錢(qián)景華 周步進(jìn) 孔祥軍 李增強(qiáng) 史奇奇 廖小芳 周瑞陽(yáng) 陳鵬

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 廣西高校植物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004）

紅麻MYB21基因的克隆、表達(dá)及載體構(gòu)建

錢(qián)景華 周步進(jìn) 孔祥軍 李增強(qiáng) 史奇奇 廖小芳 周瑞陽(yáng) 陳鵬

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 廣西高校植物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004）

克隆紅麻不育系和保持系的MYB21基因，分析MYB21基因在紅麻不育系和保持系各器官的表達(dá)量，并構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體，旨在為進(jìn)一步研究該基因在紅麻中的功能奠定基礎(chǔ)。以同源克隆的方法克隆MYB21基因；用實(shí)時(shí)熒光定量的方法分析MYB21基因在紅麻不育系和保持系不同組織器官的表達(dá)模式；根據(jù)酶切-連接的方法，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體。結(jié)果顯示，紅麻MYB21基因在不育系和保持中的基因序列沒(méi)有差異，其cDNA全長(zhǎng)序列為922 bp，包含843 bp的開(kāi)放閱讀框，DNA全長(zhǎng)序列為1 108 bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子（NCBI序列登錄號(hào)為KT898146）；MYB21基因主要在花藥中表達(dá)，在不育系和保持系花藥之間表達(dá)量呈極顯著差異；成功構(gòu)建MYB21過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體。成功克隆MYB21基因的全長(zhǎng)序列；實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明MYB21基因主要在花藥中進(jìn)行表達(dá)；構(gòu)建的植物過(guò)表達(dá)載體PBI121-MYB21和RNAi載體pART27-PK-R1-F2可用于該基因的功能研究。

紅麻；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；MYB21基因；實(shí)時(shí)熒光定量；載體構(gòu)建

紅麻（Hibiscus cannabinus L.）屬于錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物，傳統(tǒng)用途是作為紡織、生產(chǎn)麻繩、麻袋、地毯等的原料。同時(shí)，紅麻也是一種多用途作物，被廣泛應(yīng)用于造紙、建材、土壤修復(fù)、飼料等各種領(lǐng)域［1-2］。

作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑，利用CMS配制雜交種，克服了人工授粉的種種弊端，大大減少勞動(dòng)量，同時(shí)能夠提高雜交種子的純度，增加作物的產(chǎn)量［3］。作物雄性不育表現(xiàn)為花藥（包括花粉）的發(fā)育異常?；ㄋ幍陌l(fā)育是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，特別是在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控尤其重要。轉(zhuǎn)錄因子是這一調(diào)控過(guò)程中的主要參與者，在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族之一。目前眾多研究結(jié)果表明MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的功能具有多樣性，包括參與植物次生代謝調(diào)控，激素和環(huán)境因子的應(yīng)答，細(xì)胞分化及細(xì)胞周期等多種過(guò)程［4］。MYB21屬于R2R3型MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，Song等［5］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AtMYB21基因與AtMYB24能夠與JAZ蛋白相互作用而影響茉莉酮酸酯（JA）的代謝，從而調(diào)控雄蕊花藥的發(fā)育。姚潤(rùn)鵬［6］從大白菜花瓣退化突變體的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)了MYB21基因是與花器官發(fā)育相關(guān)的。Cheng等［7］在研究赤霉素（GA）和茉莉酸（JA）對(duì)擬南芥的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)GA能夠促進(jìn)JA的生物合成而調(diào)控MYB21基因的表達(dá)，從而促進(jìn)雄蕊花絲的延伸。但是迄今為止還沒(méi)有看到有關(guān)MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作物CMS發(fā)生的研究報(bào)道。本課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)紅麻MYB21的表達(dá)量在CMS系花藥中顯著下調(diào)，故推測(cè)MYB21參與了紅麻CMS發(fā)生的調(diào)控。基于此，本研究克隆MYB21基因，研究MYB21在紅麻不育系和保持系不同的組織器官的表達(dá)模式，并構(gòu)建MYB21基因的過(guò)表達(dá)與干擾載體，旨在為研究MYB21基因在紅麻花藥發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅麻不育系P3A與保持系P3B（本課題組選育）種植于廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。

主要試劑及菌株：CTAB裂解液、DEPC， DNAaseI，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)astpfu酶，DNA回收試劑盒，T4 DNA連接酶，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，LB培養(yǎng)基，各種相關(guān)限制性?xún)?nèi)切酶，相關(guān)載體，熒光定量試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 紅麻花藥總DNA和總RNA的提取 紅麻不育系P3A和保持系P3B，取盛花期時(shí)的花藥，置于-80℃冰箱保存，采用改良CTAB法［8，9］提取總DNA和總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀來(lái)檢測(cè)DNA和RNA的完整性。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 用PrimeScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并以紅麻跨內(nèi)含子引物COXⅡ檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中是否含有總DNA。

表1 引物序列

1.2.3 MYB21基因全長(zhǎng)的克隆 根據(jù)不育系（P3A）和保持系（P3B）花藥轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果［10］設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增紅麻MYB21基因全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增選用高保真酶Fastpfu DNA聚合酶，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃ 30 s，53℃ 40 s，72℃1 min，32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。同時(shí)以ddH2O為模板設(shè)置陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收并連接到pMD-19T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，挑取陽(yáng)性克隆送至華大基因測(cè)序。

1.2.4 紅麻MYB21基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)克隆的MYB21基因開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)加入相應(yīng)酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物ORF-R和ORF-F（表1），以紅麻花藥反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用高保真酶FastPfu DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠回收PCR產(chǎn)物，然后連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序，用限制性?xún)?nèi)切酶Xba I和Kpn I雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒并凝膠回收小片段，同時(shí)雙酶切PBI121-GFP載體并回收，最后連接、轉(zhuǎn)化，以卡那霉素篩選陽(yáng)性菌落，菌液測(cè)序并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.5 MYB21基因RNAi干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)干擾載體序列選取的原則［11］，選擇MYB21基因的cDNA的428 bp序列作為干擾片段，并根據(jù)中間載體PKNANIBAL上的插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向引物與反向引物（表1）進(jìn)行克隆。克隆得到的正向片段命名為RNAi-Z，反向片段命名為RNAi-F。

正向片段的插入：用Xho I和Kpn I雙酶切RNAi-Z質(zhì)粒和PKNANIBAL質(zhì)粒，經(jīng)回收，連接、轉(zhuǎn)化，以卡那霉素平板篩選陽(yáng)性克隆，酶切鑒定連接正確后命名為PK-R1。

反向片段的插入：用Xba I和Cla I雙酶切PK-R1和RNAi-F，經(jīng)凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提，質(zhì)粒酶切確認(rèn)連接正確后命名為PK-R1-F2；

最后，將PK-R1-F2連接到植物雙元表達(dá)載體pART27上：采用Not I分別酶切PK-R1-F2和pART27，回收、連接、轉(zhuǎn)化之后，以含有壯觀霉素的平板來(lái)篩選陽(yáng)性克隆，菌液測(cè)序并質(zhì)粒酶切鑒定后確認(rèn)RNAi干擾載體構(gòu)建成功，將此載體命名為pART27-PK-R1-F2。

1.2.6 熒光定量PCR 選擇紅麻甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)MYB21基因和GAPDH基因的熒光定量的引物（表1），分別用P3A和P3B的根、葉和花藥部分的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，TransStart Tip Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒（北京全式金公司）進(jìn)行熒光定量PCR研究MYB21基因的表達(dá)模式。反應(yīng)體系為15 μL：模板為1.5 μL，樣品設(shè)3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置以水為模板的陰性對(duì)照。以95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，36 cycles的反應(yīng)程序在熒光定量?jī)x器（Bio-Rad，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

2 結(jié)果

圖1 紅麻花藥核酸質(zhì)量及反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)結(jié)果

2.1 紅麻核酸質(zhì)量及反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

從瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1-A）可以看出，提取的紅麻不育系P3A和保持系P3B花藥總RNA條帶清晰，完整性較好。為檢測(cè)是否含有DNA污染，以跨內(nèi)含子引物對(duì)COXⅡ-R和COXⅡ-F對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該引物對(duì)以總DNA為模板擴(kuò)增出來(lái)的片段是2 009 bp，以cDNA為模板擴(kuò)增出來(lái)的片段是518 bp，瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果（圖1-C）顯示，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA沒(méi)有總DNA殘留。cDNA質(zhì)量滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需要。

2.2 MYB21基因全長(zhǎng)的克隆

分別以P3A和P3B花藥的cDNA以及P3B的總DNA為模板，以MYB21-R和MYB21-F為引物，克隆MYB21基因的全長(zhǎng)，得到的克隆片段分別命名為P3A-MYB21（RNA），P3B-MYB21（RNA）以及P3BD-MYB21（圖2）。

圖2 MYB21基因擴(kuò)增

將MYB21基因的cDNA序列和DNA序列用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MYB21基因在cDNA和總DNA水平其核苷酸同源性達(dá)到83.21%，其中MYB21基因在不育系P3A和保持系P3B的cDNA水平上序列是一致的，它們的全長(zhǎng)均為922 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?43 bp，編碼280個(gè)氨基酸，而總DNA序列則包含3個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，其全長(zhǎng)為1 108 bp。ATG為起始密碼子，由下圖可知第1個(gè)外顯子為155 bp，第2個(gè)外顯子129 bp，第3個(gè)外顯子559 bp，3個(gè)編碼區(qū)序列總長(zhǎng)為843 bp，第1個(gè)內(nèi)含子89 bp，第2個(gè)內(nèi)含子97 bp，兩個(gè)非編碼區(qū)總長(zhǎng)為186 bp（圖3）。序列提交到NCBI，提交的DNA序列號(hào)為：KT898146。

利用ORF finder 尋找擴(kuò)增產(chǎn)物的最長(zhǎng)ORF，在NCBI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果（圖4）顯示所擴(kuò)增的產(chǎn)物序列包含兩個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，即MYB超級(jí)家族的典型保守結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明所克隆得到MYB21基因是屬于R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。

另外，將MYB21基因所編碼的氨基酸序列與其他物種中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MYB21基因與雷蒙德氏棉的MYB108-like基因以及陸地棉中的MYB5基因同源性較高，序列同源性分別達(dá)到67%和63%（圖5）。

2.3 紅麻MYB21基因載體的構(gòu)建

2.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 將用加入酶切位點(diǎn)的MYB21基因引物克隆所得的基因片段與PBI121-GFP載體雙酶切之后進(jìn)行連接，利用PBI121載體序列所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行菌液測(cè)序測(cè)序結(jié)果與目的基因序列通過(guò)DNAMAN進(jìn)行比對(duì)（圖6），發(fā)現(xiàn)測(cè)序序列包含完整目的基因序列。

同時(shí)進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切下來(lái)的片段大小與目的片段大小一致（圖7）。證明目的基因片段成功連接到表達(dá)載體中，將構(gòu)建成功的表達(dá)載體命名為PBI121-MYB21。

2.3.2 干擾載體的構(gòu)建 紅麻MYB21基因擴(kuò)增片段大小與所選取的干擾片段大小一致，均在400 bp左右（圖8-A），雙酶切RNAi-Z和RNAi-F得到的片段長(zhǎng)度（圖8-B）經(jīng)菌液測(cè)序其結(jié)果與所選取的正向片段和反向片段序列一致，這充分說(shuō)明了正向片段與反向片段成功連接到了pMD19-T載體上。對(duì)PK-R1和PK-R1-F2分別進(jìn)行雙酶切，所獲得的酶切片段與干擾片段長(zhǎng)度一致（圖8-C），說(shuō)明干擾片段連接到中間載體PKANNIBAL成功。最后，對(duì)pART27-PKR1-F2用Not I酶切，并以pART27-PK-R1-F2質(zhì)粒做對(duì)照，凝膠電泳圖結(jié)果（圖8-D）顯示酶切下來(lái)的片段與目的片段大小一致，同時(shí)利用PKANNIBAL載體序列的通用引物進(jìn)行菌液測(cè)序，測(cè)序結(jié)果（圖9）顯示所插入的片段與目的片段堿基序列一致，說(shuō)明干擾片段成功連接到相應(yīng)載體上。

2.4 MYB21基因熒光定量分析

圖3 MYB21基因序列

本研究從紅麻不育系材料P3A和保持系材料P3B的根、葉和花藥中提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)熒光定量PCR反應(yīng)，運(yùn)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析反應(yīng)數(shù)據(jù)來(lái)研究MYB21基因在兩者之間不同組織器官的表達(dá)量情況。以管家基因GAPDH和MYB21基因的5個(gè)梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照和待測(cè)樣本分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)同時(shí)上機(jī)，獲得GAPDH和MYB21基因的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，融解曲線峰形單一，管家基因和MYB21基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的R2＞0.999，表明熒光定量反應(yīng)體系沒(méi)有污染，引物特異性好，且重復(fù)性較高，由此得出的熒光定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有可靠性與真實(shí)性。

圖4 MYB21基因保守結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果

圖5 MYB21基因與其它物種氨基酸序列比對(duì)

定量分析結(jié)果（圖10-A）表明MYB21基因在不育系花藥中的表達(dá)量極顯著低于保持系，僅為保持系的0.07倍，在根中表達(dá)量下調(diào)為0.28倍，而在葉片中的表達(dá)量略微高于保持系（1.41倍）。比較分析保持系的根、葉和花藥中的定量數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MYB21基因主要在花藥中表達(dá)（圖10-B）。

3 討論

圖6 測(cè)序結(jié)果比對(duì)（P-1為表達(dá)載體菌液測(cè)序編號(hào)）

MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是植物中最為重要的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要作用。Shin等［12］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中MYB21基因特異性在花中進(jìn)行表達(dá)，Li等［13］利用RT-PCR技術(shù)分析了AtMYB57、AtMYB21、AtMYB24、AtMYB116和AtMYB62在擬南芥根、蓮座葉、莖生葉、花和角果中的表達(dá)量，其中MYB21基因在擬南芥各個(gè)部分都有一定量的表達(dá)，但主要是在花中進(jìn)行表達(dá)。Yang等［14］研究發(fā)現(xiàn)與AtMYB21氨基酸序列同源性達(dá)68.5%的AtMYB24也是主要在花中表達(dá)。本研究首次從紅麻中克隆到轉(zhuǎn)錄因子MYB21，并明確了其序列結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步分析了其表達(dá)模式，與前人研究結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)該基因主要在紅麻花藥中表達(dá)，在根和葉中只有輕微的表達(dá)。而且在不育系花藥中呈現(xiàn)極顯著下調(diào)表達(dá)模式，因此推測(cè)該基因可能參與了紅麻花藥發(fā)育的調(diào)控。

圖7 表達(dá)載體酶切驗(yàn)證結(jié)果

圖8 干擾載體構(gòu)建圖

Song等［5］研究了MYB21基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)量情況，當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株MYB21的表達(dá)水平是野生型擬南芥中的20-100倍時(shí)，植株出現(xiàn)嚴(yán)重或完全丟失育性，而表達(dá)量是野生型1-5倍時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株其育性改變不明顯，這說(shuō)明了MYB21基因的表達(dá)量水平的高低對(duì)于雄蕊發(fā)育是很重要的。因此后續(xù)研究可以將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體和干擾載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，在鑒定載體構(gòu)建成功的同時(shí)，一方面，將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體通過(guò)花粉管通道注射紅麻或葉盤(pán)法轉(zhuǎn)煙草研究MYB21基因與植物育性的關(guān)系，而且構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體以本實(shí)驗(yàn)室改造過(guò)的含有綠色熒光蛋白的PBI121為載體，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證該基因的功能及亞細(xì)胞定位提供便利。另一方面，結(jié)合RNAi載體所具有的特異性沉默某個(gè)基因表達(dá)的特性，將構(gòu)建的干擾載體進(jìn)行同樣的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，從反向遺傳學(xué)角度出發(fā)充分研究MYB21基因的功能。

圖9 干擾載體測(cè)序結(jié)果比對(duì)（PPZF6為干擾載體菌液測(cè)序編號(hào)）

圖10 MYB21基因在紅麻P3A和P3B花藥、葉片及根中的表達(dá)量

另外，轉(zhuǎn)錄因子是通過(guò)結(jié)合到靶基因而發(fā)揮作用的，Shin等［12］發(fā)現(xiàn)擬南芥MYB21可以直接調(diào)節(jié)苯丙氨酸裂解酶PAL和交替氧化酶AOX1a的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控苯丙氨酸的代謝過(guò)程。Song等［5］研究發(fā)現(xiàn)MYB21和MYB24與JAZ 蛋白結(jié)合影響花藥發(fā)育和花絲延長(zhǎng)，并且推斷MYB21和MYB24是與JAZ蛋白分離之后激活下游各種不同的基因來(lái)參與這個(gè)過(guò)程的。因此后續(xù)研究擬進(jìn)一步篩選MYB21靶基因并分析靶基因的表達(dá)模式，從而揭示MYB21在調(diào)控紅麻CMS發(fā)生的作用。

4 結(jié)論

成功克隆了紅麻不育系P3A和保持系P3B中的MYB21基因，明確了MYB21基因序列結(jié)構(gòu)；分析了MYB21基因在不育系和保持系各組織器官的表達(dá)模式，研究發(fā)現(xiàn)MYB21基因主要在花藥中進(jìn)行表達(dá)，并且兩系之間表達(dá)量呈極顯著差異；經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)載體和干擾載體構(gòu)建成功，能夠用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因功能研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Expression Analysis and Vector Construction of MYB21 Gene in Kenaf

QIAN Jing-hua ZHOU Bu-jin KONG Xiang-jun LI Zeng-qiang SHI Qi-qi LIAO Xiao-fang ZHOU Rui-yang CHEN Peng
（Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding，College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004）

This work is to clone MYB21 gene and analyze its expression levels in different organs of kenaf for both cytoplasmic male sterility（CMS）and its maintainer，to construct over-expression vector and RNAi vector，and to lay the foundation for further study on the function of MYB21 gene in kenaf. The MYB21 gene was cloned using a homology method. The expression patterns of MYB21 in different organs for CMS and its maintainer were analyzed by quantitative real-time PCR. Using enzyme digestion-ligation method，the expression vector and RNAi vector were constructed. As results，there was no difference on gene sequence between CMS and its maintainer. The full cDNA sequence of MYB21 gene was 922 bp，including an 843 bp open reading frame. The full DNA sequence of MYB21 gene was 1 108 bp，containing 3 exons and 2 introns（the NCBI GenBank accession number：KT898146）. MYB21 gene was predominantly expressed in anther，the expression level of MYB21 gene in anther between CMS and its maintainer was highly significant difference. Also the over-expression vector and RNAi vector were constructed successfully. In conclusion，the full-length sequence of MYB21 gene in kenaf is obtained，MYB21 gene is mainly expressed in anther of kenaf，and the over-expression vector PBI121-MYB21 and RNAi vector pART27-PK-R1-F2 can be used for function study of MYB21 gene.

kenaf；cytoplasmic male sterility；MYB21 gene；quantitative real-time PCR；vector construction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.020

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260341，31560421），廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015GXNSFAA139059）

錢(qián)景華，女，碩士研究生，研究方向：作物雄性不育的分子機(jī)理；E-mail：15225215301@163.com

陳鵬，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：作物雄性不育的分子機(jī)理；E-mail：hustwell@gmail.com