王蒙 周楓 王興君 林穎 朱美嬋 于鋒

廣州市耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)院（廣州市第十二人民醫(yī)院）

廣州醫(yī)科大學(xué)耳鼻咽喉頭頸外科研究所

·臨床研究·

廣東地區(qū)非綜合征型耳聾突變基因流行病學(xué)調(diào)查

王蒙 周楓 王興君 林穎 朱美嬋 于鋒

廣州市耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)院（廣州市第十二人民醫(yī)院）

廣州醫(yī)科大學(xué)耳鼻咽喉頭頸外科研究所

目的 揭示廣東地區(qū)非綜合征型耳聾（Non-syndromic hearing loss，NSHL）患者的分子病因構(gòu)成，為規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的聾病篩查、預(yù)防及干預(yù)提供理論依據(jù)。方法對廣東地區(qū)507例NSHL患者抽取外周靜脈全血并提取基因組DNA，檢測中國人群中常見的4個耳聾基因9個突變位點。結(jié)果507例NSHL患者共檢出耳聾基因突變者115例（115/507，22.68%）。其中GJB2基因突變攜帶者48例，檢出率9.47%（48/507）：包含c.235 del C純合突變型6.31%（32/507），雜合突變型1.58%（8/507）；c.299 del AT純合突變型0.20%（1/507），雜合突變型0.40%（2/507）；c.235 del C/c.299 del AT復(fù)合雜合突變型0.99%（5/507）。SLC26A4基因59例，檢出率11.64%（59/507）：包含c.919-2 A＞G純合突變型3.16%（16/ 507），雜合突變型6.11%（31/507）；c.2168 A＞G純合突變型0.40%（2/507），雜合突變型1.38%（7/507）；c.919-2 A＞G/ c.2168 A＞G復(fù)合雜合突變型0.59%（3/507）。線粒體12S rRNA檢出8例（8/507，1.58%），均為m.1555 A＞G均質(zhì)型突變。結(jié)論SLC26A4是廣東地區(qū)NSHL人群最主要的致聾基因，c.919-2A＞G為其突變熱點；GJB2為引起該地區(qū)SNHL的第二位致聾基因，c.235delC為其突變熱點。

非綜合征型耳聾；基因檢測；基因芯片

Acknowledgments：This study was supported by the Science and Technology Program of Guangzhou(2014Y2-00119).

We thank the patients,their families and deaf-mute school children who participated in this study.

The authors declare that they have no conflicts of interest.

遺傳性耳聾已成為影響人類健康和生活質(zhì)量的常見原因，50%的兒童期耳聾患者與遺傳因素密切相關(guān)。遺傳性耳聾根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)器官疾病，分為綜合征型耳聾（Syndromic deafness，SHL）和非綜合征型耳聾（Non-syndromic hearing loss，NSHL）[1]，其中70%的遺傳性耳聾表現(xiàn)為非綜合征型耳聾。按遺傳方式，可將NSHL分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X染色體連鎖遺傳和線粒體突變耳聾[2]，約80%的NSHL為常染色體隱性遺傳[3]。

國內(nèi)外大量耳聾分子流行病學(xué)研究表明：GJB2、SLC26A4和線粒體12S rRNA是引起我國非綜合征型耳聾的常見基因，不同種族、不同地區(qū)的耳聾人群中致聾基因突變頻率存在明顯差異[4-8]。為了解廣東地區(qū)非綜合征型耳聾基因分子病因，本研究利用晶芯?九項遺傳性耳聾芯片試劑盒（微陣列芯片）對廣東地區(qū)非綜合征型耳聾患者進行篩查與分析，明確該地區(qū)的熱點致聾基因及其突變頻率。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取廣東地區(qū)（主要包括廣州、中山、肇慶、珠海等地）聾人學(xué)校及語訓(xùn)中心的非綜合征型耳聾患者507例，排除全身器質(zhì)性病變或合并其他遺傳疾病。其中男281例，女226例，年齡7～22歲（中位年齡13歲）。經(jīng)聲導(dǎo)抗、純音聽閾測試后，均為雙側(cè)重度或極重度感音神經(jīng)性聾。在醫(yī)生指導(dǎo)下填寫《耳聾病人信息登記表》獲取耳聾相關(guān)信息，包括患兒一般信息、出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個人史(耳聾前傳染病史、耳毒性藥物應(yīng)用史、頭部外傷史等)和母孕期情況等。所有患者或家長均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 主要儀器和試劑

血液基因組DNA提取試劑盒為晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（微陣列芯片法）購自北京天根生物工程有限公司，PCR儀（ABI 9700）、芯片雜交儀（Bio MixerTMⅡ）、芯片洗干儀（Slide Wash?erTM 8）、芯片掃描儀（Lux ScanTM 10K-B）購自北京博奧生物集團有限公司。

1.2.2 DNA提取

采集受檢者外周血2mL，應(yīng)用試劑盒提取DNA，試劑盒方法提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進行。用核酸定量儀（紫外分光光度計）檢測DNA濃度和純度（濃度l00～200ng HL，純度260nm/280nm= l.7～2.0）。標(biāo)本保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 耳聾基因芯片檢測方法

應(yīng)用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒，對GJB2（c.235 del C、c.176 del 16、c.299 del AT和c.35 del G）、SLC26A4（c.919-2 A＞G、c.2168 A＞G）、線粒體12S rRNA（m.1494 C＞T、m.1555 A＞G）、GJB3（c.538 C＞T）4個基因9個突變位點進行檢測。通過以人基因組DNA為模板，采用帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點特異性引物對相關(guān)基因位點所在的基因片段進行擴增和熒光標(biāo)記，與能夠識別相應(yīng)標(biāo)簽序列的通用基因芯片進行雜交。使用芯片掃描儀對結(jié)果進行判讀。具體操作按試劑盒說明書步驟進行。

1.2.4 顳骨CT檢查

對59例SLC26A4基因突變攜帶患者進行16排螺旋CT顳骨掃描，層厚/層距(mm):0.6/0.6，窗寬4000HU，窗位700HU，掃描范圍以聽眶上線為基線向上連續(xù)掃描。

2 結(jié)果

2.1 聽力檢查結(jié)果：根據(jù)純音聽閾結(jié)果顯示，廣東地區(qū)507例非綜合征型耳聾患者中，重度感音神經(jīng)性聾89例（17.55%）；極重度聾344例（67.85%）；全聾74例（14.60%）。

2.2 致聾基因突變檢測結(jié)果

507例非綜合征型耳聾患者中，共檢出遺傳性耳聾基因突變攜帶者115例（22.68%），67例患者明確為遺傳性耳聾。其中檢出GJB2基因突變攜帶者48例（48/507，9.47%）、SLC26A4基因突變攜帶者59例（59/507，11.64%）、線粒體12S rRNA突變攜帶者8例（8/507，1.58%）、未檢出GJB3基因突變（表1）。GJB2和SLC26A4檢出率最高（圖1），兩種基因突變攜帶數(shù)占基因突變攜帶總數(shù)的93.04%（107/115）。遺傳性耳聾基因芯片檢測結(jié)果見圖2。

表1 廣東地區(qū)507例SNHL患者耳聾基因突變檢出率Table.1 507 cases of SNHL patients’deafness gene mutation detection rate in Guangdong District

圖1 廣東地區(qū)507例非綜合征型耳聾患者耳聾相關(guān)基因突變檢出比例圖Fig.1 Scale map of 507 cases with SNHL patients’deafness gene mutation detection rate in Guangdong District

48例GJB2攜帶者均表現(xiàn)為極重度聾，c.235 del C純合突變型檢出率為6.31%（32/507），雜合突變型檢出率為1.58%（8/507）；c.299 del AT純合突變型檢出率為0.20%（1/507），雜合突變型檢出率為0.40%（2/507）；c.235 del C/c.299 del AT復(fù)合雜合突變型檢出率為0.99%（5/507）(表2)。c.235 del C突變攜帶數(shù)占GJB2基因突變攜帶總數(shù)的93.75%（45/48）。c.235 del C的等位基因頻率為7.59%（表3）。

59例SLC26A4攜帶者中，c.919-2 A＞G純合突變型檢出率為3.16%（16/507），雜合突變型檢出率為6.11%（31/507）；c.2168 A＞G純合突變型檢出率為0.40%（2/507），雜合突變型檢出率為1.38%（7/507）；c.919-2 A＞G/c.2168 A＞G復(fù)合雜合突變型檢出率為0.59%（3/507）(表2)。c.919-2 A＞G突變攜帶數(shù)占SLC26A4基因突變攜帶總數(shù)的84.75%（50/59）。c.919-2 A＞G的等位基因頻率為7.59%（表4）。顳骨CT診斷57例為前庭水管擴大，其中4例伴有雙側(cè)mondini畸形。

8例線粒體12S rRNA均為m.1555 A＞G均質(zhì)型突變，檢出率為1.58%（8/507）（表2）。

未檢出GJB3基因突變。

圖2 遺傳性耳聾基因芯片檢測結(jié)果Fig.2 Test of hereditary deafness gene chip

表2 廣東地區(qū)507例NHSL患者耳聾基因突變檢出結(jié)果Table 2 Mutation in 507 cases of SNHL patients’deafness in Guangdong District

3 討論

中國地域廣大、人口眾多具有人群總體基因復(fù)雜、地域差異大的特點，因此在各地區(qū)開展耳聾基因篩查，分析各區(qū)域的熱點突變特點，對完善我國耳聾基因分子病因構(gòu)成，為規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的聾病篩查、干預(yù)及預(yù)防提供理論依據(jù)。本次調(diào)查主要包括廣州、中山、肇慶、珠海等地的聾人學(xué)校及語訓(xùn)中心非綜合征型耳聾患者507例，具有一定的地域代表性，為廣東地區(qū)耳聾患者的致聾原因和熱點突變基因研究提供了資料。

GJB2是引起我國非綜合征型耳聾的主要致聾基因,可造成約50%的常染色體隱性遺傳性非綜合征性耳聾。據(jù)國內(nèi)大規(guī)模耳聾流病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國人群的GJB2基因突變率約為21%[9,10],熱點突變?yōu)閏.233-235 del C,其次為c.299-300 del AT及c.176 del 16bp[11]。本研究的507例NSHL患者中GJB2總突變率為9.47%，低于我國普查均值。其中c.235 del C突變檢出率最高為8.88%(45/507)；其次為c.299 del AT，檢出率為1.58%（8/507）；未檢測出c.35 del G、c.176 del 16bp突變。c.235 del C突變攜帶數(shù)占GJB2基因突變攜帶總數(shù)的93.75%（45/48），故將c.235 del C作為GJB2的熱點突變。針對該熱點突變，本文對比戴樸等（2007年）[12]的全國性調(diào)查數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)熱點突變頻度與全國一致,c.235 de1 C在檢測人群均有較高頻率的變異性；但廣東地區(qū)c.235 del C的等位基因頻率為7.59%，低于戴樸等的調(diào)查數(shù)據(jù)（12.00%）。

SLC26A4是僅次于GJB2的引起我國非綜合征性耳聾的致聾基因，總攜帶率約為14.5%[13,14]，可導(dǎo)致大前庭水管綜合征和Pendred綜合征，常見的位點為c.919-2 A＞G[15]和c.2168 A＞G。本研究中SLC26A4總突變率為11.64%，低于我國普查均值。而本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變率高于GJB2是引起廣東地區(qū)非綜合征型耳聾的最主要的原因。其中c.919-2 A＞G突變率最高為9.86%（50/507）,其次為c.2168 A＞G，突變率為2.37%(12/507)。c.919-2 A＞G突變攜帶數(shù)占SLC26A4基因突變攜帶總數(shù)的84.75%（50/59），為廣東地區(qū)SLC26A4基因的突變熱點，對比李琦等（2007年）[16]的全國性調(diào)查數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)熱點突變頻度與全國一致，c.919-2 A＞G突變的等位基因頻率為6.51%，低于李琦等人的調(diào)查數(shù)據(jù)(8.46%)。此外,經(jīng)過顳骨CT檢查僅有2例c.919-2 A＞G雜合突變聾兒的影像學(xué)未見前庭水管擴大或內(nèi)耳畸形其余57例聾兒均顯示為前庭水管擴大，檢出率高(96.61%，57/59)；不排除內(nèi)耳影像學(xué)正常的耳聾患者與SLC26A4基因的相關(guān)性。SLC26A4基因檢測結(jié)果對比顳骨CT檢查結(jié)果說明SLC26A4基因突變與大前庭水管密切相關(guān)。

線粒體12S rRNA引起的遺傳性耳聾屬于母系遺傳，與氨基糖苷類抗生素致聾相關(guān)，m.1555A＞G為主要突變方式[17-20]，國內(nèi)突變攜帶率分別為3.8%及0.6%[21]。本研究檢出m.1555A＞G均質(zhì)突變8例（1.58%），檢出率較低于全國普查均值，考慮可能與廣東地區(qū)經(jīng)濟相對發(fā)達，氨基糖苷類抗生素使用量較少有關(guān)。

4 小結(jié)

本文研究的507例非綜合征型耳聾患者檢測結(jié)果陽性率為22.68%，其中GJB2和SLC26A4檢出率占總檢出率的93.04%。其中SLC 26 A4是廣東地區(qū)非綜合征型耳聾人群最主要的致病基因，c.919-2A＞G為該基因突變的熱點；GJB2是引起廣東地區(qū)非綜合征型耳聾的第二位致聾基因，c.235delC為該基因突變的熱點；此外，線粒體12S rRNA也可導(dǎo)致該地區(qū)人群的非綜合征型耳聾。對廣東地區(qū)常見致聾基因進行篩查，確定耳聾患者及高危人群的遺傳因素，給予準(zhǔn)確的指導(dǎo)及干預(yù)，可一定程度上預(yù)防耳聾的發(fā)生。

表3 c.235delC等位基因頻率Table 3 Carrier frequency of c.235 del C mutation

表4 c.919-2 A＞G等位基因頻率Table 4 Carrier frequency of c.919-2A＞G mutation

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Epidemiological investigation of hot spot gene mutations among nonsyndromic deafness patients in Guangdong

WANG Meng,ZHOU Feng,WANG Xingjun,LIN Ying,ZHU Meichan,YU Feng
Hearing Center,Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Hospital of Guangzhou

Objective To determine the molecular causes of nonsyndromic hearing loss in Guangdong for the purposes of screening,prevention and intervention.Methods Patients with nonsyndromic hearing loss(n=507)received microarray-based testing for nine hot spot mutations in four of the most common deafness-related genes.Results The incidence of genetic errors was 22.68%(115/507).Among the patients,9.47%(48/507)showed defects in GJB2.The detection rate was 6.31%(32/507)for homozygous c.235 del C mutation,1.58%(8/507)for heterozygous mutation,0.20%(1/507)for homozygous c.299 del AT mutation,0.40%(2/507)for heterozygous mutation and 0.99%(5/507)for composite heterozygous c.235 del C/c.299 del AT mutation.Defects in SLC26A4 were seen in 11.64%(59/507)of the cases,3.16%(16/507)for homozygous c.919-2 A＞G mutation,6.11%(31/507)for heterozygous mutation,0.40%(2/507)for homozygous c.2168 A＞G mutation,1.38%(7/507)for heterozygous c.2168 A＞G mutation,and 0.59%(3/507)composite heterozygous c.919-2 A＞G/ c.2168 A＞G mutation.mtDNA 12SrRNA defects were detected in 1.58%(8/507)of the cases and all were m.1555A＞G mutation.Conclusions Our results demonstrate that SLC26A4(c.919-2A＞G)mutation is the primary genetic cause and GJB2 (c.235delC)mutation is a major genetic cause of nonsyndromic deafness in Guangdong.

Non-syndromic deafness;Genetic testing;Gene Chip

R764.43

A

1672-2922（2016）05-644-5

2015-12-30審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.018

廣州市科技計劃項目（2014Y2-00119）

王蒙，本科，初級技師，研究方向:聽力學(xué)王蒙和周楓為并列第一作者

周楓，Email：zhoufengguangzhou@163.com