs細(xì)胞內(nèi)ROS含量 按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)處理后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗細(xì)胞2次，然后在6孔板中加入用EGM-2稀釋的濃度為10μmol/ ml的DCFH-DA，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。最后吸棄上清液，用PBS輕洗細(xì)胞，取出蓋玻片置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波波長(zhǎng)為484nm，發(fā)射波波長(zhǎng)為525nm。用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，用平均灰度值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)7～8d后，置于顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈梭行，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣的集落（圖1a）。Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1 lectin結(jié)合雙熒光染色試驗(yàn)陽(yáng)性，細(xì)胞膜攝取FITC-UEA-1 lectin發(fā)綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)吞噬Dil-ac-LDL發(fā)紅色熒光（圖1b，此圖為雙染圖片融合后的復(fù)合圖像）。Ⅷ因子細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性，細(xì)胞呈現(xiàn)棕色（圖1c），作為對(duì)照的胃癌細(xì)胞不顯色。

圖1 EPCs的形態(tài)與鑒定

2.2 黃芪甲苷對(duì)EPCs增殖能力的影響 與正常對(duì)照組比較，BaP明顯抑制了EPCs的增殖能力（P＜0.01）；經(jīng)過(guò)24h干預(yù)后，黃芪甲苷能恢復(fù)EPCs受損的增殖能力，且隨著濃度的增高而增高（均P＜0.01），詳見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪甲苷對(duì)EPCs增殖能力的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 黃芪甲苷對(duì)EPCs黏附能力的影響 與正常對(duì)照組比較，BaP對(duì)EPCs的黏附能力有損害作用（P＜0.01），經(jīng)過(guò)不同濃度黃芪甲苷干預(yù)后，黃芪甲苷能恢復(fù)EPCs受損的黏附能力，且隨著濃度的增高而增高（均P＜0.05），詳見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪甲苷對(duì)EPCs黏附能力的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 黃芪甲苷對(duì)EPCs遷移能力的影響 與正常對(duì)照組比較，BaP明顯損害EPCs的遷移能力（P＜0.01），經(jīng)過(guò)24h干預(yù)后，黃芪甲苷能恢復(fù)EPCs受損的遷移能力，且隨著濃度的增高而增高（均P＜0.01），詳見(jiàn)圖4（見(jiàn)插頁(yè)）。

2.5 黃芪甲苷對(duì)EPCs中SOD及MDA含量的影響與正常對(duì)照組比較，BaP組的SOD含量明顯降低（P＜0.01），MDA含量明顯上升（P＜0.01）；與BaP組相比，不同濃度黃芪甲苷組的SOD含量明顯上升（P＜0.05），MDA含量下降（P＜0.05），并且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著黃芪甲苷濃度的增加，效果越明顯，詳見(jiàn)圖5。

2.6 黃芪甲苷對(duì)EPCs中ROS的影響 與正常對(duì)照組比較，BaP組的ROS表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與BaP組相比，不同濃度黃芪甲苷組的ROS表達(dá)明顯下降（P＜0.01），且呈濃度依賴(lài)性，詳見(jiàn)圖6（見(jiàn)插頁(yè)）。

3 討論

EPCs是出生后機(jī)體中存在的、能特異性歸巢于血管損傷、血管新生部位并分化成內(nèi)皮細(xì)胞的一群干/祖細(xì)胞[4]。近年來(lái)，EPCs在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展乃至治療中的作用越來(lái)越受關(guān)注[9]。研究證實(shí)，其數(shù)量及功能受損可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)功能減弱，從而促使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[10]。吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，而B(niǎo)aP是香煙煙霧的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，BaP顯著損害EPCs的增殖、黏附、遷移能力，并且明顯減低細(xì)胞上清液中SOD含量，提高M(jìn)DA含量及ROS的表達(dá)，筆者推測(cè)BaP對(duì)EPCs生物學(xué)功能的損害可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。

圖5 黃芪甲苷對(duì)EPCs中SOD及MDA的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

有研究顯示，適當(dāng)水平的ROS，例如超氧離子、二氧化二氫，可以作為細(xì)胞活動(dòng)中的一種信號(hào)因子，對(duì)于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、遷移、分化、凋亡和衰老有著重要的作用[11]。但是，過(guò)量的ROS對(duì)于各種細(xì)胞，如EPCs或其它干細(xì)胞、祖細(xì)胞則是有害的[12]。SOD是一種生物酶，他通過(guò)岐化方式清除體內(nèi)的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和基質(zhì)免受氧自由基的損害[13]。研究表明，人EPCs之所以可以耐受適當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激，是因?yàn)槠浼?xì)胞內(nèi)含有較多可以清除超氧負(fù)離子的酶-錳SOD(MnSOD）[14]，而過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激會(huì)使得EPCs的功能活性受損[15]。MDA作為氧自由基，與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化物的程度，間接反應(yīng)細(xì)胞受自由基的損傷程度相關(guān)[16]。

黃芪，作為一種中藥，曾長(zhǎng)期被廣泛用于治療多種心血管疾病[7]。從黃芪中可以分離純化得到許多具有藥用價(jià)值的化合物，包括黃芪皂苷、多糖和黃酮，而黃芪甲苷是其中重要活性部分之一。目前體內(nèi)和體外研究表明黃芪甲苷可能通過(guò)抗氧化效應(yīng)對(duì)心肌起保護(hù)作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能改善BaP介導(dǎo)的EPCs多種生物學(xué)功能，包括增殖能力、黏附能力、遷移能力，并且伴隨著EPCs多種生物學(xué)功能的改善，黃芪甲苷能夠顯著升高上清液中SOD含量，降低MDA含量及ROS的表達(dá)。這提示著黃芪甲苷可能通過(guò)減少氧化應(yīng)激從而對(duì)BaP介導(dǎo)的EPCs起到保護(hù)作用。

本研究為黃芪甲苷治療心血管疾病提供了新的證據(jù)，也間接說(shuō)明其在心血管疾病治療領(lǐng)域上有著廣闊的前景。

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Protective effect of astragaloside IV on benzo[a]pyrene-mediated endothelial progenitor cell dysfunction and its mechanism

CHEN Jun,XIA Wujie,XUE Yangjing,et al.Department of Intensive Care Unit,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the protective effect ofAstragaloside IV(As IV)on benzo[a]pyrene(BaP)-mediated endothelial progenitor cell(EPC)dysfunction and to explore the underlying mechanism. Methods Human umbilical cord blood mononuclear cells were seeded in adherent culture to obtain EPCs.The EPCs were divided into 3 groups:control group,BaP group,and As IV group.BaP and Ac IV groups were treated with 20μmol/L BaP for 24h,and before exposure to BaP the As IV groups were pre-treated with different concentrations of Astragaloside IV(2,10 and 50μg/ml)for 24h.The proliferation,adhesion and migration of EPCs were evaluated by CCK-8 method,adhesion assay and Transwell assay,respectively.The superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)levels in culture supernatants were measured,and the expression of ROS was detected by immunofluorescence staining. Results Compared to the control group,BaP-treated EPCs showed a decline in proliferation,adhesion and migration (P＜0.01);while As IV treatment significantly attenuated BaP-induced decline of cell proliferation,adhesion and migration(P＜0.05)in EPCs.Furthermore,BaP-treated EPCs presented an increasing expression of ROS and MDA,but a decline ofSOD secretion(P＜0.01);while various concentrations of Astragaloside IVreduced the production of MDA(P＜0.05)and ROS(P＜0.01),and increased the SOD activity(P＜0.05)of EPCs in a concentration-dependent manner. Conclusion Astragaloside IVis able to prevent BaP-mediated EPCs dysfunction,probably by inhibiting oxidative stress.

Benzo[a]pyrene(Bap)Endothelialprogenitor cells(EPCs)Astragaloside IV Oxidative stress

2015-08-18）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟監(jiān)護(hù)室（陳軍）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU（胡建堅(jiān)），心血管內(nèi)科（夏武杰、薛楊靜）

陳軍，E-mail：531818260@qq.com