吳世樂 郭亞民 趙順云 王皓 安永德 劉林勛

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沉默胰腺癌PANC1細(xì)胞DcR3表達(dá)對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響

吳世樂 郭亞民 趙順云 王皓 安永德 劉林勛

胰腺癌是常見消化道惡性腫瘤之一，起病隱匿、早期臨床癥狀不典型、診斷難度較高，加之其侵襲性較強(qiáng)、惡性程度較高，導(dǎo)致手術(shù)腫瘤切除、放療和(或)化療的療效不佳，患者預(yù)后較差[1-2]，病死率居各類惡性腫瘤第4位[3]，因此尋找早期診斷的特異性基因，對(duì)評(píng)估胰腺癌病情和提供分子靶向治療潛在“靶點(diǎn)”具有極其重要的意義。誘騙受體3(DcR3)屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor, TNFR)超家族成員之一，在多種腫瘤組織過度表達(dá)，具有抑制細(xì)胞凋亡和促腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的功能[4]，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有密切相關(guān)性。本研究應(yīng)用RNA干擾方法沉默胰腺癌PANC1細(xì)胞DcR3的表達(dá)，觀察DcR3基因沉默后T淋巴細(xì)胞功能的變化。

一、材料與方法

1．靶向DcR3表達(dá)載體的構(gòu)建：依照GenBank內(nèi)DcR3基因序列(No：NM_003823)設(shè)計(jì)、合成靶向DcR3基因的shRNA，通過BLAST數(shù)據(jù)庫分析該片段和其他分子無同源性，委托廣州市銳博生物科技有限公司合成。shRNA上游序列5′-GTCATCGACTITGAGTGAAGCCACAGATGTAGAAAGCC-ACAAAGTCGATGACG-3′，下游序列5′-7TACACGCAGTTCTG-GAACTACAGTGAAGCCACAGATGTAGTAGTTCCAGAACTGC-GTGTAG-3′，退火后構(gòu)成雙鏈，插入線性化的含有綠色熒光蛋白(GFP)的載體PP-GFP(美國(guó)Abcam公司)，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.Coli TOPl0細(xì)胞，置于含壯觀霉素LB瓊脂糖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)16 h，提取小量質(zhì)粒，經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切及測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命名為PP-GFP-DcR3。

2．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合達(dá)50%～70%時(shí)，應(yīng)用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)將重組質(zhì)粒PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒PP-GFP轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組。

3．細(xì)胞DcR3 mRNA表達(dá)檢測(cè)：取上述各組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)細(xì)胞DcR3 mRNA表達(dá)。DcR3探針引物為5′-FAM-CTCCTCAGCTCCTGGTACCCT-TAMRA-3′，上游引物為5′-CTCTTCCTCCCATGACAC-3′，下游引物為5′-CTGGAAAGCCACAAAGTC-3′，擴(kuò)增片段112 bp。以β-actin為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、62℃ 1 min、60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4．細(xì)胞培養(yǎng)上清DcR3、IFN-γ、IL-4 含量檢測(cè)：取上述各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA法測(cè)定DcR3、IFN-γ、IL-4含量，試劑盒購(gòu)自BD公司，按照試劑盒說明書操作，最后上酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(A450)值。

5．CD4+、CD8+T細(xì)胞檢測(cè)：抽取健康者外周血20 ml，滴入含肝素抗凝試管，淋巴分離液分離獲取淋巴細(xì)胞，應(yīng)用抗CD3抗體包被培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，置于含胎牛血清1 ml、植物血凝素(PHA)10 μg、青霉素500 U、鏈霉素500 μg的RPMI1640培養(yǎng)液4 ml內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)6 h。調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為1×109/L，分別與上述3組細(xì)胞按照10∶1比例混合培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基加入2.5 mg/L PHA、500 U/ml IL-2各5 ml，常規(guī)培養(yǎng)72 h。收集、重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/ml，取300 μl細(xì)胞懸液加入試管，加300 μl 8%多聚甲醛，混合后避光反應(yīng)20 min，PBS洗滌細(xì)胞，離心棄上清，加300 μl皂泰，10 μl異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4單抗(CIM-F1TC，BD公司)或藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD8單抗(CD8-PE，BD公司)避光孵育15 min，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光細(xì)胞數(shù)。每個(gè)樣品檢測(cè)30 000個(gè)以上細(xì)胞，通過儀器自帶軟件計(jì)算CD4+、CD8+T細(xì)胞比例。

二、結(jié)果

1．各組細(xì)胞DcR3mRNA表達(dá)及培養(yǎng)上清DcR3 蛋白含量的變化：PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組、PP-GFP轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組PANC1細(xì)胞DcR3mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.24±0.03、1.08±0.05、1.03±0.06；培養(yǎng)上清DcR3 蛋白含量分別為(21.22±3.21)、(80.13±7.08)、(79.20±8.23)ng/L。PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組顯著低于PP-GFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為54.321、60.182，P值均<0.05)，而PP-GFP轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．各組細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4含量變化：PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組、PP-GFP轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組PANC1細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量分別為(21.73±2.41)、(15.43±3.10)、(14.95±4.21)ng/L；IL-4含量分別為(3.01±0.57)、(5.22±0.83)、(5.09±0.91)ng/L。PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組IFN-γ含量顯著高于其他兩組，而IL-4含量顯著低于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為40.128、37.432，P值均<0.05)。

3．各組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化：PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組、PP-GFP轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組刺激健康者淋巴細(xì)胞后，CD4+T細(xì)胞占比分別為(46.20±2.81)%、(28.60±2.52)%、(27.35±2.31)%，PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組顯著高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.231，P<0.05)；而其他CD8+T細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.623，P>0.05，圖1)。

圖1 PP-GFP-DcR3轉(zhuǎn)染組(1A、1D)、PP-GFP轉(zhuǎn)染組(1B、1E)、未轉(zhuǎn)染組(1C、1F)刺激健康者淋巴細(xì)胞后CD4+、CD8+T細(xì)胞的分布

討論 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和機(jī)體免疫功能狀態(tài)相關(guān)，免疫功抑制性功能障礙可顯著增加腫瘤的發(fā)生率[5]。機(jī)體免疫功能受到多種免疫監(jiān)視調(diào)控，其中包括特異性和非特異性的細(xì)胞免疫機(jī)制或體液免疫機(jī)制，而以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫機(jī)制作用最明顯[6]。在免疫抑制機(jī)制中[7]，CD4+T淋巴細(xì)胞釋放白介素，刺激B淋巴細(xì)胞增殖，激活機(jī)體免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；CD8+T淋巴細(xì)胞作用于T細(xì)胞表面受體，阻斷其和腫瘤細(xì)胞結(jié)合，并釋放多種免疫抑制因子，造成機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫性降低，故腫瘤患者細(xì)胞免疫功能紊亂主要表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量上升，CD4/CD8比例倒置，因此，通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞免疫機(jī)制可能是胰腺癌基因治療的關(guān)鍵措施之一。

文獻(xiàn)報(bào)道[8]，腫瘤壞死因子(TNF)家族與其受體(TNFR)相互作用可對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)，從而殺傷細(xì)胞。DcR3基因作為TNFR超家族成員之一，定位于人染色體20q213，由271個(gè)氨基酸殘基組成，總長(zhǎng)1 114bp，屬于一種無跨膜區(qū)的可溶性蛋白。該基因具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞免疫逃逸雙重調(diào)節(jié)功能，并可導(dǎo)致CD80、CD40和CD54等信號(hào)分子表達(dá)下調(diào)，降低T淋巴細(xì)胞活性和阻斷其活化功能。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌PANC1細(xì)胞DcR3基因表達(dá)沉默后再與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，結(jié)果CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著增多，CD8+T細(xì)胞數(shù)量無顯著變化，與Zhu等[9]的研究結(jié)果一致，表明DcR3基因沉默可抑制細(xì)胞免疫功能，促使癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

輔助性T細(xì)胞1(Thl)和Th2細(xì)胞作為重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，前者能夠釋放IFN-γ等細(xì)胞因子，激活體液免疫攻擊腫瘤細(xì)胞，而后者釋放IL-4，使腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視和攻擊，在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。有研究報(bào)道[10]，將DcR3基因轉(zhuǎn)染大鼠，CD4+T細(xì)胞數(shù)量下降，并可抑制Th1細(xì)胞釋放IFN-γ和促使Th2細(xì)胞釋放IL-2。本研究結(jié)果顯示，沉默DcR3基因表達(dá)后細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量顯著增加，而IL-4含量顯著下降，與本課題組以往應(yīng)用其他方法研究得到的結(jié)果一致[11]，由此可見，糾正失衡的Thl/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)有利于恢復(fù)和發(fā)揮細(xì)胞免疫功能。

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(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.014

青海省人民醫(yī)院院內(nèi)課題(2014)

810001 西寧，青海省人民醫(yī)院普外科

郭亞民，Email: 1159135996@qq.com

2016-05-05)