周珍 倪海峰 周榮璟 湯建國 李勇 江波

糖皮質(zhì)激素受體蛋白在OSAHS患兒腺樣體和扁桃體中的表達(dá)及臨床意義

周珍 倪海峰 周榮璟 湯建國 李勇 江波

目的 探討阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）患兒腺樣體及扁桃體組織中糖皮質(zhì)激素受體（GR）α和β蛋白的表達(dá)情況及臨床意義。方法 收集103例中重度OSAHS患兒的腺樣體組織，69例中重度OSAHS患兒的扁桃體組織，20例成人慢性鼻咽炎鼻咽部組織，13例成人慢性扁桃體炎扁桃體組織，應(yīng)用免疫組化SP法檢測腺樣體、扁桃體和鼻咽部組織中GRα和GRβ蛋白的表達(dá)情況，并作比較分析。結(jié)果 所有的腺樣體、扁桃體、鼻咽部組織中均存在不同程度的GRα和GRβ蛋白表達(dá)，在腺樣體組織中GRα呈高表達(dá)，在扁桃體、鼻咽部組織中GRβ呈高表達(dá)。在伴或不伴過敏性鼻炎，伴或不伴慢性鼻竇炎，伴或不伴分泌性中耳炎的OSAHS患兒間比較，其腺樣體和扁桃體組織中GRα、GRβ蛋白表達(dá)及GRα/GRβ均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。中、重度OSAHS患兒間比較，腺樣體、扁桃體組織GRα、GRβ蛋白表達(dá)及GRα/GRβ均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。Ⅱ、Ⅲ度扁桃體肥大的OSAHS患兒間比較，扁桃體組織GRα、GRβ蛋白表達(dá)及GRα/GRβ均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。結(jié)論 OSAHS患兒的腺樣體組織對糖皮質(zhì)激素（GC）的敏感性優(yōu)于扁桃體組織，不同缺氧嚴(yán)重程度患兒間比較，激素受體表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，GC在OSAHS患兒的作用有待深入研究。

糖皮質(zhì)激素受體 腺樣體 扁桃體 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征

兒童阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）的主要原因是扁桃體、腺樣體肥大引起上、中氣道阻塞，造成通氣不暢，從而引起睡眠打鼾、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、低氧血癥等，進(jìn)一步危害包括導(dǎo)致患兒生長發(fā)育遲緩、認(rèn)知行為異常、心臟改變及肺動脈高壓等[1]。該病變常合并過敏性鼻炎、分泌性中耳炎、慢性鼻竇炎等疾病[2]，造成疾病反復(fù)遷延，惡性循環(huán)，給臨床治療帶來巨大困難。目前臨床上對于OSAHS患兒的首選治療方法仍為扁桃體、腺樣體切除術(shù)[3]，但手術(shù)存在創(chuàng)傷，且部分患兒術(shù)后睡眠呼吸紊亂癥狀仍無法完全改善[4]，故保守治療成為另外一種選擇。

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids,GC）通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)而發(fā)揮效應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，而GR在兒童的腺樣體、扁桃體以及鼻腔黏膜中均存在特異性表達(dá)。本研究通過免疫組化檢測中重度OSAHS患兒腺樣體和扁桃體組織中GRα和GRβ蛋白表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料進(jìn)行綜合分析，為GC治療兒童中重度OSAHS的可行性提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2013年9月至2014年5月杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院行手術(shù)治療的OSAHS患兒腺樣體切除標(biāo)本103例，其中男66例，女37例；年齡3～12歲，中位年齡6.03歲；中度OSAHS 48例，重度OSAHS 55例。伴過敏性鼻炎（經(jīng)變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺或血清特異性IgE檢測陽性）22例，伴慢性鼻竇炎（經(jīng)鼻竇CT檢查證實(shí)）56例，伴分泌性中耳炎（經(jīng)聲導(dǎo)抗及術(shù)中耳內(nèi)鏡檢查證實(shí)）38例。OSAHS的診斷和病情程度分級依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉科學(xué)分會2007年制定的烏魯木齊草案進(jìn)行[5]。收集同時期杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院行手術(shù)治療的OSAHS患兒扁桃體切除標(biāo)本69例，其中男35例，女34例；年齡3～15歲，中位年齡6.35歲；中度OSAHS 30例，重度OSAHS 39例。伴過敏性鼻炎的患兒13例，伴慢性鼻竇炎36例，同時伴過敏性鼻炎和慢性鼻竇炎10例；伴分泌性中耳炎15例；Ⅱ度扁桃體肥大34例，Ⅲ度扁桃體肥大35例。以上兩組OSAHS患兒的年齡、性別構(gòu)成、癥狀嚴(yán)重程度以及合并癥情況均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。收集同時期浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院行手術(shù)治療的成人慢性扁桃體炎患者扁桃體組織標(biāo)本13例，其中男7例，女6例；年齡16～74歲，中位年齡33.69歲。收集同時期杭州市腫瘤醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院行手術(shù)治療的成人慢性鼻咽炎患者鼻咽部組織標(biāo)本20例，其中男11例，女9例；年齡19～36歲，中位年齡26.53歲。

所有入選者術(shù)前2周內(nèi)均未接受局部或全身GC治療。所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實(shí)，并得到了患者本人或監(jiān)護(hù)人及3家醫(yī)院倫理學(xué)委員會的同意。所有標(biāo)本采集前均與患者本人或監(jiān)護(hù)人簽定知情同意書。標(biāo)本切除后立即放置10%甲醛溶液中固定備用。

1.2 試劑和方法

1.2.1 試劑 兔抗人GR多克隆抗體α和鼠抗人GR單克隆抗體β為英國Aabcam公司產(chǎn)品，即用型免疫組化ElivisionTMSP試劑盒購自福州Maixin-Bio公司。

1.2.2 方法 石蠟包埋標(biāo)本作3μm連續(xù)切片，每份標(biāo)本分別行GRα和GRβ免疫組化染色及常規(guī)HE染色。本實(shí)驗(yàn)采用PBS（濃度0.01mol/L）代替一抗作為陰性對照；陽性對照選用經(jīng)陽性染色的正常小腸組織。采用免疫組化SP法檢測GRα和GRβ的蛋白表達(dá)。

1.2.3 結(jié)果判斷與圖形分析 采用Olympus顯微鏡觀察切片組織HE染色情況，用Image-Pro圖像分析軟件進(jìn)行分析。免疫組化染色后，高倍光學(xué)顯微鏡下（×200）細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)淺黃色至棕褐色陽性染色顆粒者為陽性細(xì)胞。每例標(biāo)本各取3張切片，每張切片在鏡下選取陽性細(xì)胞最為密集的5個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并取15個細(xì)胞的平均值用以統(tǒng)計學(xué)分析[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)和四分位間距表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 OSAHS患兒腺樣體組織與成人慢性鼻咽炎患者鼻咽部組織GR蛋白表達(dá)比較 OSAHS患兒腺樣體組織中的GRα、GRα/GRβ蛋白表達(dá)顯著高于成人鼻咽部組織，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.01），而GRβ蛋白在OSAHS患兒腺樣體組織和成人鼻咽部組織中表達(dá)相當(dāng)，比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖1和表1。

2.2 OSAHS患兒扁桃體組織與成人慢性扁桃體炎患者扁桃體組織GR蛋白表達(dá)比較 OSAHS患兒扁桃體組織中GRα、GRα/GRβ蛋白表達(dá)較成人扁桃體組織高，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.01），而GRβ蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖2和表2。

2.3 不同合并癥的OSAHS患兒腺樣體和扁桃體組織中GR蛋白表達(dá)比較 在伴或不伴過敏性鼻炎，伴或不伴慢性鼻竇炎，伴或不伴分泌性中耳炎的中重度OS－AHS患兒間比較，其腺樣體和扁桃體組織中GRα、GRβ蛋白表達(dá)及GRα/GRβ均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。中、重度OSAHS患兒間比較，腺樣體、扁桃體組織GRα、GRβ蛋白表達(dá)及GRα/GRβ均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。Ⅱ、Ⅲ度扁桃體肥大的OSAHS患兒間比較，扁桃體組織GRα、GRβ蛋白表達(dá)及GRα/GRβ均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表3～4。

圖1 OSAH S患兒腺樣體及成人慢性鼻咽炎鼻咽部組織中GR蛋白表達(dá)（A：患兒腺樣體組織GRα蛋白表達(dá)，可見柱狀上皮全層細(xì)胞及淋巴細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；B：成人鼻咽部組織GRα蛋白表達(dá)，可見柱狀上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；C：患兒腺樣體組織GRβ蛋白表達(dá)，可見柱狀上皮全層細(xì)胞及大量淋巴細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；D：成人鼻咽部組織GRβ蛋白表達(dá)，可見柱狀上皮全層細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；免疫組化SP染色，×200）

表1 OSAH S患兒腺樣體組織與成人慢性鼻咽炎患者鼻咽部組織GR蛋白表達(dá)比較

圖2 OSAH S患兒扁桃體及成人慢性扁桃體炎扁桃體組織中GR蛋白表達(dá)（A：患兒扁桃體組織GRα蛋白表達(dá)，可見鱗狀上皮表層細(xì)胞及淋巴細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；B：成人扁桃體組織GRα蛋白表達(dá)，可見鱗狀上皮細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒和淋巴細(xì)胞胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；C：患兒扁桃體組織GRβ蛋白表達(dá)，可見鱗狀上皮細(xì)胞全層及大量淋巴細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；D：成人扁桃體組織GRβ蛋白表達(dá)，可見鱗狀上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞部分胞核及胞質(zhì)中的棕黃色顆粒；免疫組化SP染色，×200）

表2 OSAH S患兒扁桃體組織與成人慢性扁桃體炎患者扁桃體組織GR蛋白表達(dá)比較

3 討論

GR主要有兩種亞型：GRα和GRβ，其中GRα屬于功能型，GRβ是GC的內(nèi)源性抑制劑。研究報道炎性細(xì)胞因子可顯著上調(diào)GRβ的表達(dá)，但對GRα的表達(dá)卻無明顯影響[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GC可使炎癥因子濃度降低、抑制腺樣體和扁桃體細(xì)胞增殖、并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]，這為臨床上GC治療OSAHS患兒提供了理論依據(jù)。國內(nèi)外學(xué)者在臨床上也進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證工作，結(jié)果證實(shí)使用GC鼻噴劑可降低輕度OSAHS患兒的呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI），提升最低血氧飽和度，并有助于改善鼻塞、打鼾等癥狀，能縮小腺樣體體積，但扁桃體體積改變不明顯[10-12]。

那么GC改善OSAHS患兒癥狀的進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)是什么呢？Goldbart等[13]研究發(fā)現(xiàn)在扁桃體和腺樣體中GRα的mRNA表達(dá)較高；而GRβ的mRNA表達(dá)則無統(tǒng)計學(xué)意義。張孝文等[14]研究發(fā)現(xiàn)兒童腺樣體組織中均存在GRα和GRβ的mRNA表達(dá)，且GRα的mRNA呈高表達(dá)。然而既往針對OSAHS患兒中GR的研究以GR的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)為主，蛋白表達(dá)較少見，研究的樣本量均偏小，而且研究多局限于輕度OSAHS患兒，對于中、重度OSAHS患兒尚未見相關(guān)研究報道。

表3 不同合并癥的OSAH S患兒腺樣體組織中GR蛋白表達(dá)比較

表4 不同合并癥的OSAH S患兒扁桃體組織中GR蛋白表達(dá)比較

因非OSAHS兒童的扁桃體和腺樣體標(biāo)本難以取得，故以成人慢性扁桃體炎扁桃體標(biāo)本及成人慢性鼻咽炎鼻咽部組織標(biāo)本作為相應(yīng)對照。本研究發(fā)現(xiàn)，GRα、GRα/GRβ在OSAHS患兒腺樣體組織的表達(dá)均顯著高于成人鼻咽部組織，而GRβ蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。GRα、GRα/GRβ在OSAHS患兒扁桃體組織的表達(dá)均顯著高于成人慢性扁桃體炎扁桃體組織，而GRβ蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。在腺樣體組織中以GRα高表達(dá)為主，與Goldbart等[13]和張孝文等[14]的研究結(jié)果一致，而在扁桃體組織中以GRβ高表達(dá)為主，與上述研究結(jié)果相反，分析其原因可能與下面因素有關(guān)：本研究對象為中、重度OSAHS患兒的GR蛋白表達(dá)水平，而上述兩研究的對象為輕度OSAHS患兒GR的mRNA表達(dá)，中、重度OSAHS患兒長期嚴(yán)重缺氧可導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子持續(xù)表達(dá)，后者可顯著上調(diào)GRβ的表達(dá)[8]，這種調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平，還有待進(jìn)一步檢測中、重度OSAH S患兒GR的m RNA表達(dá)情況來證實(shí)。

現(xiàn)有研究證實(shí)，GRα表達(dá)水平越高，患者對GC治療越敏感，GRβ表達(dá)水平越高，對GC治療抵抗越強(qiáng)、越容易發(fā)生耐受，因此根據(jù)本研究結(jié)果可以初步推斷OSAH S患兒腺樣體對GC可能更敏感，而扁桃體則可能更耐受，以腺樣體肥大為主的中、重度OSAH S患兒對GC治療會相對敏感，建議可以考慮先GC鼻噴劑保守治療，如效果不佳再選擇手術(shù)治療；而以扁桃體肥大為主的中、重度OSAH S患兒對GC治療會相對抵抗，建議盡早考慮手術(shù)治療。

本研究還發(fā)現(xiàn)，合并過敏性鼻炎、鼻竇炎、分泌性中耳炎等炎癥性疾病并不影響GR表達(dá)，這和Puj ol s等[7]報道炎性細(xì)胞因子對GRα的表達(dá)無明顯影響結(jié)果一致，卻似乎和其報道的炎性細(xì)胞因子可顯著上調(diào)GRβ的表達(dá)相駁[8]，推測可能因腺樣體和扁桃體組織自身內(nèi)在的炎癥，而非合并外在炎癥刺激影響GRβ表達(dá)，外在炎癥則可能主要調(diào)節(jié)GR對GC的敏感性。這和臨床部分患者在過敏性鼻炎、慢性鼻竇炎、分泌性中耳炎病情控制后睡眠打鼾及張口呼吸癥狀仍然沒有明顯改善相符，因此對于合并炎癥性疾病，且以腺樣體肥大為主的中、重度OSAH S患兒，建議考慮控制炎癥性疾病后再繼續(xù)GC鼻噴劑保守治療，如效果不佳再選擇手術(shù)治療；而以扁桃體肥大為主的OSAH S患兒建議盡早手術(shù)治療后再控制炎癥性疾病，可能效果更佳。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同扁桃體肥大及癥狀嚴(yán)重程度的患兒間比較，GR蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異，這和張孝文等[14]報道的研究結(jié)果一致。張孝文等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)非OSAH S兒童腺樣體GRα的m RNA表達(dá)明顯高于OSAH S患兒，因此對于中重度OSAH S患兒GC鼻噴劑治療是否有效，有待進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，而GC在OSAH S患兒中的作用也有待深入研究。

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（本文編輯：胥昀）

《浙江醫(yī)學(xué)》對醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及實(shí)驗(yàn)動物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強(qiáng)調(diào)來源，（3）遺傳背景，（4）微生物學(xué)質(zhì)量，（5）明確等級，（6）明確飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，（7）明確性別，（8）有無質(zhì)量合格證，（9）有對飼養(yǎng)的描述（如飼料型、營養(yǎng)水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動物數(shù)量準(zhǔn)確，（11）詳細(xì)描述動物的健康狀況，（12）對動物實(shí)驗(yàn)的處理方式有單獨(dú)清楚的交代，（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

The protein expression of glucocorticoid receptor(GR)in adenoid and tonsil and its clinical significance

ZHOU Zhen,NI Haifeng, ZHOU Rongjing,et al.Department of Otolaryngology and Head Surgery,Hangzhou Cancer Hospital,Hangzhou 310002,China

Objective The aim ofthis study to determine the protein expression ofglucocorticoid receptors(GR)α and β in tonsil and adenoid tissues of the children. Methods Tissues were collected from patients (103 cases of adenoid tissue of children with moderate and severe OSAHS and 69 cases tonsil tissue of children with moderate and severe OSAHS,as well as 13 cases of tonsil tissue of adult with chronic tonsillitis and 20 cases of nasopharyngeal mucous membrane with chronic pharyngitis), which were analyzed with immunohistochemcalSP method to detect the protein expression ofglucocorticoid receptors(GR)α and β. Results The protein expression in different degrees of GRα and GRβ in the tissues of adenoid,tonsil and nasopharyngeal mucous membrane were observed.GRα showed a high expression in adenoid tissue,and GRβ showed a high expression in tonsil and nasopharyngeal tissues.No significant difference(P＞0.05)was showed between expression of GRα,GRβ and GRα/GRβ in tissues of adenoid and tonsil of children with OSAHS and that in tissues of adenoid and tonsil of children with OSAHS(with or without allergic rhinitis,with or without chronic rhinosinositis,as wellas with or without secretory otitis media).Also no significant difference(P＞0.05)was found in expression ofGRα,GRβ and GRα/GRβ between tissues ofadenoid ofchildren with moderate OSAHS and that of adenoid of children with severe OSAHS,and no significant difference(P＞0.05)was found in expression ofGRα,GRβ and GRα/GRβ between tissues ofⅡ,Ⅲtonsil hypertrophyl of children with OSAHS.Conclusion The adenoid tissues of children with OSAHS sensitivity to glucocorticoid (GC)is superior to the tonsil tissues,severity of hypoxia and the expression of hormone receptors in children with no statistical difference,So the effect of glucocorticoid treatment of adenoid-hypertrophy ofchildren be worthy ofbeing further studied.

Glucocorticoid receptor(GR)Adenoid TonsilObstructive sleep apnea hypopnea syndrome(OSAHS)

2015-10-26）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃項(xiàng)目（2015KY B294）

310002 杭州市腫瘤醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（周珍），病理科（周榮璟）；杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（倪海峰、李勇、江波）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（湯建國）

湯建國，E-m ai l：t angj g2006@al i yun.com