王紅丹，馮戰(zhàn)啟，婁桂予△，劉紅彥，黃飛飛，劉石嶺

(1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所，鄭州 450003；2.河南省鄭州市第一人民醫(yī)院泌尿外科 450004)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)產(chǎn)前檢測(cè)室間隔缺損胎兒2p16.3微缺失的臨床研究*

王紅丹1，馮戰(zhàn)啟2，婁桂予1△，劉紅彥1，黃飛飛1，劉石嶺1

(1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所，鄭州 450003；2.河南省鄭州市第一人民醫(yī)院泌尿外科 450004)

目的 了解心臟室間隔缺損胎兒基因組拷貝數(shù)變化，尋找其致病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，探討微陣列基因組雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的可行性。方法 用G顯帶核型分析技術(shù)分析胎兒及其父母外周血染色體，用微陣列比較基因組雜交技術(shù)(Array-CGH)進(jìn)行患兒及其父母DNA拷貝數(shù)變異分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和文獻(xiàn)分析明確異常缺失區(qū)域的病理意義。結(jié)果 患兒父母外周血染色體核型分析未見異常；Array-CGH檢測(cè)患兒發(fā)現(xiàn)染色體2p16.3區(qū)存在640×103bp的缺失，15q11區(qū)存在2 028×103bp的缺失，20p13區(qū)存在535×103bp的重復(fù)。結(jié)論 經(jīng)查數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)染色體2p16.3區(qū)域微缺失可能與胎兒室間隔缺損相關(guān)。

產(chǎn)前診斷；核酸雜交；基因組；可行性研究；微陣列比較基因組雜交；室間隔缺損

微陣列比較基因組雜交技術(shù)(Array-CGH)具有高分辨率、高通量、高靈敏性和高準(zhǔn)確性。本研究應(yīng)用Array-CGH對(duì)1例室間隔缺損的先天性缺陷胎兒羊水細(xì)胞進(jìn)行高分辨率全基因組掃描分析，旨在尋找胎兒基因組中可能存在的病理性拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNVs)，豐富對(duì)室間隔缺損的病因?qū)W認(rèn)識(shí)，探討微陣列比較基因組雜交在產(chǎn)前分子細(xì)胞遺傳學(xué)診斷中應(yīng)用的可行性，為患兒父母再生育選擇合適的產(chǎn)前診斷技術(shù)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，漢族，31歲。晚孕，因超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒室間隔缺損至河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所行產(chǎn)前遺傳咨詢。患者與其配偶體檢正常，非近親結(jié)婚，無(wú)遺傳家族史。為明確病因，經(jīng)患者知情同意，進(jìn)行了羊水穿刺術(shù)并抽取胎兒父母外周血進(jìn)行細(xì)胞和分子遺傳學(xué)檢測(cè)。此項(xiàng)研究經(jīng)過(guò)河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析 抽取胎兒父母靜脈血各3mL，均肝素抗凝處理，取1mL接種于RPMI1640淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，置于恒溫箱37 ℃培養(yǎng)72h，收獲前1h加入秋水仙素。常規(guī)細(xì)胞收獲，制片，Giemsa染色顯帶，選擇分散良好和顯帶清晰的核型鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.2.2DNA提取 取500μL血液，采用全血DNA柱式提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)按照說(shuō)明書操作進(jìn)行。超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000，美國(guó))測(cè)定DNA濃度和純度，所提DNA樣本A260/A280為1.80～1.90。

1.2.3Array-CGH檢測(cè)分析 對(duì)患兒及其父母應(yīng)用HumangenomeCGHMicroarray8×60K芯片(美國(guó)Agilent公司)進(jìn)行檢測(cè)，采用MicroarrayScanner(美國(guó)Agilent公司)及其他配套軟件對(duì)芯片進(jìn)行掃描和初步分析，檢索UCSC、DECIPHER、ISCA等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的及對(duì)比致病性鑒定。

1.2.4CNVs的判斷和評(píng)價(jià) 基因組CNVs分析采用AgilentSurePrintG3HumanCGHMicroarrayKit，該芯片包含約6萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)標(biāo)記探針。研究表明，致病的CNVs99.34%片段大于300×103bp[1]，臨床應(yīng)用中建議針對(duì)200×103bp以上CNVs進(jìn)行檢測(cè)[2]。本檢測(cè)僅針對(duì)染色體非整倍體性改變及200×103bp以上的片段缺失與重復(fù)，不排除有更小的染色體結(jié)構(gòu)或基因片段異常的可能性。根據(jù)CNVs的性質(zhì)不同可將其分為良性CNVs、可疑致病性CNVs及臨床意義不明確的CNVs(variantsofuncertainsignificance,VOUS)。數(shù)據(jù)分析參考公開數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC、DECIPHER、ISCA等。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果 胎兒及其父母染色體核型正常。

2.2Array-CGH檢測(cè)結(jié)果 胎兒Array-CGH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2個(gè)微小缺失和1個(gè)微小重復(fù)，缺失發(fā)生在2p16.3區(qū)(hg19：52185415-52825075)和15q11區(qū)(hg19：20481702-22509254)，大小分別為640×103bp和2 028×103bp，檢測(cè)核型圖見圖1；重復(fù)發(fā)生在20p13區(qū)(hg19：439387-974841)，大小約535×103bp。未見其他染色體存在探針拷貝數(shù)變化。其父母Array-CGH檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變化。

圖1 Array-CGH檢測(cè)核型圖

3 討 論

Array-CGH技術(shù)通過(guò)一次雜交試驗(yàn)就可以對(duì)全基因組DNACNVs進(jìn)行檢測(cè)，又被稱為“分子核型分析”，具有高分辨率、高敏感性和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于檢測(cè)染色體組微小缺失、重復(fù)等不平衡性重排具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，明顯提高了基因組不平衡的檢測(cè)率。2010年，國(guó)際細(xì)胞基因組芯片標(biāo)準(zhǔn)協(xié)作組(ISCAConsortium)推薦將Array-CGH作為對(duì)原因不明的發(fā)育遲緩、智力低下、多種體征畸形及自閉癥患者的首選臨床一線檢測(cè)方法[1]。

染色體異常是先天發(fā)育畸形、發(fā)育遲緩和其他多種先天異常的主要原因。其中較小染色體不平衡畸變也可以引起智力低下、器官畸形和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。而常規(guī)G顯帶技術(shù)對(duì)這些較小染色體不平衡畸變的檢出率僅15%～40%[2]。目前，國(guó)外研究已經(jīng)證實(shí)Array-CGH在針對(duì)智力低下、多發(fā)性先天畸形等患者的遺傳診斷中的檢出率為7%～11%[3-4]。染色體微缺失或重復(fù)引起的綜合征常見的有Williams綜合征、DiGeorge或velo-eardio-facial綜合征及Prader-Willi綜合征等，其引起的傷殘程度及其給家庭、社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)嚴(yán)重[5]。而導(dǎo)致這些綜合征的染色體異常片段通常比較細(xì)小，因此往往不能被常規(guī)方法識(shí)別。

先天性心臟病(congenitalheartdefect,CHD)是最常見的先天缺陷，發(fā)生率為活產(chǎn)兒的1%和自然流產(chǎn)的10%[6]，其中染色體異常占其發(fā)生原因的8%，環(huán)境因素占2%，余為多因子因素引起[7]。報(bào)道最多的引起CHD的微缺失發(fā)生在22q11基因群，發(fā)生率1.4～2.5%[8-10]。許爭(zhēng)峰等[11]對(duì)163例的CHD進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)7.36%CHD存在22q11關(guān)鍵區(qū)微缺失。另?yè)?jù)報(bào)道，與胎兒心臟正常發(fā)育密切相關(guān)的還有5q35區(qū)段、心臟特異性同源盒基因及Jagged1基因等[12]。

本例Array-CGH檢測(cè)胎兒發(fā)現(xiàn)染色體2p16.3區(qū)域存在640×103bp的缺失(hg19：52185415-52825075)，15q11區(qū)域存在2 028×103bp的缺失(hg19：20481702-22509254)，20p13區(qū)域存在535×103bp的重復(fù)(hg19：439387-974841)。經(jīng)查閱公開數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC、DECIPHER、ISCA等未見染色體15q11區(qū)域2 028×103bp缺失和20p13區(qū)域535×103bp重復(fù)的致病性報(bào)道，且在健康人群中存在這兩種CNVs。而數(shù)據(jù)庫(kù)顯示2p16.3區(qū)域缺失與智力障礙、癲癇、語(yǔ)言發(fā)育障礙、面部發(fā)育畸形等多種臨床特征相關(guān)，但未見該區(qū)域與室間隔缺損相關(guān)性的報(bào)道，本例發(fā)現(xiàn)該缺失區(qū)段也與室間隔缺損相關(guān)，豐富了數(shù)據(jù)庫(kù)信息。關(guān)于該區(qū)域致病的文獻(xiàn)報(bào)道也很多，Meng等[13]的研究顯示該區(qū)域的突變可能與原發(fā)性青光眼相關(guān)，Zhen等[14]的研究顯示該區(qū)域可能與生育相關(guān)，另有研究顯示該區(qū)域的微缺失與發(fā)育遲緩、身材矮小和先天性膈疝等相關(guān)[15]。

總之，應(yīng)用Array-CGH，在一個(gè)室間隔缺損的胎兒基因組中檢出了一個(gè)未報(bào)道過(guò)的染色體2p16.3新發(fā)缺失，明確診斷了本病例2p缺失的斷裂位點(diǎn)、片段大小乃至基因序列，也為臨床表型與基因型關(guān)系的研究提供了較為完整的信息。2p16.3區(qū)域缺失具有多種臨床特征，臨床特征的可辨識(shí)性不高，如果明確診斷仍需要分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)分析，該缺失與疾病表型的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究去澄清。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81501336，81270488)。 作者簡(jiǎn)介：王紅丹(1983-)，助理研究員，碩士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)方面研究。△

E-mail：louguiyu@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.030

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