段廣亮 戴輝萍 唐婷婷 丁飛 朱桂婷

喉癌干細胞的培養(yǎng)及其放射抗拒相關(guān)miRNA的篩選研究

段廣亮 戴輝萍 唐婷婷 丁飛 朱桂婷

目的 通過培養(yǎng)Hep-2喉癌細胞株，分離并擴增出腫瘤干細胞，放療后篩選出調(diào)控放射抗拒的miRNA。方法 含生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep-2喉癌細胞株，流式細胞儀檢測細胞中側(cè)群細胞的比例。當側(cè)群細胞比例達25%時，收集全部細胞球，篩選出CD133+、CD44+細胞作為喉癌干細胞，X線照射喉癌干細胞。miRNA生物芯片檢測照射與未照射的喉癌干細胞，篩選出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA，確定用以調(diào)控放射抗拒的miRNA。結(jié)果 成功培養(yǎng)出側(cè)群細胞，流式細胞儀檢測其比例達到26.2%，篩選出的CD133+、CD44+細胞的比例均高于91%。通過miRNA芯片成功檢測出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA。結(jié)論 本研究成功培養(yǎng)出喉癌干細胞，成功篩選出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)了可能用以調(diào)控放射抗拒的miRNA。

無血清培養(yǎng)基 miRNA 側(cè)群細胞 放療

腫瘤干細胞是腫瘤組織中少數(shù)具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，且具有放射抵抗能力，因此腫瘤干細胞被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和放射抵抗的根源。側(cè)群細胞和CD133+、CD44+腫瘤細胞是較為認可的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的標志干細胞[1]。miRNA是目前腫瘤細胞內(nèi)已知的一類最重要的基因調(diào)控分子，特異性miRNA對腫瘤干細胞的細胞特性起獨特而重要的調(diào)控作用[2-6]，包括對輻射耐受基因的調(diào)控作用。放射特異miRNA對腫瘤干細胞放射抗拒相關(guān)基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7-9]。放療是治療喉癌的重要方法，但喉癌細胞的放射抗拒仍是目前嚴重干擾療效的難題。本研究通過模擬放療照射喉癌干細胞，比較照射與未照射的喉癌干細胞的基因檢測結(jié)果，篩選出喉癌干細胞中2倍差異表達的miRNA,結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miGEN結(jié)果，確定擬調(diào)控的放射抗拒相關(guān)基因及miRNA，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 Anti-CD44-FITC、Anti-CD133-PE(美國e－Bioscience公司)，miRNA分離試劑盒 (美國Ambion公司)，miRNA芯片（丹麥Exiqon公司），重組表皮生長因子（EGF）、成纖維生長因子(bFGF)（美國PeproTech公司），流式細胞儀（美國BD公司）

1.2 方法

1.2.1 干細胞微球體分離培養(yǎng) 將Hep-2喉癌細胞株接種于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代。待細胞生長至80%瓶底面積時，用PBS液清洗，質(zhì)量濃度為2．5g/L的胰蛋白酶消化，吸管反復(fù)吹打制成單細胞懸液。離心除去終止消化時殘留的含血清培養(yǎng)基后重懸于無血清培養(yǎng)基中，無血清培養(yǎng)基為在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加EGF（20μg/L）和bFGF（10μg/L）、L-谷氨酰胺（2mmol/ L）、胰島素（4U/L）、青霉素G（1×105U/L）、鏈霉素（100mg/L）。臺盼藍染色、計數(shù)重懸成103/ml單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶直立、每日搖數(shù)次以利細胞懸浮生長，觀察微球形成，每2d在每個培養(yǎng)瓶中加入2ml新鮮無血清培養(yǎng)基，每6d傳代。喉癌細胞增殖形成細胞球4d后，Accutase消化、吹打成單細胞，洗滌后在SFM中傳代培養(yǎng)，以擴增和富集喉癌干細胞，按1∶4的比例傳代。

1.2.2 側(cè)群細胞檢測 選擇對數(shù)生長期細胞，細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞懸液密度至1×109/L。準備2支無菌干燥標準流式上樣管（5ml規(guī)格，聚丙烯材料），2管中分別加入上述細胞懸液1ml，再加入Hoechst33342溶液至終濃度為5mg/L（Hoechst33342組），同時在其中1支上樣管中加入維拉帕米溶液至終濃度50mg/L（Hoechst33342+維拉帕米組）。吹打均勻后 37℃恒溫水浴箱作用120min，期間每15min柔和晃動上樣管1次，混勻溶液使細胞充分染色。染色完成后4℃1 000r/min離心10min，棄上清液，加入4℃PBS吹洗1次，4℃1 000r/ min離心 10min，小心抽棄上清液，重懸于4℃含體積分數(shù)為2%FBS的PBS中。置于4℃環(huán)境中待上流式細胞儀檢測。

1.2.3 喉癌干細胞的篩選 當側(cè)群細胞比例達25%時，收集全部生長細胞球，制成單細胞PBS懸液100μl，計數(shù)細胞密度為1×107/ml。用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù)＞90%～95%。加入Anti-CD44-FITC和Anti-CD133-PE各5μl，4℃避光孵育30min。離心去上清液，PBS洗滌至少3次，1 500r/min，離心3min，200目細胞網(wǎng)篩過濾。加300μl PBS（pH=7.4），上流式細胞儀檢測。

1.2.4 喉癌干細胞的放射處理 采用模擬臨床非致死劑量對腫瘤干細胞進行放射處理：喉癌干細胞SFM懸液，調(diào)整細胞至1×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中。短期培養(yǎng)后，直線加速器對培養(yǎng)的細胞進行照射，條件為6MV X線垂直照射，劑量率為2Gy/min，照射時于培養(yǎng)板底部加入1.5cm組織等效填充物，源皮距100cm。照射5Gy/次，共3次，照射間隔72h。

1.2.5 差異miRNA的篩選 miRNA分離試劑盒富集和純化miRNA：總RNA和5倍體積的裂解/結(jié)合緩沖液相混合，加入1/10體積的miRNA勻漿添加劑，冰上孵育，加入1/3體積的無水乙醇，混勻后通過濾管。收集液體加入2/3體積的無水乙醇，混勻后95℃預(yù)熱后二次過濾。用牛腸堿性磷酸酯酶制備標記反應(yīng)物，用T4連接酶熒光標記miRNA并過柱純化。在熒光miRNA樣本中加入10×GE阻斷劑和2×HiRPM雜交緩沖液，并用雜交儀及其旋轉(zhuǎn)烘箱進行miRNA芯片雜交。結(jié)束后分別將芯片在GE緩沖液中清洗，Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號，挑選2倍差異表達miRNA并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 喉癌干細胞的誘導(dǎo)和富集 Hep-2喉癌細胞株接種后2～3h開始大部分細胞貼壁，第3～7天部分細胞開始懸浮并增生形成松散的串珠狀，另一部分細胞凋亡崩解，不能在無血清培養(yǎng)基中存活生長。第9天時，串珠狀細胞團分解、凋亡，但仍可見小部分細胞持續(xù)擴增形成細胞球，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可見不多的細胞球沉于培養(yǎng)瓶底部。球內(nèi)細胞折光性較好，連接緊密，不能準確區(qū)分細胞與細胞間的界限。新形成的腫瘤干細胞球不甚規(guī)則，新生單個細胞常以“出芽”的方式連接在球體上。Accutase消化、吹打成單細胞懸液后第l～2天單個細胞間相互聚集連接成“樹枝狀”懸浮于SFM中，第3～4天形成不規(guī)則細胞球，第5～6天逐漸形成規(guī)則球形。隨著傳代次數(shù)的增加，球體趨于圓形。見圖1。

圖1 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)喉癌細胞形成的細胞球（×200）

2.2 側(cè)群細胞的分選 Hoechst33342組側(cè)群細胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染色狀態(tài)，位于細胞流式圖的左下角熒光弱染區(qū)域。Hoechst33342+維拉帕米組中加維拉帕米，抑制了細胞轉(zhuǎn)運蛋白的功能，改變了側(cè)群細胞外排熒光染料的特性，使側(cè)群細胞的比例減少到（0.0±0.0）%，經(jīng)多次擴增和富集后成功使側(cè)群細胞達到26.2%。見圖2。

2.3 喉癌干細胞的篩選 采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞微球體，富集喉癌干細胞。流式細胞儀分別篩選出CD133+、CD44+喉癌干細胞。分選前喉癌細胞CD133+、CD44+的表達率均低于為3%，分選后均高于91%，分選后喉癌細胞HE染色可見細胞分布均勻，體積較大，呈梭形，細胞核與細胞質(zhì)的比例接近于1∶1，核大濃染，核仁大而突出，有病理性核分裂相，符合惡性腫瘤干細胞病理特點。見圖3、4。

圖2 側(cè)群細胞流式檢測圖（a:Hoechst33342組；b:Hoechst33342+維拉帕米組）

圖3 流式細胞儀篩選實體瘤來源的喉癌干細胞結(jié)果（a：CD44+細胞；b：CD133+細胞）

圖4 凋亡細胞流式檢測圖（a：喉癌干細胞；b：喉癌細胞）

2.4 差異miRNA的篩選結(jié)果 放療前后經(jīng)Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號，挑選2倍差異表達miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯升高2倍以上的miRNA有3條，而明顯降低達2倍以上的miRNA有15條，其名稱及序列見表1。

表1 2倍差異表達的miRNA

3 討論

HNSCC居于癌癥病死率的第6位，全世界每年新發(fā)病例50萬，過去幾十年治療HNSCC的主要方法是手術(shù)和放療。臨床證明放療對HNSCC有一定作用，但治療結(jié)果的進展有限，復(fù)發(fā)和治療失敗仍然有相當?shù)谋嚷省１菊n題組前期開展了一系列喉癌干細胞相關(guān)的研究：從Hep-2喉癌細胞株與人實體瘤組織中成功分離、鑒定并擴增了喉癌干細胞，構(gòu)建了喉癌干細胞裸鼠成瘤模型，在喉癌干細胞耐藥/輻射耐受機制方面取得了部分研究成果。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進一步從基因角度深入研究喉癌干細胞放射抗拒的機制。

miRNA作為一類廣泛存在的非蛋白編碼的小分子RNA，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達而參與調(diào)控一系列的生命活動，包括細胞增殖、生長發(fā)育、器官形成、造血、凋亡，甚至腫瘤發(fā)生。特異性miRNA在腫瘤干細胞的細胞特性方面起獨特而重要的調(diào)控作用，如對輻射耐受基因的調(diào)控作用?？梢酝茢?，放射特異的miRNA對腫瘤干細胞放射抗拒相關(guān)基因發(fā)揮著同樣調(diào)控作用?；谏鲜龇治觯狙芯繉χ苽涞哪M放療前后喉癌干細胞的純化miRNA雜交后經(jīng)Agilent芯片掃描儀掃描讀取雜交信號，挑選2倍差異表達miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯升高2倍以上的miRNA有3條，明顯降低2倍的有15條。國內(nèi)學(xué)者運用基因芯片技術(shù)對miRNA在喉癌組織與正常組織中表達譜的差異進行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13種miRNA在喉癌組織中的水平較正常組織有顯著差異；其中mir-let-7a、miR-203、miR-205、miR-21、miR-98和miR-16-1的表達水平在腫瘤組織中升高，miR-100、miR-l-2、miR-122a、miR-143、miR-145、miR-26a-1和miR-34c等7種miRNA在腫瘤組織中的表達水平降低。Amin等[10]對人類癌細胞多種miRNA在放射中的反應(yīng)作了研究，發(fā)現(xiàn)在人宮頸腺癌傳代細胞系中，miR-21和miR-17-5p隨著照射時間的延長，表達增加；在人結(jié)腸癌HCT1 16細胞中，照射后miR-21和miR-17-5p表達都增強，但在人乳腺癌SKBR3細胞和人前列腺癌PC3細胞中卻沒有發(fā)生此現(xiàn)象。這說明特異的miRNA表達水平在照射后發(fā)生的變化具有細胞特異性。但目前尚無喉癌干細胞放療前后的miRNA的表達差異研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的這些明顯差異的miRNA為喉癌干細胞放射抗拒相關(guān)的miRNA。這可能為解決喉癌放療抗拒難題，研發(fā)新型高效的放療增敏劑，提高放療療效提供重要基礎(chǔ)資料。

[1] 孫志剛,黃盛東,張寶仁.腫瘤干細胞研究現(xiàn)狀[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2008,29(4):443-9.

[2] Mueller D W,BosserhoffAK.Role of miRNAs in the progression of malignant melanoma[J].Br J Cancer,2009,101(4):551-6.

[3] Valeri N,Croce C M,Fabbri M.Pathogenetic and clinical relevance of microRNAs in colorectal cancer[J].Cancer Genomics Proteomics,2009,6(4):195-204.

[4] Schetter A J,Leung S Y,Sohn J J,et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA,2008,299(4):425-36.

[5] Avissar M,McClean M D,Kelsey K T,et al.MicroRNA expression in head and neck cancer associates with alcohol consumption and survival[J].Carcinogenesis,2009,30(12):2059-63.

[6] Hime G R,Somers WG.Micro-RNAmediated regulation ofproliferation,self-renewal and differentiation of mammalian stem cells [J].CellAdh Migr,2009,3(4):425-32.

[7] Yu F,Yao H,Zhu P,et al.Let-7 regulates selfrenewaland tumorigenicity ofbreast cancer cells[J].Cell,2007,131(6):1109-23.

[8] Silber J,Lim D A,Petritsch C,et al.MiR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation ofbrain tumor stem cells[J].BMC Medicine,2008,6(1):14.

[9] Friedman J M,Jones P A.MicroRNAs:critical mediators of differentiation,development and disease[J].Swiss Med Wkly,2009, 139(33-34):466-72.

[10] Amin R,Betsehinger J,Fischer A,et al.Mei-F26 regulates microRNAs and cellgrowth in the Drosophila oval'iluistem cell lineage[J].Nature,2008,454(7201):241-245.

Screening of radioresistance-related miRNA from laryngeal cancer stem cells

DUAN Guangliang,DAI Huiping,TANG Tingting,et al. Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou 310015,China

Objective To screen radioresistance-related miRNA from laryngeal cancer stem cells. Methods Laryngeal cancer Hep-2 cells were cultured in SFM containing growth factor,and cancer stem cells(CD133+CD44+)were detected and isolated with flow cytometry.The isolated laryngeal cancer stem cells were exposed to high energy X-ray.The differentially expressed miRNA(2-fold)were screened with miRNAbiologicalchips in irradiated and non-irradiated laryngealcancer stem cells. Results Overtop 91%CD133+CD44+cells were harvested by FACS.The miRNAs of2-fold differentialexpression were successfully screened from irradiated stem cells. Conclusion Laryngeal cancer stem cells have been isolated from Hep-2 cells,and miRNAs related to radioresistance have been screened from laryngealcancerstem cells.

SFM miRNA Side population Radiotherapy

2015-06-29）

（本文編輯：李媚）

2012年杭州市科技計劃引導(dǎo)項目[杭科計（2012）259號（17）]

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤診治中心

段廣亮，E-mail:dglzx333@163.com