李曉寧,吳 磊,梅繼林,李 諾,單筱淳,梁雪松

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

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實(shí)驗(yàn)研究

夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍對(duì)急性脊髓損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能及尼氏小體影響的實(shí)驗(yàn)研究*

李曉寧1,吳 磊2,梅繼林2,李 諾2,單筱淳2,梁雪松2

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療對(duì)急性脊髓損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體的影響。方法：將72只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組，每組分1天、3天、7天和14天4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。NYU打擊器制備急性脊髓損傷模型。假手術(shù)組僅暴露脊髓，不進(jìn)行打擊，常規(guī)飼養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)；模型組暴露脊髓并進(jìn)行打擊，造成ASCI模型后常規(guī)飼養(yǎng)；夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組造模后給予夾脊電針治療，每次30 min每日1次,并于術(shù)后30 min給予實(shí)驗(yàn)大鼠一次性注射甲基強(qiáng)的松龍30 mg/kg。用BBB評(píng)分觀察急性脊髓損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能，Nissl染色觀察各組大鼠脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體的變化。結(jié)果：BBB評(píng)分結(jié)果顯示，模型組大鼠BBB評(píng)分較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)；經(jīng)治療后，夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組3天、7天、14天組BBB評(píng)分顯著升高(P<0.05)，且14天評(píng)分高于3天組(P<0.05)。Nissl染色結(jié)果可見，模型組大鼠1天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，尼氏小體腫脹破碎，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少；3天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞胞體破壞明顯，核仁消失，受損神經(jīng)細(xì)胞明顯增多；7天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞緊縮，尼氏小體溶解破碎，數(shù)量減少；14天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞緊縮更加明顯，胞漿深染。夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組尼氏小體破碎溶解減輕，尼氏小體數(shù)量較模型組增多，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較好。結(jié)論：夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療可以通過增加尼氏小體數(shù)量，從而改善脊髓神經(jīng)細(xì)胞形態(tài),保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，改善ASCI大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能。

急性脊髓損傷；夾脊穴；電針；甲強(qiáng)龍；Nissl染色

急性脊髓損傷(ASCI)年發(fā)病率約為(20～40)/100萬[1]，由脊髓受損所致的永久性神經(jīng)功能障礙一直是世界醫(yī)學(xué)的難題[2-3]。由于其高致殘率和死亡率，給患者家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此積極尋求有效的治療手段具有重要的臨床意義。目前，對(duì)于ASCI的治療主要包括手術(shù)干預(yù)、藥物治療、細(xì)胞移植治療等[4]，藥物治療中甲強(qiáng)龍是臨床運(yùn)用較廣的一種類固醇激素類藥物，但目前對(duì)其臨床獲益、使用劑量及時(shí)間等問題仍存在較大爭(zhēng)議[5]，這也限制了其臨床應(yīng)用。

夾脊穴是祖國醫(yī)學(xué)治療督脈損傷的常用穴，隨著對(duì)夾脊電針治療急性脊髓損傷的機(jī)制研究逐漸深入[6-7]，運(yùn)用夾脊電針治療急性脊髓損傷越來越引起人們的重視，并被運(yùn)用于臨床實(shí)踐[8]。急性脊髓損傷后挽救受損神經(jīng)細(xì)胞是恢復(fù)脊髓功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而尼氏小體的數(shù)量和形態(tài)能夠反應(yīng)急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)。本研究運(yùn)用夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療急性脊髓損傷大鼠，觀察兩者聯(lián)合運(yùn)用對(duì)急性脊髓損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能及尼氏小體的影響，為夾脊電針更好的應(yīng)用臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雌性Wistar大鼠72只，體質(zhì)量(200±10)g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)2015-0001)提供，保持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水與糧食充足。大鼠在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為假手術(shù)組(24只)、模型組(24只)、夾脊電針組(24只)，治療時(shí)間點(diǎn)為1天、3天、7天和14天。選取BBB評(píng)分為1～3分的ASCI大鼠入組，手術(shù)大鼠單籠飼養(yǎng)，苦味酸染色標(biāo)記編號(hào)。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[9]對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處置。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

二甲苯(X112051，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酚紫(71044080，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(FX11610，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)； NYU打擊器(Impactor Model-Ⅲ 029，USA);石蠟切片機(jī)(RM2235，德國 Leica)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(QH01-9030A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特)；顯微鏡(DP73，日本 Olympus)；電針儀(KWD-808-Ⅱ，中國英迪)； 針灸針(0.35 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.3 模型制備

1.3.1 造模方法[10]采用美國Impactor Model-Ⅲ spinal cord contusion system 打擊器，計(jì)算機(jī)程控下精確打擊制作大鼠 ASCI 模型(T10,中度損傷)。用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，俯臥固定，背部去毛，皮膚常規(guī)消毒，鋪巾。以肋弓下緣作為第8肋的標(biāo)記，沿肋骨定位其椎骨，選取后背正中切口，在第10胸椎上1.5 cm下1.5 cm切長約3 cm的縱行切口，縱行切開皮下肌筋膜，暴露T9～11棘突，鈍性分離肌肉至關(guān)節(jié)突，充分暴露棘突和椎板，在T10部位行椎板摘除術(shù)，暴露脊髓但不破壞硬脊膜。將大鼠固定于打擊器基座上，設(shè)置打擊參數(shù)，調(diào)整脊髓與打擊棒位置，釋放脊髓棒，設(shè)置零點(diǎn)等，打擊脊髓。打擊棒以10 g×50 mm勢(shì)能撞擊以T10為中心段脊髓，造成該段的急性脊髓中度損傷，生理鹽水沖洗傷口及清除殘留血液，傷口部位常規(guī)分層縫合。

1.3.2 NYU打擊器撞擊成功標(biāo)志 當(dāng)打擊棒接觸到脊髓與探針形成回路后會(huì)發(fā)出警報(bào)聲；撞擊完成后電腦描記撞擊曲線，撞擊高度和速度在正常誤差范圍內(nèi)；大鼠可有身體痙攣性顫動(dòng)及硬脊膜內(nèi)充血或血腫。滿足以上條件即為撞擊成功。

1.3.3 模型成功標(biāo)志 待大鼠清醒后，分別進(jìn)行BBB評(píng)分，選擇BBB評(píng)分在1～3分入組，造模未成功按照隨機(jī)方法選擇大鼠進(jìn)行補(bǔ)充，造模后大鼠單籠飼養(yǎng)。

1.3.4 術(shù)后動(dòng)物護(hù)理 術(shù)后腹腔注射生理鹽水0.5 ml補(bǔ)充體液，于次日給予大鼠前肢青霉素20萬U肌肉注射(體重為200 g)，1次/天，連續(xù)3天。次日開始按摩大鼠腹部，協(xié)助排尿、排便，每日早晚各1次，持續(xù)至大鼠能自主排尿排便。觀察手術(shù)切口有無異常、腹部皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛等，注意鼠籠清潔衛(wèi)生，隔日換1次墊料。每次抓取大鼠動(dòng)作要輕柔，避免牽拉損傷脊髓。

1.4 各組處理方法

假手術(shù)組：僅暴露脊髓，不進(jìn)行打擊，手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處置。

模型組：暴露脊髓并打擊，造成ASCI大鼠模型，模型制備成功后單籠飼養(yǎng)，不予任何處置。

夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組[11]：夾脊電針治療：于模型制備成功后3 h進(jìn)行夾脊電針早期干預(yù)治療，此后每日1次，直至療程結(jié)束。針刺穴位選取T9、T11節(jié)段夾脊穴。操作方法：將0.35 mm×13 mm毫針直刺入所選穴位下4～5 mm，接通電針儀正負(fù)兩極，正極在上、負(fù)極在下，然后打開電流輸出旋鈕，電流輸出強(qiáng)度以大鼠耐受、不出現(xiàn)強(qiáng)烈掙扎、背部肌肉輕微抽動(dòng)為度(強(qiáng)度約0.4～0.6 mA)。電針儀脈沖波型：連續(xù)波，脈沖寬度：(0.5±0.15)ms，脈沖重復(fù)頻率：100 Hz，由電位器FREQ連續(xù)可調(diào)，脈沖峰值：Vp1≥(40±10)V(在500負(fù)載下)，刺激時(shí)長為30 min/次/日。甲強(qiáng)龍治療：術(shù)后30 min時(shí)，給予實(shí)驗(yàn)大鼠一次性注射甲強(qiáng)龍，按30 mg/kg與9/L生理鹽水配置成0.5 ml注射液，給予大鼠腹腔注射。

1.5 實(shí)驗(yàn)大鼠BBB評(píng)分

大鼠脊髓損傷后，對(duì)后肢運(yùn)動(dòng)情況的觀察和評(píng)價(jià)采用Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)分級(jí)法[12]進(jìn)行。BBB分級(jí)法被認(rèn)為是評(píng)價(jià)大鼠脊髓損傷后肢體功能十分有效的一種方法。在實(shí)驗(yàn)過程中，筆者采用3位熟悉該評(píng)分、但不熟悉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的其他實(shí)驗(yàn)人員按BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，通過觀察大鼠的髖、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運(yùn)動(dòng)及協(xié)調(diào)情況，判斷損傷大鼠分?jǐn)?shù)。1分：1或兩個(gè)關(guān)節(jié)輕微運(yùn)動(dòng)，通常為髖和/或膝關(guān)節(jié)；2分：1個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)或1個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)且有另一關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)；3分：兩個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)。

1.6 動(dòng)物取材及指標(biāo)檢測(cè)

大鼠在實(shí)驗(yàn)治療結(jié)束后，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，然后斷頭處死，于冰盒上快速取出損傷處脊髓，長度約4 cm，從損傷中心處迅速切開，置入4%多聚甲醛緩沖液中固定后4℃冰箱備用。經(jīng)脫水、透明、透蠟、包埋、切片及烘干等步驟制備石蠟切片，層厚5 μm。常規(guī)切片脫蠟至水，切片用吸水紙擦干，免疫組化筆在組織周圍畫圈，防止滴加液體外溢。將切片置于濕盒內(nèi)，每張切片滴加0.5%的甲酚紫溶液直至覆蓋整個(gè)組織，室溫下染色10 min。取出切片，蒸餾水快速?zèng)_洗，然后置于0.25%冰醋酸乙醇溶液中，分化數(shù)秒。常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色效果，并于200倍鏡下拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

BBB評(píng)分結(jié)果顯示，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著降低，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療3天、7天、14天時(shí)間點(diǎn)，夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分升高，與模型組比較差異顯著(P<0.05)。并且治療14天組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分與3天組比較差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組能改善大鼠脊髓損傷后肢體運(yùn)動(dòng)功能，治療14天后療效更加顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較只鼠/組) 注：與假手術(shù)組比較,#P<0.05；與模型組比較,*P<0.05；與3 d亞組比較,△P<0.05

2.2Nissl染色觀察各組大鼠脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞變化結(jié)果

尼氏小體主要分布在胞漿中，染色后可呈藍(lán)紫色，是神經(jīng)細(xì)胞功能活性的形態(tài)指標(biāo)，尼氏小體數(shù)量多，表明神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)功能較強(qiáng)。染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，尼氏體數(shù)量較多，分布清晰，排列整齊，胞體呈斑駁的藍(lán)紫色染色。1天的模型組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞體腫脹變形或萎縮，細(xì)胞核周邊尼氏小體腫脹破碎，大量集聚，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少；夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組損傷略輕，損傷神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，保留的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較好。3天的模型組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，胞體中央因尼氏小體從核周逐漸消失呈泥沙樣，甚至染色已不明顯，損傷神經(jīng)細(xì)胞明顯增多；夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組細(xì)胞形態(tài)略好于模型組，尼氏小體相對(duì)模型組略有增加，染色加深，損傷神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。7天的模型組神經(jīng)細(xì)胞緊縮，尼氏小體數(shù)量減少，胞漿染色變淺；夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較好，可見尼氏小體數(shù)量明顯增加、集聚，胞漿深染。14天的模型組神經(jīng)細(xì)胞胞體緊縮，尼氏小體有所增加，胞漿深染；夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增加，形態(tài)較正常，尼氏小體數(shù)量明顯增多呈斑塊狀，胞漿濃染，胞核可見?？梢?，ASCI后給予夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療，能降低神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，改善神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，防止尼氏小體破碎溶解，增加其數(shù)量，提高神經(jīng)細(xì)胞功能活性。見封三彩圖2。

3 討論

急性脊髓損傷的發(fā)病機(jī)制主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩大類，脊髓損傷后多種不利因素均通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡或者抑制神經(jīng)細(xì)胞功能而導(dǎo)致嚴(yán)重的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙。由此可見，受損脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整是ASCI肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。尼氏小體廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞胞體和軸突內(nèi)，是神經(jīng)細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)之一，尼氏小體的功能主要是合成蛋白質(zhì)。在生理情況下，尼氏小體體積較大，而且數(shù)量多，說明神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)；相反，在神經(jīng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，尼氏小體的數(shù)量會(huì)減少甚至消失。因此，尼氏小體的數(shù)量和形態(tài)能夠反應(yīng)急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)。前期研究表明[11]，ASCI后1h即可有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的改變，因此積極尋求臨床有效干預(yù)手段、增加ASCI后神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體數(shù)量、恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞功能，對(duì)后期肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)具有重要意義。

甲強(qiáng)龍是目前臨床應(yīng)用廣泛的ASCI治療藥物之一，其作用機(jī)制主要包括減輕水腫、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、抑制脂質(zhì)過氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等。盡管NASCS通過3項(xiàng)大規(guī)模的臨床研究制定了甲強(qiáng)龍?jiān)谥委烝SCI患者時(shí)的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，有學(xué)者研究結(jié)果顯示在ASCI后48h以內(nèi)使用NASCSIII推薦的劑量治療后對(duì)患者神經(jīng)功能的康復(fù)療效甚微，然而卻增加了傷口感染以及重癥肺炎等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[13]，因此，這一臨床治療方案亟待優(yōu)化。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性脊髓損傷導(dǎo)致的截癱是由于督脈受損導(dǎo)致經(jīng)脈不通、陰陽失調(diào)、氣血不達(dá)四末、筋脈肌肉失于氣血濡養(yǎng)而致痿廢不用。夾脊穴位于督脈兩側(cè)，內(nèi)夾督脈，外循膀胱，督脈為人體“陽脈之?！?，具有總督一身之陽經(jīng)、調(diào)節(jié)陽經(jīng)經(jīng)氣的作用；而膀胱經(jīng)為多血之經(jīng)，并行于督脈調(diào)節(jié)人體后部之陽氣。夾脊電針可以疏通督脈及膀胱經(jīng)之經(jīng)氣，起到振奮陽氣使陰陽調(diào)和的作用，經(jīng)氣上下貫通，陽氣得以通達(dá)四末，則痿病可愈。臨床研究發(fā)現(xiàn)[14]，夾脊電針能改善脊髓損傷患者下肢肢體運(yùn)動(dòng)功能，治療前后ASIA運(yùn)動(dòng)評(píng)分、改良的Bathel指數(shù)均有明顯升高，而改良的Ashworth指數(shù)明顯下降。尹洪娜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，夾脊電針治療能夠抑制脊髓損傷大鼠CHOP的表達(dá)，從而改善線粒體功能，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠BBB評(píng)分較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)；經(jīng)治療后，夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組3天、7天、14天亞組BBB評(píng)分顯著升高(P<0.05)。Nissl染色結(jié)果可見，模型組大鼠1天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，尼氏小體腫脹破碎，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少；3天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞胞體破壞明顯，核仁消失，受損神經(jīng)細(xì)胞明顯增多；7天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞緊縮，尼氏小體溶解破碎，數(shù)量減少；14天時(shí)神經(jīng)細(xì)胞緊縮更加明顯，胞漿深染。而夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍組尼氏小體破碎溶解減輕，尼氏小體數(shù)量較模型組增多，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較好。宋良玉[16]研究也發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)能夠修復(fù)脊髓損傷大鼠脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞，增加神經(jīng)細(xì)胞中尼氏小體的數(shù)量，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，ASCI后運(yùn)用夾脊電針聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療可以顯著改善肢體運(yùn)動(dòng)功能，其作用機(jī)制可能與增加尼氏小體數(shù)量有關(guān)，從而改善脊髓神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,編號(hào)：81373715；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目,編號(hào)：2016RAXYJ090。

李曉寧(1969-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師,研究方向：針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

R246.6

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1005-0779(2016)12-0061-04

2016-07-25