董永勝，馬蕾，王艷杰

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系發(fā)酵條件的研究

董永勝，馬蕾，王艷杰

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

研究釀酒酵母NJ-16生產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系的發(fā)酵條件，確定酵母最適產(chǎn)酶條件為：搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，pH 5.0，培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)基中硫酸鎂含量為2 g/L。此條件下，釀酒酵母NJ-16的谷胱甘肽合成酶系的活性為12.5U/g濕菌體。

釀酒酵母；谷胱甘肽合成酶系；發(fā)酵條件

谷胱甘肽合成酶系是催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的酶，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-Ⅰ）和谷胱甘肽合成酶（GSH-Ⅱ）組成[1-2]。谷胱甘肽具有清除自由基、解毒、延緩衰老、預(yù)防糖尿病、保護(hù)肝臟、抗輻射、提高人體免疫力、抑制艾滋病病毒、防止皮膚老化等功能[3-4]，在臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動營養(yǎng)學(xué)、食品加工等眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值和產(chǎn)業(yè)前景[5-6]，其工業(yè)化生產(chǎn)越來越受到關(guān)注。谷胱甘肽作為生物活性物質(zhì)，已越來越多地應(yīng)用于食品工業(yè)中[7]，如在面制品中能起到強(qiáng)化氨基酸的作用，在肉類和海鮮食品中可強(qiáng)化風(fēng)味并延長保鮮期，在水果蔬菜類飲料中可有效防止食品褐變，還可用于幫助人們排毒的功能食品的生產(chǎn)[8]。

酵母發(fā)酵法是生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方法，酵母谷胱甘肽合成酶系的活性對谷胱甘肽的產(chǎn)量有決定性的作用，但正常酵母的酶系活性較低，為提高谷胱甘肽產(chǎn)量，常采用各種育種技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)菌株的選育[9-10]。目前對酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的發(fā)酵條件有較多的研究[11]，也對酵母在極端條件下合成谷胱甘肽進(jìn)行了一些研究[12-13]，但對酵母合成谷胱甘肽合成酶系的培養(yǎng)條件研究較少。作者以選育的釀酒酵母NJ-16為出發(fā)菌株，以提高酵母谷胱甘肽合成酶系的活性為研究目標(biāo)，探討酵母高產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系的發(fā)酵條件，為提高酵母工業(yè)化谷胱甘肽產(chǎn)率提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

釀酒酵母（S.cerevisiae）NJ-16：山東省微生物工程重點實驗室選育。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母膏5，（NH4）2SO45.0，KH2PO45.0，MgSO42.0，pH 5.0。

1.3 酵母培養(yǎng)

從活化斜面上挑取一環(huán)菌體接入到種子培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)24 h。然后將酵母種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 生物量測定

取發(fā)酵液25 mL，離心收集菌體，用蒸餾水沖洗3次，離心收集菌體，于70℃烘干至恒重后稱重。

1.5 谷胱甘肽合成酶系活性的測定

將發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，用磷酸緩沖液洗滌菌體，離心收集細(xì)胞。取1.0 g濕菌體加入到19.6mL的0.03mol/L、pH7.2的磷酸緩沖液中，再加入0.4mL的甲苯，在35℃下處理2 h。離心收集上清液，即得粗酶液。取10.0mL粗酶液加入到10.0mL反應(yīng)液中，在37℃、150 r/min下反應(yīng)1 h，反應(yīng)液再在沸水浴中保溫10min。離心取上清液，采用HPLC法測定上清液中谷胱甘肽的含量。谷胱甘肽合成酶系活力單位定義：上述反應(yīng)條件下，每小時轉(zhuǎn)化生成1mg谷胱甘肽的酶量為1個酶活單位。

反應(yīng)液組成：40mmol/LL-谷氨酸，20mmol/LL-半胱氨酸，20mmol/L甘氨酸，20mmol/LMgC12，200mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影響

將酵母接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于160 r/min下培養(yǎng)20 h，溫度分別控制在26、28、30、32、34、36、38℃，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下酵母谷胱甘肽合成酶系活性和生物量的變化Fig.1 Changesof theglutathionesynthetasesactivity in the S. cerevisiae cellsand biom asscultured under different tem perature

由圖1可知，發(fā)酵溫度對谷胱甘肽合成酶系的活性有明顯影響：隨著溫度的升高酶系活性也隨之升高，32℃時酶系活性達(dá)到最高為10.2 U/g濕菌體，比28℃時提高36.0%，說明酵母產(chǎn)酶的溫度高于其生長最適的溫度；在試驗條件下，較高的發(fā)酵溫度有利于酶系的合成，如38℃時酶系活性也高于28℃，但卻低于32℃，這是由于較高溫度下酵母代謝相對變慢而引起的，且38℃培養(yǎng)時酵母生物量也比32℃下降了17.7%。因此在釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽時，采用較高的培養(yǎng)溫度即可達(dá)到較高的生物量，又可提高谷胱甘肽合成酶系的活性，進(jìn)而提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。

2.2 pH對酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影響

調(diào)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，將酵母接種于不同pH的培養(yǎng)基中，于32℃、160 r/min下分別培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)過程中pH的控制通過流加3mol/L的H2SO4或3mol/L的NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH下酵母谷胱甘肽合成酶系活性的變化Fig.2 Changesof theglutathione synthetasesactivity in the S. cerevisiae cellsand biomass cultured under differentpH

由圖2可知，pH對酵母谷胱甘肽合成酶系的活性也有明顯影響：酵母在相對較低的pH下培養(yǎng)時酶系活性較高，在pH 5.0時酶系活性達(dá)到最高為11.1U/g濕菌體，比pH 7.0時高35.4%，這與釀酒酵母的生長最適pH相同。在pH4.0～5.5之間酵母的生物量變化不大，但在pH 7.0時酵母的生物量與pH 5.0相比下降了14.1%。與圖1相比，恒pH 5.0下酶系活性提高8.8%，這是由于在圖1條件下培養(yǎng)基的初始pH在發(fā)酵過程中發(fā)生了變化，進(jìn)而影響到酵母酶系的產(chǎn)率，因此采用恒定pH培養(yǎng)可避免這種影響。

2.3 溶氧對酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影響

微生物酶產(chǎn)量與發(fā)酵液中的氧含量有直接關(guān)系，發(fā)酵液中溶氧量與搖床轉(zhuǎn)速有關(guān)。取發(fā)酵培養(yǎng)基100mL于500mL三角瓶中接種酵母，于32℃、不同搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20 h。搖床轉(zhuǎn)速對酵母谷胱甘肽合成酶系活性的影響如圖3所示。

由圖3可知，隨著轉(zhuǎn)速增加，酵母的生物量和酶系活性都隨之上升；在轉(zhuǎn)速160 r/min～200 r/min之間時，酶系活性和生物量都達(dá)到相對較高的數(shù)值，且基本穩(wěn)定，因此搖床轉(zhuǎn)速以160 r/min即可。

2.4 無機(jī)鹽對酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對酵母合成谷胱甘肽合成酶系和生物量的影響Fig.3 Effectof rotationalspeed on the synthesisof glutathione synthetasesand biom ass

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2 g/L的硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鉀、氯化鉀以替代硫酸鎂，將酵母于32℃、160 r/min下培養(yǎng)20 h。結(jié)果如圖4所示。

圖4 無機(jī)鹽對酵母合成谷胱甘肽合成酶系和生物量的影響Fig.4 Effectof inorganic saltson the synthesisof glutathione synthetasesand biom ass

由圖4可知，不同無機(jī)鹽對酵母谷胱甘肽合成酶系活性的影響不同：當(dāng)培養(yǎng)基中存在硫酸鎂時酶系活性最高；而其他4種鹽存在時，與硫酸鎂相比酶系活性相對下降較多。硫酸鎂使谷胱甘肽合成酶系活性升高的原因是Mg2+為γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性中心的輔因子，酶系的合成需要Mg2+的參與。在不同無機(jī)鹽下培養(yǎng)酵母時，生物量相對變化不大，說明上述無機(jī)鹽對酵母生長的影響較小。因此，在酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系時，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加一定量的硫酸鎂。

2.5 酵母合成谷胱甘肽合成酶系的發(fā)酵條件優(yōu)化

在實際生產(chǎn)中，由于各種因素相互影響，為選出最佳產(chǎn)酶條件，根據(jù)單因素對酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影響，以培養(yǎng)溫度、pH、轉(zhuǎn)速和硫酸鎂用量4種因素為影響因子，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗，試驗結(jié)果及分析見表1。

從表中看出：培養(yǎng)溫度、pH、轉(zhuǎn)速和硫酸鎂用量四因素對酵母谷胱甘肽合成酶系活性的影響順序為：轉(zhuǎn)速>pH>溫度>硫酸鎂用量，其最佳產(chǎn)酶條件為A2B2C3D2，即轉(zhuǎn)速為180 r/min、pH為5.0、培養(yǎng)溫度為32℃、硫酸鎂用量為2 g/L。此條件下，酵母谷胱甘肽合成酶系活性最高，驗證試驗其酶系活性為12.5U/g濕菌體。

表1 正交表及試驗結(jié)果分析Table1 Orthogonal listand the resultanalysisof test

3 結(jié)論

釀酒酵母合成谷胱甘肽合成酶系的最適溫度與其生長最適溫度不同，酵母在32℃培養(yǎng)時，酶系活性高于其最適生長溫度；而產(chǎn)酶和生長的最適pH相同，即pH為5.0時，酶系活性最高。釀酒酵母合成谷胱甘肽合成酶系的最佳條件為：搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵液pH為5.0，發(fā)酵溫度為32℃，培養(yǎng)基中硫酸鎂用量為2 g/L，此條件下，酵母谷胱甘肽合成酶系活性可達(dá)到12.5U/g濕菌體。本文關(guān)于酵母生產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系發(fā)酵條件的研究，對谷胱甘肽工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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Study on Fermentation Conditions of Glutathione Synthetases Producted by S.cerevisiae

DONGYong-sheng，MA Lei，WANGYan-jie
（CollegeofBioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353，Shandong，China）

The fermentation conditions of glutathione synthetasesproducted by S.cerevisiae NJ-16 were researched，and the optimal conditions of enzymes production were determined as follows：rotational speed180 r/ min，pH 5.0，fermentation temperature 32℃，the dosage ofmagnesium sulphate inmedium was 2 g/L.Under these culture conditions，the activity of glutathione synthetasesproducted by S.cerevisiae NJ-16 was 12.5 U/g wetcell.

S.cerevisiae；glutathione synthetases；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.036

2016-03-25

董永勝（1964—），男（漢），教授，博士，主要研究方向：食品發(fā)酵。