郭婉姝， 邢曉娜， 王 楠， 曹云鵬

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補體C3d-p28增強阿爾茨海默病DNA疫苗Th2型免疫反應(yīng)的研究

郭婉姝1， 邢曉娜1， 王 楠1， 曹云鵬2

目的 探討補體C3d-p28作為分子佐劑，在阿爾茨海默病DNA疫苗免疫反應(yīng)中的作用。方法 分別將重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10，p(Aβ3-10)10- C3d-p28.3和 空載體pcDNA3.1(+)用肌肉注射的方法免疫8～10周齡的雌性BALB/c鼠。質(zhì)粒注射前24 h，布比卡因肌肉注射誘導輕微的肌肉變性。應(yīng)用ELISA方法檢測血清抗Aβ抗體的滴度、抗體分型、體外脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-4 和 IFN-γ的含量。免疫組織化學染色法檢測免疫血清與轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑的結(jié)合能力。結(jié)果 重組質(zhì)粒疫苗p (Aβ3-10)10僅誘導出低滴度的抗Aβ抗體，產(chǎn)生了Th1/Th2混合型的免疫反應(yīng)。而重組質(zhì)粒疫苗p (Aβ3-10)10- C3d-p28.3誘導出較高滴度的抗Aβ抗體，體外脾細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ低和IL-4高，即引起了Th2型細胞免疫反應(yīng)，同時產(chǎn)生的抗Aβ抗體能夠與雙轉(zhuǎn)基因鼠APP/PS1腦中沉積的Aβ斑塊結(jié)合。結(jié)論 補體C3d-p28分子佐劑能夠增強抗Aβ抗體的產(chǎn)生并且誘發(fā)Th2型的免疫反應(yīng)。

阿爾茨海默??； β淀粉樣蛋白； DNA疫苗； C3d-p28分子佐劑

Aβ的基因免疫治療，阻止Aβ產(chǎn)生、聚集和(或)增加Aβ清除被認為是治療阿爾茨海默病的有效策略。一個理想的Aβ疫苗，不僅要刺激機體產(chǎn)生能夠起治療作用的抗Aβ抗體，還要避免不恰當?shù)腡h1型免疫反應(yīng)引起的腦膜腦炎等副作用。引入恰當?shù)幕蜃魟┛梢栽黾涌乖岢屎蜋C體對抗原的免疫應(yīng)答能力，把免疫應(yīng)答導向Th2 方向。補體C3d能夠促進抗體的產(chǎn)生及其親和力的成熟[1]，誘發(fā)更強烈的體液免疫反應(yīng)[2]。而且C3d分子可降調(diào)節(jié)免疫活性細胞Th1型細胞因子的表達水平，升調(diào)節(jié)Th2型細胞因子的表達[3]。補體C3d分子與CR2特異性結(jié)合的結(jié)合域位于C3d分子1209-1236aa區(qū)域(C3d-p28)，p28分子與全長C3d分子有相似的佐劑性質(zhì)[4]，但p28分子大小僅占C3d分子全長的9%[5]，這更增強了DNA疫苗的有效利用。本研究旨在探討補體C3d-p28作為分子佐劑，對阿爾茨海默病DNA疫苗免疫反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 動物 18只、8～10周齡、雌性BALB/c鼠購于中國醫(yī)科大學實驗動物研究中心。

1.1.2 主要材料 重組質(zhì)粒疫苗p(Aβ3-10)10和重組質(zhì)粒疫苗p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3由湖南長沙贏潤生物技術(shù)有限公司合成?？笰β抗體6E10 (Signet，美國)；羊抗鼠IgG1-HRP (Zymed，美國)；羊抗鼠IgG2a-HRP (Zymed，美國)；羊抗鼠IgG2b-HRP (Zymed，美國)；小鼠白介素-4 ELISA試劑盒(R&D Systems China Co.Ltd.，上海)；小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(R&D Systems China Co.Ltd.，上海)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 8～10周齡雌性BALB/c鼠共18只，按隨機數(shù)字表法分成3組，每組6只。第一組：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組；第二組：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組；第三組：空載體pcDNA3.1(+)組。

1.2.2 免疫方法 采用肌肉注射法。注射部位：小鼠左后腿股四頭肌。重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組：注射疫苗抗原濃度為1.0 μg/ μl，每只鼠注射體積為100 μl，一次注射疫苗100 μg?？蛰d體pcDNA3.1(+)組：注射疫苗抗原濃度為1.0 μg/ μl，每只鼠注射體積為100 μl，一次注射疫苗100 μg。每次注射以上兩組重組質(zhì)粒疫苗前1 d注射部位用布比卡因進行預(yù)處理：布比卡因配制濃度5 mg/ml，一只小鼠一次注射50 μl(250 μg)。三組小鼠疫苗注射前均需腹腔注射10%水合氯醛(0.03 mg/kg)進行麻醉。三組小鼠共免疫5次，每2 w免疫一次。

1.2.3 取血及血清樣本處理 疫苗接種前、從第2次注射開始每次接種后1 w取鼠眶靜脈血0.5 ml。采血后，血液置于37 ℃ 3～5 h，4 ℃下5000×g離心10 min，吸取上清，分裝-70 ℃凍存。

1.2.4 間接ELISA法檢測血清中抗Aβ抗體滴度及分型 (1)抗原包被96孔板，每孔加入100 μl 稀釋的Aβ42(5 μg/ml)，4oC孵育過夜；(2)用含有0.05%TW20的1×PBS(200 μl每孔)洗板3次，下同；(3)每孔中加入200 μl封閉緩沖液，室溫下孵育1 h；(4)免疫前和免疫后的血清以1∶1000(1 μl加入1 ml封閉緩沖液)稀釋，用封閉緩沖液封閉1 h后，洗板；(5)孔中加入50 μl稀釋的血清和標準抗體，然后室溫孵育3 h，洗板；(6)加入稀釋的二抗(IgG：1：2000；IgG1：1：2000，IgG2a：1：1000，IgG2b：1∶1000)，50 μl每孔；室溫下孵育1 h，洗板；(7)每孔中加入100 μl TMB，室溫下孵育15 min，或者是到顏色產(chǎn)生；(8)每孔中加入100 μl終止液(2N H2SO4)；(9)讀取450 nm處的OD值。

1.2.5 ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-4和IFN-γ的含量 步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.6 免疫組織化學染色方法檢測免疫血清與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑結(jié)合情況 (1)石蠟切片(APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦組織切片，4 μm)，60 ℃烤箱烤片1 h，切片常規(guī)脫蠟至水，；(2)30%H2O21份加蒸餾水10份混合，室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。(3)熱修復抗原。將切片進入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐加熱至沸騰。后斷電，間隔5～10 min后，反復2次。冷卻后PBS洗滌2次；(4)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；(5)滴加末次接種后的鼠血清，37 ℃ 1 h，PBS洗2 min×3次；(6)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ℃ 20 min，PBS洗2 min×3次；(7)滴加試劑SABC，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×4次；(8)DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5～30 min之間；(9)脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 血清抗Aβ抗體滴度及分型的檢測 經(jīng)重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠均產(chǎn)生了抗Aβ抗體，并且在第二次免疫后血清抗Aβ抗體的滴度平穩(wěn)增長，重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10從最初的5.09±1.42 μg/ml增長到：(26.11±8.55) μg/ml；重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組從最初的(10.46±4.35) μg/ml增長到(57.12±12.08) μg/ml。重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組的抗Aβ抗體的滴度高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組(P<0.05)，但是pcDNA3.1(+)免疫的小鼠未檢測出抗Aβ抗體(見圖1A)。

抗IgG1 抗體檢測：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10- C3d-p28.3組(32.25±6.78) μg/ml較重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組(10.33±3.01) μg/ml明顯增高(P<0.05)，但是抗IgG2a和IgG2b抗體檢測：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10- C3d-p28.3組(3.28 ± 1.54) μg/ml、(6.03± 2.17) μg/ml低于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組(7.02 ±2.56) μg/ml和IgG2b抗體(12.62± 4.73) μg/ml(見圖1B)。

重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10- C3d-p28.3組的IgG1/IgG2a的比值(9.83 ±1.18)明顯高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組(1.47 ±0.04)(P<0.05，圖1C)。

A：經(jīng)重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10、重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和空載體pcDNA3.1(+)免疫后小鼠的血清抗Aβ抗體滴度。B：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組抗Aβ抗體的分型：IgG1，IgG2a，IgG2b的含量。C：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組的IgG1/IgG2a的比值。*P<0.05，與重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組相比

圖1 抗Aβ抗體的滴度和分型分析

A：在相應(yīng)的自身抗原刺激下的脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-4的含量測定。*P<0.05，與空載體pcDNA3.1(+)組和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組相比。B：在相應(yīng)的自身抗原刺激下的脾細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量測定。*P<0.05，與重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組和空載體pcDNA3.1(+)組相比

圖2 脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IFN-γ的檢測

A：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10免疫后的血清能夠與12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑結(jié)合。B：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫后的血清能夠與Aβ斑結(jié)合。C：空載體pcDNA3.1(+)免疫后的血清不能與Aβ斑結(jié)合

圖3 免疫血清與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑結(jié)合能力的檢測

2.2 脾細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的檢測 脾細胞培養(yǎng)上清液中的IL-4含量：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組(82.26 ±9.94 pg/ml)明顯高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組(42.33 ± 6.78) pg/ml和pcDNA3.1(+)組(13.74±4.25) pg/ml(P<0.05)，而重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組略高于pcDNA3.1(+)組(P<0.05，圖2A)。

脾細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ含量測定：重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組(51.2 ±9.67) pg/ml高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組(29.77±7.76) pg/ml和pcDNA3.1(+)組(23.13±7.16) pg/ml(P<0.05)，而后兩組并沒有差異(P>0.05，圖2B)。

2.3 免疫血清與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)Aβ斑結(jié)合能力的檢測 重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫后的血清均能夠與12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠的腦內(nèi)Aβ斑結(jié)合(見圖3A、B)，但是重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10結(jié)合Aβ斑的能力明顯弱于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3?？蛰d體pcDNA3.1(+)免疫后的血清(見圖3C)不能與12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠的腦內(nèi)Aβ斑結(jié)合。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，編碼不同抗原基因(西尼羅病毒、乙肝病毒、豬生殖和呼吸綜合征病毒、瘧原蟲環(huán)孢子蛋白)的DNA疫苗在融合了C3d-p28分子佐劑后，抗原的免疫原性大大地增強了，DNA疫苗的有效性也大大提高[5～8]。因此，補體C3d-p28作為分子佐劑應(yīng)用前景廣闊。

本研究中，空載體pcDNA3.1(+)組沒有抗Aβ抗體的產(chǎn)生。而在第二次免疫后，重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組都產(chǎn)生了抗Aβ抗體，不過重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組產(chǎn)生的抗Aβ抗體量要明顯高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組，這說明融合了分子佐劑C3d-p28.3的Aβ疫苗免疫原性明顯強于無佐劑的Aβ疫苗。

重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組產(chǎn)生了以IgG1為主的抗體，IgG2a和 IgG2b的值較低，相對應(yīng)的重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組則產(chǎn)生了低水平的IgG1，略高水平的IgG2a和 IgG2b抗體，而且重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組IgG1/IgG2a的比值明顯高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組。據(jù)研究證實疫苗免疫后誘導的免疫球蛋白IgG的亞型可以間接反應(yīng)免疫反應(yīng)是Th1型還是Th2型。Th1型免疫反應(yīng)主要產(chǎn)生IgG2a抗體，通過產(chǎn)生IFN-γ，IL-2等細胞因子誘導細胞介導的炎癥反應(yīng)；而Th2型免疫反應(yīng)主要誘導IgG1抗體，通過產(chǎn)生IL-4，IL-5等細胞因子增強體液免疫反應(yīng)[9]。IgG1/IgG2a的比值可以反映出該Aβ疫苗所誘導的主要免疫應(yīng)答類型。本實驗中，融合了分子佐劑C3d-p28.3的Aβ疫苗產(chǎn)生了以IgG1為主的抗體，高比值的IgG1/IgG2a，這都傾向于Th2型免疫反應(yīng)；而無佐劑的Aβ疫苗產(chǎn)生了Th1/ Th2混合型的免疫反應(yīng)。

重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3疫苗免疫后，經(jīng)自身抗原刺激，脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-4高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組和空載體pcDNA3.1(+)組，脾細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組高于重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組和空載體pcDNA3.1(+)組，再次說明融合了分子佐劑C3d-p28.3的Aβ疫苗產(chǎn)生了Th2型免疫反應(yīng)，所以對于AD主動免疫治療，獲得一個主要的Th2型免疫反應(yīng)比單純提高抗Aβ抗體的滴度更為重要；而且，Th2型的抗體清除Aβ沉積更為有效，發(fā)生炎癥反應(yīng)的可能性更低[10]。

腦內(nèi)Aβ斑塊沉積是AD診斷的決定性指標，它的清除用來評價AD模型鼠的治療效果。一個12月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦切片用來檢測免疫血清產(chǎn)生的抗Aβ抗體與腦內(nèi)Aβ斑塊結(jié)合的能力。重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3疫苗和重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10疫苗免疫后的血清均能夠與12月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦切片的Aβ斑塊結(jié)合，而空載體pcDNA3.1(+)組的免疫血清不能夠與腦切片的Aβ斑塊結(jié)合。這說明了融合了分子佐劑C3d-p28.3的Aβ疫苗對腦內(nèi)Aβ斑塊產(chǎn)生了特異性的免疫反應(yīng)，并且這種能力強于無佐劑的Aβ疫苗。

總之，重組質(zhì)粒疫苗 p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，正因為融合了分子佐劑C3d-p28.3，不僅能夠刺激產(chǎn)生具有治療水平的抗Aβ抗體，還能夠誘發(fā)Th2型的免疫反應(yīng)，避免了炎癥副作用，最重要的是，產(chǎn)生的抗Aβ抗體能夠與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合。分子佐劑C3d-p28.3的作用機制正在研究中。

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Enhancement of Th2 Immune Response to Alzheimer’s disease DNA Vaccine by complement C3d-p28

GUO Wanshu，XING Xiaona，WANG Nan，et al.

(Department of Neurology，The People’s Hospital of Liaoning Province，Shenyang 110016，China)

Objective To discuss the effect of complement C3d-p28 in the immune response of Alzheimer DNA vaccine bstract. Methods Eight to ten week-old female BALB/c mice were immunized intramuscularly with recombinant plasmid p(Aβ3-10)10，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 and pcDNA3.1(+). 24 h prior to plasmid injection，bupivacaine was injected to induce mild muscle degeneration. ELISA was used to detect the titer of serum anti-Aβ antibody，isotypes of immunoglobulin and levels of IL-4 and IFN-γ in ex vivo splenocyte culture supernatants. Immunohistochemistry was used to detect the binding capability of antisera to Aβ plaques in an APP/PS1 transgenic mouse brain. Results We have successfully constructed two plasmid DNA vaccines：p(Aβ3-10)10 expressing ten repeats of Aβ3-10 without adjuvant and p(Aβ3-10)10- C3d-p28.3 encoding ten repeats of Aβ3-10 and three copies of C3d-p28 as a molecular adjuvant. Immunization of eight to ten week-old female BALB/c mice with p(Aβ3-10)10 vaccine induced only moderate titers of anti-amyloid-β antibodies and elicited a Th1/ Th2 immune response. However，adding of the C3d-p28 molecular adjuvant to Aβ3-10 DNA vaccine could generate high levels of anti-amyloid-β antibodies (P<0.05) which bound to Aβ plaques in APP/PS1 transgenic mouse brain tissue. More importantly，the vaccine elicited a predominantly IgG1 humoral response (P<0.05)，low levels of IFN-γ (P<0.05) and high levels of IL-4 in ex vivo cultured splenocytes (P<0.05)，indicating a Th2-polarized cellular immune response. Conclusion Complement C3d-p28 molecular adjuvant enhances anti-amyloid-β antibody generation and induces a Th2-polarized immune response.

Alzheimer’s disease； Amyloid-β； DNA vaccine； C3d-p28 molecular adjuvant

1003-2754(2016)11-0976-04

2016-07-28；

2016-10-06

(1.遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

曹云鵬，E-mail：ypengcao@yahoo.com

R749.1+6

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