鐘其頂，王道兵，張　倩，謝正敏，陳　林，熊正河，肖冬光

（1.五糧液股份有限公司博士后工作站,四川宜賓644000； 2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京100027； 3.天津科技大學,天津300457)

液相色譜-同位素比值質譜測定白酒中乙醇的碳同位素比值

鐘其頂1，2，3，王道兵2，張倩1，謝正敏1，陳林1，熊正河2，肖冬光3

（1.五糧液股份有限公司博士后工作站,四川宜賓644000； 2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京100027； 3.天津科技大學,天津300457)

特定化合物穩(wěn)定同位素分析是近年來研究的重點，基于液相色譜-同位素比值質譜（LC-IRMS）技術建立了白酒中乙醇δ13C值的測定方法。分析了白酒揮發(fā)性組分對乙醇δ13C值測定的干擾，研究了流動相流速和色譜柱溫度對白酒中乙醇分離及對δ13C值測定的影響，優(yōu)化后的色譜條件為流速0.35m L/min，柱溫30℃，樣品中乙醇濃度范圍為0.14～1.08g/L。方法的重復性和再現(xiàn)性標準偏差均優(yōu)于0.09‰（n=10）。用該法和氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜技術同時測定10個白酒樣品，兩種方法的測定結果具有顯著相關性關系（R2=0.999）。該法操作簡單，檢測限可低至0.14g/L，且結果更穩(wěn)定、準確。

液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質譜； 穩(wěn)定碳同位素組成（δ13C）； 乙醇； 白酒

中國傳統(tǒng)白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一，具有深厚的歷史文化底蘊，是滿足人們不斷進步的物質文化和精神文化需求不可或缺的傳統(tǒng)飲品。傳統(tǒng)白酒一直以高端品質的形象示人，但近年來市場上卻出現(xiàn)了廉價白酒冒充傳統(tǒng)白酒的現(xiàn)象，這種造假行為不僅侵犯了消費者權益，也影響了傳統(tǒng)固態(tài)釀造白酒行業(yè)的正常有序發(fā)展。因此，開發(fā)有效、靈敏的中國傳統(tǒng)白酒真?zhèn)舞b別及摻假檢測方法顯得極為迫切。

穩(wěn)定同位素比值質譜技術在食品真?zhèn)舞b別和摻雜檢測中具有重要應用價值，目前已逐漸成為國際上用于確定食品真?zhèn)渭皺z測食品成分摻假的一種直接而有效的手段[1-3]。為推動我國白酒產業(yè)健康、持久發(fā)展，中國酒業(yè)協(xié)會于2013年啟動了“中國白酒3C計劃”[4]，應用穩(wěn)定同位素技術研究傳統(tǒng)白酒中添加食用酒精的鑒別技術獲得了行業(yè)和企業(yè)的大力支持，也取得了一些研究成果[5-8]，為下一步開展白酒真實性技術標準研究、規(guī)范白酒市場、保護消費者利益打下了基礎。

乙醇碳同位素比值（δ13C）的測定方法主要有蒸餾提取-元素分析/穩(wěn)定同位素比值質譜法[9]、頂空萃取-氣相色譜/燃燒/穩(wěn)定同位素比值質譜法[10-12]、直接進樣-氣相色譜/燃燒/穩(wěn)定同位素比值質譜法[13]和稀釋進樣-氣相色譜/燃燒/穩(wěn)定同位素比值質譜法[5-8，14]，這些方法在不同國家、不同領域均有所應用。近年來出現(xiàn)了液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質譜法（LC-IRMS）測定特定化合物穩(wěn)定碳同位素組成的一些研究報道[15-16]，由于其對大分子有機物具有良好的分離特性，在我國蜂蜜和果汁的摻假鑒別研究和質量控制方面也出現(xiàn)了一些研究與應用[17-19]，但尚未有應用該技術對白酒中乙醇δ13C進行分析研究的報道。本實驗采用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質譜技術建立了測定白酒中乙醇δ13C的分析方法，分析了色譜條件等因素對分析結果的影響，并與GC-C-IRMS的分析結果進行了對比。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

酒樣：10個白酒樣品分別購自北京家樂福超市。

試劑：無水乙醇（HPLC級）購自國藥集團化學試劑有限公司，乙醛、正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇、叔戊醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸、己酸均購自百靈威科技公司。

液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質譜儀（LC-IRMS）：美國ThermoFisher公司的MAT 253同位素質譜儀，配備IsoLink接口與Dionex液相色譜。

氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜儀（GC-CIRMS）：美國ThermoFisher公司的Delta V Advantage同位素質譜儀，配備IsoLink接口與ThermoFisher公司的Ultra TraceGC氣相色譜（配Triplus自動進樣器）。

LC-IRMS使用的超純水由M illipore公司的M illi-Q系統(tǒng)制備。正磷酸（純度≥99%）、過二硫酸鈉（純度≥99%）均購于Sigma-A ldrich公司；保護氣為氦氣（純度≥99.999%），購于北京市北溫氣體制造廠；工作參考氣：二氧化碳（純度≥99.99%），購于北京市北溫氣體制造廠。配制0.2mol/L磷酸溶液和0.2mol/L過二硫酸鈉溶液，存于棕色瓶內，用前使用真空抽濾裝置除雜、用超聲波脫氣。

蔗糖IAEA-CH-6（δ13CPDB值為-10.45‰±0.2‰）購于奧地利維也納國際原子能機構，作為碳穩(wěn)定同位素比值分析的參考物質。

1.2樣品處理

使用超純水將樣品稀釋至乙醇濃度約用0.27g/L，用0.22μm尼龍濾膜過濾，轉移至樣品瓶中供LC-IRMS測定乙醇δ13C值。

1.3實驗條件

LC-IRMS條件：色譜柱為Hyper REZ XPCarbohydrate H+柱（300mm×7.7mm，8μm，ThermoFisher公司）；流動相為超純水，流速為350μL/m in；柱溫為30℃，進樣體積為10μL。磷酸溶液和過二硫酸鈉溶液作為反應助劑，流速為0.05m L/m in以將色譜分離的有機物轉化成CO2。

1.4校準與計算

基于國際基準物質V-PDB（Vienna Pee Dee Belemnite Standard，13C/12C=0.0112372）得出樣品中乙醇的δ13C值（‰）：δ13C=（13C/12C）sample/（13C/12C）VPDB-1。本研究中選擇IAEA-CH-6作為實際測定中的參考物質。

2　結果與討論

2.1測定條件優(yōu)化

穩(wěn)定同位素比值質譜儀具有很高的靈敏度，極易受環(huán)境因素及儀器本身狀態(tài)的影響，因此確保儀器狀態(tài)穩(wěn)定是進行樣品分析的前提。實驗室保持恒溫恒濕（溫度變化不超過1℃/h），提前對色譜柱進行必要的老化并通入反應助劑，待達到分析指標后再進行樣品測試。

2.1.1白酒中其他有機物的影響

液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質譜技術分析的是特定分子的碳穩(wěn)定同位素組成（CSIA）[16]，因此目標物與基質中的其他組分應達到較好的基線分離效果才能不受干擾。由于白酒中除乙醇外還有其他高級醇、酸、酯類物質，為評估乙醇與其他有機物是否達到了基線分離，因此取相同體積的乙醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯等物質混合并稀釋后用LC-IRMS（流速0.25m L/m in，30℃）分析，結果見圖1。

圖1　高濃度混標中乙醇δ13C離子流圖

圖1中，乙醇的保留時間為2992 s，由此可知，當前色譜條件下色譜柱對乙醇有較好的分離效果。然而，通過檢測多種白酒樣品，發(fā)現(xiàn)LC-IRMS的離子流圖中只有乙醇產生了明顯的CO2峰（如圖2），這可能是由于白酒中除乙醇外的其他有機物只占白酒體積的1%左右，樣品稀釋至乙醇含量為0.27g/L時其他有機物也相應的被稀釋了幾千倍，進樣后由于含量太低因而與LC-IRMS的背景值融為一體的緣故。因此，本方法測定白酒乙醇δ13C值時可不必考慮高級醇酯等物質影響。

圖2　白酒中乙醇δ13C的離子流圖

2.1.2乙醇濃度對δ13C測定的影響

IRMS測定碳穩(wěn)定同位素比值時需要比較樣品與CO2參考氣的m/z 44、m/z 45和m/z 46的離子流信號，因此，應評估樣品產生的CO2信號量對測定的影響[20]。本研究采用無水乙醇為研究對象，分別配制成0.03g/L、0.07g/L、0.14g/L、0.27g/L、0.54g/L、1.08g/L和2.16g/L的乙醇水溶液，10μL進樣后得到了500～14000mV的信號強度（m/z 44）梯度，并測定各溶液中乙醇的δ13C值，重復測定5次。如圖3所示，當乙醇濃度為0.03～1.08g/L時，信號強度與乙醇濃度呈正比關系，但是當濃度為2.16g/L時，雖然乙醇含量比1.08g/L的溶液增加了1倍，信號強度卻只增加了三分之一，并且峰形變差（圖4），這是因為該反應體系利用氧化劑（過二磷酸鈉）將乙醇轉化成CO2，而當前濃度的過二磷酸鈉溶液（0.2mol/L）不足以處理過高濃度乙醇的緣故。對比不同乙醇濃度時的δ13C測定結果（圖3、圖4）可知，樣品信號強度處于1500～11000mV時能得到穩(wěn)定的測定結果，因此樣品分析時乙醇濃度在0.14～1.08g/L時測定結果最佳，本實驗選擇0.27g/L作為后續(xù)研究過程的樣品進樣濃度。

圖3　乙醇濃度對δ13C測定的影響

2.1.3色譜柱溫度的影響

有文獻指出色譜柱溫度較低會導致被測組分氧化不完全，影響LC-IRMS測定結果的穩(wěn)定性，因此建議使用較高的色譜柱溫度[21]。本研究使用無水乙醇和一個白酒樣品作為研究對象對色譜柱溫度的影響進行了驗證分析，每個溫度梯度下，無水乙醇和白酒樣品均測定3遍，結果見表1。

圖4　高濃度乙醇溶液中δ13C的離子流圖

表1　色譜柱溫度對乙醇δ13C測定的影響

由表1可知，色譜柱在30～65℃范圍時，乙醇δ13C的測定結果是穩(wěn)定的（標準偏差≤0.06‰），不同溫度時的測定結果也無差異（極差＜0.15‰），這說明該LC-IRMS配套Hyper REZ XPCarbohydrate H+測定乙醇δ13C值時不存在低溫條件下乙醇氧化不完全的情況，即白酒乙醇δ13C值測定穩(wěn)定性不受色譜柱溫度的影響。

高效液相色譜的應用研究表明，較高的色譜柱溫度可以提高分析流速[22]，但是本研究發(fā)現(xiàn)，LC-IRMS測定乙醇δ13C時乙醇的保留時間與色譜柱溫度呈反相關關系：流動相流速為0.4m L/m in時，色譜柱65℃時，乙醇的保留時間相比30℃推遲了82 s?？紤]到溫度對色譜柱壽命的影響以及分析效率，選擇30℃作為該體系下測定乙醇δ13C值的色譜條件。

2.1.4流動相流速的影響

有研究認為[21]流動相流速會影響分析組分δ13C測定的重復性和再現(xiàn)性，本文以無水乙醇為研究對象研究了流動相流速為0.25～0.45m L/m in時乙醇δ13C測定值的變化特性，結果見表2（每個流速梯度下，樣品均測定3遍）。

表2　流速對乙醇δ13C測定的影響

由表2可知，流動相流速固定時乙醇δ13C測定結果是很穩(wěn)定的，因此實際分析過程中可以在0.25～0.45m L/m in范圍內任意設定一個流速參數(shù)。然而，比較不同流速時的測定結果可發(fā)現(xiàn)乙醇δ13C測定值因流速改變而變化，表現(xiàn)出先偏負后偏正的趨勢，這可能與不同流速時氧化劑與目標組分是否充分反應有關，但根據(jù)“IT原則”（Identical TreatmentPrinciple）[23]，由于固定流速時δ13C測定結果穩(wěn)定，可以通過工作標準或同位素參考物質進行校正處理[24]。因此，本方法采用0.35m L/m in作為流動相流速。

2.2方法精密度

根據(jù)GB/T 6379.1—2004，在重復性條件下對無水乙醇和白酒樣品中乙醇的δ13C分別連續(xù)測定10次，在再現(xiàn)性條件下，10 d內對相同的無水乙醇、白酒樣品完成10次獨立測定，結果見表3，可見測定乙醇δ13C的標準偏差（SD）為0.01‰～0.09‰，重復性和再現(xiàn)性均優(yōu)于氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜法[5-6]，滿足檢測需求。

表3　LC-IRMS測定乙醇δ13C的重復性和再現(xiàn)性

2.3方法準確性

筆者所在的研究團隊于2011年開發(fā)了氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜儀（GC-C-IRMS）測定飲料酒中乙醇δ13C的方法[5-8]，并通過了歐盟組織的穩(wěn)定同位素實驗室間的能力驗證，目前該方法已被采納為行業(yè)標準[25]。由于缺少乙醇碳同位素的參考物質，因而不能通過直接測量參考物質的形式對LC-IRMS測定乙醇δ13C的準確性進行驗證。為研究本方法的準確分析能力，分別采用本方法和GC-C-IRMS測定10個白酒樣品中乙醇的δ13C值，結果見表4。

表4　LC-IRMS和GC-C-IRMS測定10個白酒樣品中乙醇δ13C值的比較

由表4可知，采用本方法測定的白酒乙醇δ13C值與GC-C-IRMS方法相比，測定結果的差值均小于0.25‰，線性相關程度達0.999，說明本方法測定白酒樣品中乙醇的δ13C值準確有效，滿足國際標準檢查方法的質量控制要求[26]。

3　結論及展望

應用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質譜技術測定白酒中乙醇δ13C值的方法。所建立的方法具有前處理簡單的特性，且重復性和再現(xiàn)性結果均較好。與氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質譜技術對比驗證了本方法的準確性。該方法為我國白酒乙醇碳同位素分析提供了技術手段，為我國白酒的碳同位素檢測技術與國際接軌、建立我國白酒同位素數(shù)據(jù)庫以及白酒真?zhèn)舞b別技術研究提供了方法支持。

[1]Rossmann A.Determination of stable isotope ratios in food analysis[J].Food Reviews International,2001,17(3)：347-381.

[2]Ogrinc N,Ko?ir IJ,Spangenberg JE,etal.Theapplication of NMR and MSmethods for detection of adulteration ofw ine, fruit juices,and olive oil.A review[J].Analyticaland BioanalyticalChem istry,2003,376(4)：424-430.

[3]GhidiniS,IanieriA,ZanardiE,etal.Stable isotopes determ ination in food authentication:a review[J].Annalidella FacoltàdiMedicina Veterinaria-UniversitàdiParma,2006,16：193-204.

[4]“中國白酒3C計劃”江南大學組首次項目會議召開[J].釀酒科技,2014(2)：15.

[5] 陳文斌,鐘其頂,王道兵,等.氣相色譜-同位素質譜(GC-CIRMS)測定飲料酒中乙醇13C/12C比值方法研究[J].釀酒科技,2013(5)：27.

[6]鐘其頂,王道兵,熊正河.固態(tài)法白酒與固液法白酒的同位素鑒別技術[J].質譜學報,2014,35(1)：66-71.

[7]王道兵,鐘其頂,李國輝,等.發(fā)酵乙醇中13C/12C分布的影響因素研究[J].釀酒科技,2014(11)：6-9.

[8]程濤,鐘其頂,王道兵,等.梨白蘭地中乙醇碳同位素分布特征研究[J].中國釀造,2014,33(12)：19-22.

[9] 李學民,賈光群,王蕾,等.元素分析-同位素比質譜法測定葡萄酒中乙醇δ13C值[J].分析化學,2014,42(1)：99-103.

[10]Aguilar-Cisneros BO,LópezMg,Richling E,etal.Tequila authenticity assessmentby headspace SPME-HRGC-IRMS analysisof13C/12C and 18O/16O ratiosofethanol[J].Journal of Agriculturaland Food Chemistry,2002,50(26)：7520-7523.

[11]Yamada K,Yoshida N,CalderoneG,etal.Determination of hydrogen,carbon and oxygen isotope ratiosof ethanol in aqueoussolution atm illimole levels[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2007,21(8)：1431-1437.

[12]HattoriR,Yamada K,Hasegawa K,etal.An improved method for themeasurementof the isotope ratio of ethanol in various samples,including alcoholic and non-alcoholic beverages[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2008,22(21)：3410-3414.

[13]Caba?ero A I,Recio JL,RupérezM.Isotope ratiomass spectrometry coupled to liquid andgas chromatography for w ineethanol characterization[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2008,22(20)：3111-3118.

[14]AiG,Sun T,Dong X.Gas chromatography/isotope ratiomass spectrometry:Analysisofmethanol,ethanoland acetic acid by directinjection of aqueousalcoholic and acetic acid samples[J].Rapid Communications in MassSpectrometry, 2014,28(15)：1674-1682.

[15]Mccullagh JSO,Juchelka D,HedgesREM.Analysisof am ino acid 13C abundance from human and faunalbone collagen using liquid chromatography/isotope ratiomass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2006,20(18)：2761-2768.

[16]Cabanero IAna,Recio JL,RuperezM.Liquid chromatography coupled to isotope ratiomassspectrometry:a new perspective on honey adulteration detection[J].Journalof Agriculturaland Food Chem istry,2006,54(26)：9719-9727.

[17] 費曉慶,吳斌,沈崇鈺,等.液相色譜/元素分析-同位素比值質譜聯(lián)用法鑒定蜂蜜摻假[J].色譜,2011,29(1)：15-19.

[18]李鑫,劉柱,蔣鑫,等.液相色譜/元素分析-同位素比率質譜聯(lián)用法鑒定橙汁摻假[J].食品科技,2013,38(5)：323-327.

[19]祝偉霞,楊冀州,楊娜,等.液相色譜-同位素比值質譜法研究桔橙汁中檸檬酸碳同位素比值[J].分析試驗室,2014(12)：12.

[20]劉文貴,唐明霞.提高氣體同位素質譜計線性的研究[J].化學研究與應用,2010,22(12)：1569-1572.

[21] 李學民,賈光群,曹彥忠,等.液相色譜-同位素比質譜法同時測定葡萄酒中甘油和乙醇的δ13C值[J].色譜,2013,31(12)：1201-1205.

[22]成洪達,李彤,張維冰.溫度對高效液相色譜分離性能的影響[J].現(xiàn)代科學儀器,2007(5)：74-78.

[23]Werner RA,BrandW A.Referencing strategiesand techniques in stable isotope ratio analysis[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2001,15(7)：501-519.

[24]PaulD,Skrzypekg,Forizs I.Normalization ofmeasured stable isotopic compositions to isotope reference scales-a review[J].Rapid Communications in MassSpectrometry, 2007,21(18)：3006-3014.

[25]對《白酒中乙醇穩(wěn)定碳同位素13C/12C比值測定方法》行業(yè)標準征求意見的通知[EB/OL].[2016-09-10]. http://news.foodmate.net/2014/12/286814.htm l.

[26]OIV.Determination by Isotope Ratio Mass Spectrometry of the13C/12C ratio of the ethanolof spiritdrinksof vitiviniculturalorigin:OIV/OENO 381/2009[S].International Organisation of VineandWine,2009.

Determ ination of Carbon Isotope Ratio of Ethanol in Baijiu by Liquid Chromatography Coup led w ith Isotope Ratio MS

ZHONG Qiding1,2,3,WANG Daobing2,ZHANG Qian1,XIE Zhengm in1, CHEN Lin1,XIONG Zhenghe2and XIAODongguang3
(1.PostdoctoralResearch Institute ofWuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000;2.China National Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027;3.Tianjin University of Scienceand Technology,Tianjin 300457,China)

Compound-specific stable isotope analysis(CSIA)hasbecome the research focus in recentyears.On the basisof S&T development, the determ ination of ethanolδ13C isotope ratio of Baijiu by liquid chromatography coupled w ith isotope ratio mass spectrometry(LC-IRMS) has been developed.In this study,several parameters influencing the separation of ethanol from liquormatrix and influencing themeasurement ofδ13C of ethanolwere investigated and then optimized as follows:mobile phasewas at0.35m L/min,column temperature at 30℃,ethanol concentration for injectionwas in the range of 0.14g/L to 1.08g/L.The results showed that the analytic precision of themethod was better than 0.09‰(n=10).10 liquor sampleswere determ ined by thismethod and by the officialmethod(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry)respectively.There were significant correlations(R2=0.999)between themeasured results of the twomethods.LC-IRMS had the advantages including simple operation,low detection lim it(0.14g/L),and high accuracy.

liquid chromatography coupled w ith isotope ratiomass spectrometry;stable carbon isotope ratio(δ13C);ethanol;Baijiu

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0049-05

10.13746/j.njkj.2016298

國家國際科技合作專項（2015DFA31720），北京市科技新星計劃（xx2016B079）。

2016-10-10

鐘其頂（1980-），男，高級工程師，博士，在讀博士后，研究方向為穩(wěn)定同位素食品分析技術，E-mail：zhongqiding@163.com。