王和生，周 姍，劉蘭英△，吳文忠，張 聰，劉成勇，秦 珊，陳 棟

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.連云港市中醫(yī)院，江蘇 連云港 222000)

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臨床研究

穴位貼敷對合并過敏性鼻炎的哮喘緩解期血清miRNAs影響的研究*

王和生1，周 姍2，劉蘭英1△，吳文忠1，張 聰1，劉成勇1，秦 珊1，陳 棟1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.連云港市中醫(yī)院，江蘇 連云港 222000)

目的：根據(jù)前期研究篩選出的與合并過敏性鼻炎哮喘密切相關(guān)的8種miRNAs，觀察穴位貼敷治療對其含量影響。方法：選取本院2015年夏季穴位貼敷哮喘患者，按有無過敏性鼻炎，分為合并過敏性鼻炎組17例，單純哮喘組17例，均使用咳喘停藥貼穴位貼敷治療;15例健康人作為健康組對照。采用RT-PCR法觀察3組治療前后8種血清miRNAs水平變化情況。結(jié)果：治療前，合并過敏性鼻炎組及單純哮喘組的血清miR-200a-3p水平均顯著低于健康組，miR-95以及miR-34a-5p水平均顯著高于健康組。與治療前比較，單純哮喘組與合并過敏性鼻炎組治療后的血清miR-200a-3p水平有升高趨勢，但無顯著性差異；血清miR-95、miR-34a-5p水平有下降趨勢，亦無顯著性差異。其余5種miRNAs治療前后均無顯著性差異。結(jié)論：miR-200a-3p、miR-95以及miR-34a-5p與哮喘的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性，穴位貼敷治療對其具有一定的影響。

穴位貼敷；miRNAs；哮喘；咳喘停藥貼；過敏性鼻炎

支氣管哮喘(簡稱哮喘)，發(fā)病率近年來呈上升趨勢，且該病具有病程遷延、反復(fù)發(fā)作等特點，現(xiàn)已成為全球性的健康問題[1]。哮喘與過敏性鼻炎是呼吸系統(tǒng)常見病，常相兼為病，同屬呼吸道變態(tài)反應(yīng)性炎癥性疾病[2]。合并過敏性鼻炎的哮喘治療更趨復(fù)雜性。microRNA(miRNA)是一種微小RNA，大多數(shù)人類疾病，如各種類型感染、慢性炎癥等都有miRNA表達(dá)和功能異常[3]。有研究認(rèn)為[4]，多種miRNAs可能與哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性，其可通過影響IL-4、IL-5等促炎細(xì)胞因子影響氣道的炎癥反應(yīng)。筆者的前期小樣本研究中，對單純哮喘、合并過敏性鼻炎哮喘患者以及健康人的血清，進(jìn)行了miRNAs芯片的初步篩選，發(fā)現(xiàn)與健康人比較，兩組哮喘患者有8種miRNAs表達(dá)明顯，主要有miR-543、miR-200a-3p、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-95、miR-421和miR-34a-5p。本研究擬擴(kuò)大樣本量，采用RT-PCR法探討穴位貼敷治療對這8種miRNAs的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至8月間，本院針灸康復(fù)科門診夏天咳喘停藥貼穴位貼敷治療的哮喘患者，按有無過敏性鼻炎，分為合并過敏性鼻炎組、單純哮喘組以及健康組，根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)，最終選取合并過敏性鼻炎組17例，其中男性9例，女性8例，平均年齡(53.48±9.57)歲，哮喘平均病程(13.95±11.69)年；單純哮喘組17例，其中男性10例，女性7例，平均年齡(50.19±10.69)歲，哮喘平均病程(14.25±10.14)年；健康組15例，其中男性7例，女性8例，平均年齡(42.12±9.13)歲。3組資料比較，性別、年齡、病程均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

哮喘的診斷參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會哮喘組制定的《哮喘患者防治指南(2008)》[5]；過敏性鼻炎的診斷參照WHO變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥14歲，≤75歲的哮喘緩解期患者，有或無過敏性鼻炎病史；③自愿知情同意參加本試驗者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并有嚴(yán)重心、肝、腎疾患和支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、血糖控制不佳的糖尿病患者等疾病；②妊娠或哺乳期婦女；③治療期間哮喘急性發(fā)作患者，不能配合治療者；④貼敷后皮膚局部出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷、破潰難以愈合者。

1.5 治療方法

合并過敏性鼻炎組與單純哮喘組兩組治療方法相同?？却Ｋ庂N：由本院制劑部制備。藥物組成：延胡索、白芥子、細(xì)辛、生甘遂、麻黃、牙皂、肉桂、丁香、葶藶子，按2∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1比例打粉過篩，后加生姜汁及液態(tài)凡士林混合，做成直徑1 cm、質(zhì)量約為3 g的丸狀藥，置于5 cm×5 cm膠布中心。取穴：雙側(cè)定喘、肺俞、膈俞、脾俞、腎俞。貼敷時間：從夏至開始至末伏結(jié)束，每隔5天貼1次，共貼10次，每次留藥6 h左右，要求盡量在初伏第1天、中伏第1天和末伏第1天此3天進(jìn)行穴位貼敷治療。健康組不予貼敷治療。

1.6 觀察指標(biāo)

RT-PCR法檢測血清miRNAs水平。血液采集：3組分別于治療前及最后1次治療后采集靜脈血液5 ml，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清血清-70 ℃條件下儲存；提?。?5000 r/min轉(zhuǎn)速再次離心10 min，取上清液，磁珠法循環(huán)提取核酸；逆轉(zhuǎn)錄；熒光定量檢測，記錄并計算CT值結(jié)果。miRNAs檢測試劑盒由上海灝勤生物科技有限公司提供。

1.7 統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后血清miR-200a-3p水平變化情況

①治療前，合并過敏性鼻炎組與單純哮喘組血清miR-200a-3p水平均顯著低于健康組(P<0.05)；兩哮喘組比較，無顯著性差異(P>0.05)；②與治療前比較，合并過敏性鼻炎組及單純哮喘組治療后血清miR-200a-3p水平均有升高趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 治療前后血清miR-200a-3pCT值比較

注：與健康組比較，P<0.05

2.2 治療前后血清miR-95水平變化

①治療前，合并過敏性鼻炎組與單純哮喘組血清miR-95水平均顯著高于健康組(P<0.05)；兩哮喘組比較，無顯著性差異(P>0.05)；②與治療前比較，合并過敏性鼻炎組及單純哮喘組治療后血清miR-95水平均有下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.3 治療前后血清miR-34a-5p水平變化

①治療前，合并過敏性鼻炎組與單純哮喘組血清miR-34a-5p水平均顯著高于健康組(P<0.05)；兩哮喘組比較，無顯著性差異(P>0.05)；②與治療前比較，合并過敏性鼻炎組及單純哮喘組治療后血清miR-34a-5p水平均有下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

表2 治療前后血清miR-95CT值比較

注：與健康組比較，P<0.05

表3 治療前后血清miR-34a-5pCT值比較

注：與健康組比較，P<0.05

2.4 治療前后血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421水平變化情況

①與健康組比較，治療前單純哮喘組與合并過敏性鼻炎組的血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421水平均無顯著性差異(P>0.05)；兩哮喘組比較，無顯著性差異(P>0.05)；②與治療前比較，合并過敏性鼻炎組及單純哮喘組治療后血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421水平均無顯著性差異(P>0.05)。見表4。

3 討論

“異病同治”理論早期可見于《內(nèi)經(jīng)》，漢·張仲景將其從辨證治療方法發(fā)展到方藥運用。穴位貼敷治療合并過敏性鼻炎哮喘，充分體現(xiàn)了“異病同治”的思想。首先，過敏性鼻炎與哮喘雖屬兩種不同疾病，但中醫(yī)認(rèn)為，“肺開竅于鼻”，肺、氣道、喉、鼻統(tǒng)稱為“肺系”?！锻馀_秘要》記載:“風(fēng)乘肺，氣不還鼻，則壅津寒液?！备砻鞅遣∨c肺病的密切相關(guān)性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“一個氣道、一種炎癥”“變應(yīng)性鼻炎(即過敏性鼻炎)—哮喘綜合征”等相關(guān)概念也形象體現(xiàn)了兩者的密切相關(guān)性[7]。其次，從穴位及藥物運用上，這兩種疾病的選穴及用藥相同。目前，三伏天穴位貼敷是臨床上常見的防治過敏性鼻炎及哮喘的有效方法之一，其所選穴位及藥物組成多見于《張氏醫(yī)通》[8]。本研究所選穴位，如定喘、肺俞、膈俞、脾俞、腎俞穴等，多屬膀胱經(jīng)背俞穴，對肺、脾、腎等功能起補益、調(diào)節(jié)等作用。而貼敷所選藥物白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛等，具有溫肺化痰作用。并且生甘遂、白芥子等，對皮膚具有一定的刺激作用，可加速藥物的透皮吸收及藥物對穴位的刺激作用。

表4 治療前后血清miR-543、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-421CT值比較

miRNAs是近些年研究的熱點，它的主要作用過程是miRNA結(jié)合到相應(yīng)mRNA的3’未翻譯區(qū)來抑制蛋白翻譯和介導(dǎo)mRNA的降解，從而實現(xiàn)對靶基因mRNA翻譯的調(diào)節(jié)[9]。研究認(rèn)為[10]，miRNAs在哮喘的發(fā)病中也具有一定的調(diào)控作用。而與呼吸系統(tǒng)相關(guān)的miRNAs種類較多，許多仍需進(jìn)一步驗證。筆者前期研究中，分別隨機(jī)選取單純哮喘、合并過敏性鼻炎哮喘及健康人各3例，通過miRNAs芯片分析，發(fā)現(xiàn)與健康人比較，有8種miRNAs表達(dá)明顯，可能參與哮喘的病程，主要為miR-543、miR-200a-3p、miR-605、miR-190a、miR-485-3p、miR-95、miR-421、miR-34a-5p。其中，與健康人比較，miR-605、miR-190a、miR-543、miR-485-3p表達(dá)下調(diào)至少2倍以上，而miR-200a-3p、miR-95、miR-34a-5p、miR-421表達(dá)上調(diào)至少2倍以上。這與目前報道[4]的與哮喘相關(guān)的常見miRNAs：miR-21、miR-155、miR-146、miR-145、let-7等不完全一致。

本研究中，治療前，與健康組比較，單純哮喘組與合并過敏性鼻炎組的血清miR-200a-3p水平均顯著降低(P<0.05)，而miR-95以及miR-34a-5p水平均顯著升高(P<0.05)。表明血清miR-200a-3p、miR-95以及miR-34a-5p與哮喘相關(guān)，且哮喘時，血清miR-200a-3p水平下調(diào)，miR-95以及miR-34a-5p水平上調(diào)。而與治療前比較，治療后的兩組哮喘的血清miR-200a-3p水平雖無顯著性差異，但有升高趨勢，而血清miR-95、miR-34a-5p水平亦無顯著性差異，但有下降趨勢。這表明穴位貼敷對血清miR-200a-3p、miR-95以及miR-34a-5p具有一定的影響，它們可能參與了穴位貼敷治療哮喘的作用機(jī)制。因關(guān)于穴位貼敷對miRNAs影響的報道極少，這3種miRNAs為筆者首次報道。

本研究中，與健康人比較，哮喘患者的血清miR-200a-3p水平下調(diào)，這與前期研究結(jié)果不相一致，未來可在進(jìn)一步研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證。另一方面，穴位貼敷后，患者的血清miRNAs未見明顯改變，分析原因，可能與觀察時間短或樣本量不足有關(guān)，未來研究會延長觀察時間以及增加樣本量。

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Effect of Acupoint Sticking Therapy on Serum miRNAs of Asthma Patients with Allergic Rhinitis

WANG He-sheng1,ZHOU Shan2,LIU Lan-ying1△,WU Wen-zhong1,ZHANG Cong1,LIU Cheng-yong1,QIN Shan1,CHEN Dong1

(1.TheAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;2.LianyungangChineseMedicineHospital,Lianyungang222000,China)

Objective：According to preliminary studies select eight miRNAs of asthma patients with allergic rhinitis,and to observe the effect of acupoint sticking therapy on them.Methods：Kechuanting paste acupoint sticking therapy was used for 17 asthma patients with allergic rhinitis and 17 asthma patients from our hospital in the summer of 2015,with 15 healthy persons as the control group. Use RT-PCR to detect blood miRNAs level before and after treatment.Results：Before treatment, serum miR-200a-3p levels of the combined allergic rhinitis group and simple asthma group was significantly lower than that of the healthy group,and miR-95 and miR-34a-5p were significantly higher than those of the healthy group. Compared with that before treatment, serum miR-200a-3p of the simple asthma group and combined allergic rhinitis group after treatment tended to increase, but there was no significant difference; serum miR-95 and miR-34a-5p levels had a downward trend, but there was no significant difference. MiRNAs of other five kinds before and after treatment had no significant difference.Conclusion：miR-200a-3p, miR-95 and miR-34a-5p have a certain relevance to asthma, and acupoint sticking therapy has a certain influence on them.

Acupoint pasting;miRNAs;Asthma;Kechuanting paste;Allergic rhinitis

國家自然科學(xué)基金項目，編號：81674065；國家自然科學(xué)基金青年基金項目，編號：81102632；江蘇省人力資源與社會保障廳項目,編號：2014-WSN-015；“十二五”國家科技支撐項目,編號：2015BAI04B11。

王和生(1965-)，男，主任中醫(yī)師，主要從事針灸推拿臨床工作。

△通訊作者：劉蘭英(1974-)，女，主任中醫(yī)師，主要從事針灸推拿臨床工作。

R246.81

A

1005-0779(2016)12-0001-03

2016-07-15