何培新，李芳莉，胡曉龍，李學思，鄭　燕

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南鹿邑477265）

濃香型白酒窖泥可培養(yǎng)好氧細菌群落結(jié)構(gòu)分析

何培新1，李芳莉1，胡曉龍1，李學思2，鄭燕1

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南鹿邑477265）

采用稀釋涂布法分離了濃香型白酒窖池窖泥中的好氧細菌，并利用形態(tài)學特征結(jié)合16S rRNA基因序列分析技術對分離的細菌進行鑒定，探討窖泥可培養(yǎng)好氧細菌的群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，根據(jù)菌落和細胞形態(tài)特征，分離到了1株無芽孢短桿菌和18株芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性；采用16S rRNA基因序列分析，將19株細菌鑒定為9個種：米氏解硫胺素芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、菠茨坦短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、Paenibacilluslautus、耐寒短桿菌和P.cellulositrophicus；其中波茨坦短芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P.lautus鮮有濃香型白酒窖泥中分布的報道。本研究揭示了濃香型白酒窖泥可培養(yǎng)好氧細菌的群落結(jié)構(gòu)，為改善窖泥質(zhì)量、提高白酒品質(zhì)等提供了理論依據(jù)。

濃香型白酒； 窖泥； 好氧細菌； 16S rRNA基因

濃香型白酒以固態(tài)窖池發(fā)酵為特征，窖池中的窖泥為發(fā)酵微生物的生長繁殖提供了良好環(huán)境[1-2]。窖泥微生物群落對白酒的品質(zhì)及特征香型的形成具有重要的影響。參與形成白酒香味成分的細菌主要有己酸菌、乳酸菌、甲烷菌和硫酸鹽還原菌等，以芽孢桿菌為主[3-5]。由于研究技術手段的限制，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學和生理生化特征鑒定分離到的窖泥細菌，不僅費時費力，還難得到準確的結(jié)果[6-8]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，傳統(tǒng)形態(tài)學特征結(jié)合16S rRNA基因序列分析技術顯著促進了微生物的分類與鑒定[9]，并廣泛應用于窖泥微生物的相關研究[1，10-11]。本研究以河南省宋河酒業(yè)10年窖齡窖池的窖泥為研究對象，采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術分離其中的好氧細菌，并通過形態(tài)學特征結(jié)合16S rRNA基因序列分析技術，對分離到的菌株進行鑒定，初步分析濃香型白酒窖泥中可培養(yǎng)細菌的群落結(jié)構(gòu)，對改善窖泥質(zhì)量、提高白酒品質(zhì)等具有一定的理論意義。

1　材料與方法

1.1窖泥樣品采集

以5點取樣法采集河南省宋河酒業(yè)股份有限公司10年窖齡的窖池窖泥樣品，混勻后迅速密封，置于冰上運輸至實驗室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2窖泥細菌分離培養(yǎng)與初步鑒定

稱取10g窖泥樣品，加入到裝有90m L無菌水的錐形瓶中，25℃、120 r/m in振蕩30m in，然后放到潔凈工作臺靜置30m in。在超凈工作臺中，用無菌注射器將過濾除菌的制霉菌素加入到融化并冷卻至50℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂20g，蒸餾水1000m L，pH 7.4～7.6）中，搖勻后制作平板。窖泥樣品10倍系列稀釋到105倍，取各稀釋度的樣品懸浮液0.2m L涂布在牛肉膏蛋白胨含藥平板上，每個稀釋度涂3個樣，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。計數(shù)細菌菌落數(shù)在30～300個的稀釋度平板，取平均數(shù)計算得細菌總數(shù)和各種細菌的含量。對各種不同特征的菌落進行劃線純化，得到多個細菌菌株。采用普通光學顯微鏡觀察各菌株的菌體形態(tài)，并進行革蘭氏染色試驗[12-14]。

1.3細菌基因組DNA提取

采用Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）提取細菌的基因組DNA。

1.416S rRNA基因擴增

利用16S rRNA基因通用引物515F-GTGCCAGCMGCCGCGG和907R-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT進行PCR擴增[15]。PCR擴增體系如下：1μL引物515F（10μM），1μL引物907R（10μM），0.15μL taq酶（5 U/μL），2.5μL 10×buffer，4μL dNTP(各2.5mM)，1μLDNA模板，加無菌水補足至25μL。PCR擴增反應條件如下：94℃預變性5.0 min；94℃變性45 s，55℃復性45 s，72℃延伸1.0m in，30個循環(huán)；最后72℃充分延伸10m in。利用1%瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.5克隆、測序及序列分析

利用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工）回收目的片段（約450 bp），利用pGEM-T載體試劑盒（北京全式金）克隆目的片段，利用M 13F/M 13R引物篩選出含有目的片段的克隆，送公司測序（上海生工）。

將測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，選擇相關同源序列與分離菌株序列利用Mega 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析[15]。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株分離與初步鑒定

結(jié)果表明，窖泥中的細菌總數(shù)為3.2×104cfu/g窖泥。根據(jù)菌落形態(tài)，共分離到19株代表性菌株（編號O2.1—O2.19）。各分離菌株的含量見表1。鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，除O2.18為無芽孢的短桿菌以外，其他18株細菌均為產(chǎn)芽孢桿狀細菌；革蘭氏染色結(jié)果均為陽性。

2.2分離細菌的16S rRNA基因擴增

細菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測可見明顯的DNA條帶，無明顯拖帶現(xiàn)象，完整性較好（圖1）。

圖1　分離細菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

利用16S rRNA基因通用引物515F/907R進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測表明擴增產(chǎn)物長度約450 bp，與預期片段長度一致（圖2）；陰性對照泳道無電泳條帶（圖2b），表明擴增體系未受污染。電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物可以用于后續(xù)克隆、測序等分子生物學操作。

圖2　PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

在BLAST比對分析的基礎上，對19株窖泥細菌的16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，除O2.18以外，窖泥中分離出來的其他細菌都是芽孢桿菌，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。在屬分類水平上，O2.4、O2.10、O2.15屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）；O2.9和O2.11屬于短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）；O2.17和O2.19屬于類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）；O2.1屬于解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）；O2.18屬于短桿菌屬（Brevibacterium）（圖3）。在種水平上，O2.1為米氏解硫胺素芽孢桿菌（A. migulanus），O2.4為枯草芽孢桿菌（Ba.subtilis），O2.9為菠茨坦短芽孢桿菌（Br.borstelensis），O2.10為地衣芽孢桿菌（Ba.licheniformis），O2.11為側(cè)孢短芽孢桿菌（Br. laterosporus），O2.15為短小芽孢桿菌（Ba.pumilus），O2.17為P.lautus，O2.18為耐寒短桿菌（Brevibacteriumfrigoritolerans），O2.19為P.cellulositrophicus（圖3）。分離菌株與基因庫相關菌株的16S rRNA基因序列的相似度均超過99%（表1）。

19株分離細菌的含量見表1。從表1可以看出，除O2.18不產(chǎn)芽孢（屬于短桿菌屬）以外，其他分離菌株均為產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，其中以米氏解硫胺素芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的含量相對較高，分別占可培養(yǎng)細菌總數(shù)的26.3%和21.2%。

3　討論

本研究表明，采用16S rRNA基因序列分析的方法鑒定濃香型白酒窖泥中的細菌種類，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，能夠快速地把分離到的細菌鑒定到屬或種的水平，實用性較強。該技術應用于濃香型白酒窖泥微生物鑒定的研究報道較多。趙輝等[1]采用微生物生理生化特征結(jié)合16S rRNA基因序列分析鑒定了濃香型白酒窖泥中高產(chǎn)己酸兼性厭氧細菌；葉光斌等[18]通過細菌和古菌的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了濃香型白酒成熟窖泥中細菌和古菌的群落組成；鄭琦等[4]采用16S rRNA基因序列分析鑒定了瀘州老窖300年窖池窖泥中的微生物群系，將23株產(chǎn)芽孢細菌鑒定為3種芽孢桿菌屬的種類。

表1　分離細菌的BLAST比對同源性及在窖泥中的含量

圖3　窖泥分離細菌的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究分離到的濃香型白酒窖泥中的好氧細菌大多為產(chǎn)芽孢的細菌，其中米氏解硫胺素芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的含量較高，分別占可培養(yǎng)細菌總數(shù)量26.3%和21.2%，與游劍等[19]的研究結(jié)果一致；而分離到的波茨坦短芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P.lautus等在以往的報到中鮮有出現(xiàn)。芽孢細菌成為濃香型白酒窖泥中的優(yōu)勢微生物群系，可能與窖泥的高酒精度和低含氧量有關。相對于其他非芽孢細菌，產(chǎn)芽孢的細菌能在這種相對惡劣的環(huán)境條件下大量生長繁殖，從而逐漸占優(yōu)勢地位[2，11，20-22]。此外，在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，芽孢細菌能水解淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，并利用糟醅浸潤到窖泥中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生丁酸和己酸等有機酸，是重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌[2，20]。吳文睿等[23]以古井貢酒（濃香型白酒）的窖泥樣品為研究對象，研究不同芽孢桿菌對白酒風味成分的影響。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌的發(fā)酵液中含有大量3-羥基-2-丁酮和2, 3-丁二醇；3-羥基-2-丁酮具有特有的奶油香味，是酒液中的一種重要芳香成分，可用于合成2,3,5,6-四甲基吡嗪，賦予酒濃厚的風味；2,3-丁二醇是白酒中重要的多元醇之一，是主要甜味芳香物質(zhì)，能使酒醇厚綿甜，有自然感；短小芽孢桿菌產(chǎn)己酸乙酯量、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的量較大，其在濃香型白酒的風味和口感方面起著重要作用。這些研究結(jié)果表明，芽孢桿菌的含量通常作為濃香型白酒窖泥質(zhì)量評價的重要指標之一，其功能特性影響白酒品質(zhì)，特別是對白酒生香更為重要，在白酒發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用。

濃香型白酒是我國市場上主要的白酒類型，銷量占中國白酒市場份額的70%左右。窖池作為濃香型白酒的發(fā)酵容器，其中的窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)中扮演了比較重要的角色。本研究以濃香型白酒生產(chǎn)廠家宋河酒業(yè)的10年窖齡窖池的窖泥為研究對象，采用傳統(tǒng)的稀釋涂布法分離窖泥中的好氧細菌，并采用形態(tài)特征結(jié)合16S rRNA基因序列分析技術對菌株進行鑒定。研究結(jié)果表明，分離得到的19株細菌主要為產(chǎn)芽孢的細菌，分別屬于9個不同的種，其中分離到的波茨坦短芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P.lautus等在以往的報到中鮮有出現(xiàn)。本研究為揭示窖泥中可培養(yǎng)好氧細菌的群落結(jié)構(gòu)，充分發(fā)揮有益微生物正常代謝活動，強化白酒中主體風味物質(zhì)，提高酒類品質(zhì)等提供科學依據(jù)。

[1]趙輝,王藏,凌宏志,等.濃香型白酒窖泥中高產(chǎn)己酸兼性厭氧細菌的分離鑒定[J].食品科學,2012,33(5)：177-179.

[2]岳元媛,張文學,劉霞,等.濃香型白酒窖泥中兼性厭氧細菌的分離鑒定[J].微生物學通報,2007,34(2)：251-255.

[3]胡承,應鴻,許德富,等.窖泥微生物群落的研究及其應用[J].釀酒科技,2013(6)：34-38.

[4]鄭琦,章秋萍,何新新,等.濃香型白酒老窖泥中好氧芽孢桿菌的分離及系統(tǒng)發(fā)育樹的初步構(gòu)建[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2014,22(11)：1411-1417.

[5]吳衍庸,薛堂榮,陳昭蓉,等.五糧液老窖厭氧菌群的分布及其作用的研究[J].微生物學報,1991,31(4)：299-307.

[6]吳衍庸,易慶偉.窖泥己酸菌分離特性及產(chǎn)酸條件研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1986(5)：1-6.

[7]王贊,李光輝,羅惠波.濃香型白酒窖泥厭氧細菌的分離鑒定[J].四川理工學院學報(自然科學版),2014,27(1)：16-18.

[8]曹文濤,廖忠明.窖泥中己酸菌的分離純化及產(chǎn)酸的初步研究[J].釀酒科技,2001(4)：42-43.

[9]王曉丹,謝曉莉,胡寶東,等.現(xiàn)代微生物分類鑒定技術在白酒釀造中的應用[J].中國釀造,2015,34(7)：5-7.

[10]王濤,田時平,趙東,等.宜賓濃香型白酒窖泥中細菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(10)：11-17

[11] 張霞,武志芳,張勝潮,等.貴州濃香型白酒窖池可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育分析[J].釀酒科技,2010(12)：23-28.

[12]施思,王海英,張文學,等.濃香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析[J].釀酒科技,2011(5)：38-41.

[13]沈萍.微生物學實驗[M].3版.北京：高等教育出版社,1996.

[14] 布坎南,吉木斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社,1984.

[15]XiaWW,Zhang C X,Zeng XW,etal.Autotrophicgrow th of nitrifying community in an agriculturalsoil[J].The ISME Journal,2011.5：1226-1236.

[16]葉光斌,羅惠波,楊曉東,等.基于免培養(yǎng)法研究瀘州地區(qū)濃香型白酒窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)[J].食品科學,2013,34(17)：176-181.

[17]游劍,陳茂彬,方尚玲,等.枝江大曲酒大曲和窖泥中優(yōu)勢菌的分離與初步鑒定[J].釀酒科技,2009(3)：31-34.

[18]侯小歌,王俊英,李學思,等.濃香型白酒糟酷及窖泥產(chǎn)香功能菌的研究進展[J].微生物學通報,2013,40(7)：1257-1265.

[19]王濤,趙東田,時平,等.宜賓濃香型白酒釀造過程中可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[J].微生物學報,2011,51(10)：1351-1356.

[20]侯小歌,王俊英,李學思,等.濃香型白酒窖池主要功能性微生物的研究進展[J].釀酒科技,2013(2)：96-103.

[21]吳文睿,李安軍,湯有宏,等.古井貢酒窖泥中芽孢桿菌發(fā)酵風味的研究[J].食品科技,2016,41(3)：27-30

Analysisof the Community Structureof Aerobic Bacteria in PitM ud of Nongxiang Baijiu

HEPeixin1,LIFangli1,HU Xiaolong1,LIXuesi2and ZHENGYan1
(1.Schoolof Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou,He'nan 450001; 2.Songhe Distillery Co.Ltd.,Luyi,He'nan 477265,China)

s:In the experiment,aerobic bacteria in pitmud of Nongxiang Baijiu were isolated by dilution platingmethod,and then identified by morphological characteristics coupled w ith sequence analysis of 16S rRNAgene.The results indicated that,one strain of non spore-producing short rod-shaped bacterium and 18 strains of spore producinggram-positive bacteriawere isolated,and those 19 strainswere identified as 9 species by 16S rRNAgene sequencing analysis,including Aneurinibacillusmigulanus,Bacillus subtilis,Brevibacillus borstelensis,Ba.licheniformis,Br.laterosporus,Ba.pumilus,Paenibacillus lautus,Brevibacterium frigoritolerans and P.cellulositrophicus.Among them,the distribution of Br.Borstelensis,A.migulanus and P.Lautus in pitmud of Nongxiang Baijiu were seldom reported.This study revealed the community structure of aerobic bacteria in pitmud of Nongxiang Baijiu,and provided theoreticalevidence for improving pitmud quality and improving liquorquality.

Nongxiang Baijiu;pitmud;aerobic bacteria;16S rRNAgene

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0065-04

10.13746/j.njkj.2016262

2016-08-29

何培新（1970-），博士，教授，主要從事發(fā)酵工程研究。

鄭燕（1986-），博士，主要從事釀造酒工程研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1519.019.htm l。