胡基華曹旭，2孟力強(qiáng)，2陳靜宇姜威，2劉宇帥，2張淑梅，2李晶，2

（1. 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2. 黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150010）

產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株S68-CM5產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

胡基華1曹旭1，2孟力強(qiáng)1，2陳靜宇1姜威1，2劉宇帥1，2張淑梅1，2李晶1，2

（1. 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2. 黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150010）

為提高黏質(zhì)沙雷氏菌株S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力，對(duì)產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行摸索。結(jié)果顯示，獲得最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)1.5%，牛肉膏7 g/L，酵母膏2 g/L，葡萄糖8 g/L，氯化鈉 3.5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L；最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min，培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量1%，裝液量50 mL/250 mL。優(yōu)化后產(chǎn)酶量達(dá)到7.131 U/mL，比優(yōu)化前產(chǎn)酶量提高了1.43倍。

黏質(zhì)沙雷氏菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面

黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）亦稱靈桿菌，是革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，屬于腸桿菌科克白雷氏菌族中的沙雷氏菌屬。在培養(yǎng)過程中，能產(chǎn)生紅色非擴(kuò)散性色素-靈菌紅素（Prodigiosin）和幾丁質(zhì)酶（Chitinase EC.3.2.14）［1］，幾丁質(zhì)酶專一性水解幾丁質(zhì)中的β-1，4糖苷鍵，轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生菌體蛋白和氨基寡糖等產(chǎn)物，具有降解幾丁質(zhì)的功能。到目前為止，已在細(xì)菌、放線菌、真菌中檢測到幾丁質(zhì)酶，并且應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、化妝和動(dòng)物飼料等行業(yè)，在害蟲防治中具有增效作用［2］。已有研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌是一類幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生能力較強(qiáng)的細(xì)菌，是幾丁質(zhì)酶最好的來源之一。但由于幾丁質(zhì)酶的多樣性，調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性，以及菌株產(chǎn)酶能力低下、發(fā)酵工藝不成熟等原因，真正應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的并不多見。因此，獲得其最佳產(chǎn)酶條件是微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶研究的重要任務(wù)。

本研究是基于對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自有菌株黏質(zhì)沙雷氏菌S68誘變基礎(chǔ)上，獲得產(chǎn)酶量高的新菌株S68-CM5的后續(xù)研究，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨為黏質(zhì)沙雷氏菌液深層發(fā)酵和生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶新型植物保護(hù)劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黑龍江省科學(xué)院微生物研究所生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)誘變黏質(zhì)沙雷氏菌株S68-CM5。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 斜面培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO43.65 g/L，瓊脂15 g/L，初始pH為7.0-7.5。

1.1.2.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO43.65 g/L，初始pH為7.0-7.5。

1.1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO43.65 g/L，1%質(zhì)量百分比膠體幾丁質(zhì)以10%濃度加入培養(yǎng)基中，初始pH為7.0-7.5。

培養(yǎng)基滅菌條件均為濕熱滅菌121℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

1.2.1.1 種子活化 將黏質(zhì)沙雷氏菌種S68-CM5轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 種子培養(yǎng) 挑一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌株接種于5 mL試管種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng) 150 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以1%接種量接種于250 mL裝三角瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量為50 mL，30℃培養(yǎng)150 r/min培養(yǎng)60 h。

1.2.2 酶活力測定 將培養(yǎng)60 h的菌液離心（7 000 r/min，-4℃，30 min）取上清液，以35%濃度使用硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀，24 h后離心（7 000 r/min，-4℃，30 min）留取上清液，再以75%濃度硫酸銨沉淀蛋白，24 h后離心（8 000 r/min，-4℃，30 min），取沉淀物使用半透膜（MW7000）用流動(dòng)水除鹽8 h；使用聚乙二醇6000濃縮至1 mL左右；取0.4 mL樣品，0.4 mL蒸餾水空白對(duì)照，分別加入0.4 mL濃度為0.05 mol/L醋酸液，0.4 mL 1%膠體幾丁質(zhì)37℃水?。? h）降解幾丁質(zhì)成單糖；離心（4 000 r/min，4℃，10 min）取0.4 mL上清液加入40 μL質(zhì)量百分比為1%蝸牛酶水浴（37℃，30 min），加入0.2 mL飽和硼砂緩沖；干式恒溫器100℃，7 min，冷卻再加入2 mL冰醋酸和1 mL濃度1% DMAB水浴（37℃，15 min）進(jìn)行顯色反應(yīng)，585 nm測吸光度。根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力［3］。酶活力單位（U）表示在上述反應(yīng)條件下，每1 min時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生1 μmol NAG所需要的酶量。

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的顯著因子篩選

1.2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Plackett-Burman進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選7個(gè)組分：葡萄糖（A）、牛肉膏（B）、蛋白胨（D）、酵母膏（E）、NaCl（G）、K2HPO4（H）和膠體幾丁質(zhì)（J），選用10因子2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，增加3個(gè)空白項(xiàng)C、F、I來估計(jì)試驗(yàn)誤差，每個(gè)因子取高低2個(gè)水平，且高水平是低水平的2倍（表1）。

1.2.3.2 爬坡試驗(yàn) 通過對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定主要因子，根據(jù)回歸方程各因子的系數(shù)來確定主要因子的爬坡路徑和步長［4］。改變各主要因子在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度，使其成梯度變化，檢測各個(gè)梯度下菌株的酶活，快速確定最大響應(yīng)值的區(qū)域。

1.2.4 響應(yīng)面方法對(duì)培養(yǎng)條件試驗(yàn)

1.2.4.1 培養(yǎng)條件各因素篩選 采用Plackett-Burman進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選的6個(gè)因素分別是pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間和裝液量，選用10因子2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，增加3個(gè)空白項(xiàng)C、F、I來估計(jì)試驗(yàn)誤差，每個(gè)因子取高低兩個(gè)水平（表2）。

1.2.4.2 Plackett-Burman主要因子 確定影響SM68-CM5菌株產(chǎn)酶條件的3個(gè)主要因素，爬坡試驗(yàn)確定3個(gè)主要因子響應(yīng)區(qū)域，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理在主要因子的響應(yīng)區(qū)各取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman分析碳源、氮源與水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 Plackett-Burman分析培養(yǎng)條件優(yōu)化因素與水平

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)處理包含3個(gè)平行試驗(yàn)，取值為3個(gè)平行試驗(yàn)的均值。Plackett-Burman設(shè)計(jì)采用Minitab 16軟件完成，Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析由Design-Expert8.0.6.1完成。

2 結(jié)果

2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選培養(yǎng)基碳氮源顯著因子 采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對(duì)膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl和K2HPO4

7個(gè)因素每個(gè)組分取高水平（＋1）和低水平（-1），

各因子所代表的高低水平和方差分析結(jié)果，見表3。由表4中P值的大小可以判定，培養(yǎng)基中各因子對(duì)S68-CM5菌株酶活影響，膠體幾丁質(zhì)P值為0.003，J＞B＞E＞A＞G＞D＞H，即膠體幾丁質(zhì)＞牛肉膏＞酵母膏＞葡萄糖＞氯化鈉＞蛋白胨＞磷酸氫二鉀。效應(yīng)關(guān)系用方程式表示為：W=4.25+X1+0.87X3+ 2.4X4，方程R2=0.9021，表明該回歸方程擬合良好。從方程中還可以看出，要提高菌體數(shù)量，應(yīng)提高膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖和牛肉膏添加量。

表3 Placket-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

表4 Placket-Burman設(shè)計(jì)顯著因子分析

2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域 根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出的主要組分的效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找產(chǎn)酶量最高的濃度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示，最佳菌體數(shù)量在試驗(yàn)號(hào)3附近。

確定了顯著因子的最適濃度區(qū)域之后，即以1.5%膠體幾丁質(zhì)，牛肉膏7 g/L，酵母膏2 g/L，各因素代碼和水平設(shè)計(jì)，見表5。

2.2 黏質(zhì)沙雷氏菌S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman篩選顯著因子 采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)主要6個(gè)培養(yǎng)因素進(jìn)行分析。每個(gè)因素取高水平（+1）和低水平（-1），各因子所代表的高低水平和方差分析結(jié)果，見表6。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 Placket-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

由表7中P值的大小可以判定，培養(yǎng)條件各因子對(duì)S68-UM5菌株酶活影響，pH0.011，搖床轉(zhuǎn)速0.015，培養(yǎng)溫度0.021，A＞D＞E＞G＞B＞H，即pH＞搖床轉(zhuǎn)數(shù)＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞接種量＞裝液量。顯然，pH、搖床轉(zhuǎn)數(shù)和培養(yǎng)溫度的影響較為突出。

表7 Placket-Burman設(shè)計(jì)顯著因子分析

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表8，確定了影響酶活最顯著3個(gè)因子為pH值、溫度和搖床轉(zhuǎn)數(shù)。以pH7.0，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)定3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，以酶活為響應(yīng)值。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，該模型的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)酶活的影響均顯著，而交互作用酶活的影響不顯著，回歸模型的P值0.037 2，表明模型是顯著的，而失擬項(xiàng)的P值為0.159 1，失擬不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.910 7，說明模型達(dá)到較好的擬合程序，經(jīng)分析軟件回歸擬合得到該模型的回歸方程：酶 活=0.65-0.14A-0.24B+0.17C+7.500E-003AB-0.075AC+0.40BC-0.34A2-0.37B2-0.25C2。

為解得該同回歸方程的極值點(diǎn)，對(duì)其各自變量分別求一階偏導(dǎo)，得到三元一次方程組，解出該模型的極值點(diǎn)，從而計(jì)算出對(duì)應(yīng)因素的取值：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min，此時(shí)模型的理論最高酶活為7.092 U/mL。

根據(jù)擬合回歸方程采用Design-Expert8.0.6.1分析，繪出主要因素相應(yīng)的等高線和響應(yīng)面分析圖（圖1-圖3）。每個(gè)響應(yīng)面可反映出兩個(gè)主要因素之間的相互作用，3個(gè)因素固定在最優(yōu)值不變的情況下，隨著另外2個(gè)因素的逐漸增加，酶活呈先增后減的趨勢(shì)，而曲面的頂點(diǎn)即為酶活的最大值點(diǎn)［5］。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)分析（表5和表8）結(jié)果，鑒于實(shí)驗(yàn)室條件，實(shí)際設(shè)定值為：pH7，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)155 r/min，培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量1%，裝液量50mL/250 mL。為了驗(yàn)證這一結(jié)果的有效性，按照上述分析結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，檢測結(jié)果為7.131 U/mL，與預(yù)測值相近，說明該模型擬合的有效性。

圖1 pH值和溫度交互作用對(duì)酶活影響的等高線（A）和響應(yīng)面（B）

圖2 pH值和搖床轉(zhuǎn)數(shù)交互作用對(duì)酶活影響的等高線（A）和響應(yīng)面（B）

圖3 溫度和搖床轉(zhuǎn)數(shù)交互作用對(duì)酶活影響的等高線（A）和響應(yīng)面（B）

3 討論

Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種以不完全平衡塊（Balanced incomplete blocks）為原理的部分因子設(shè)計(jì)法［6，7］，具有試驗(yàn)次數(shù)少效率高的特點(diǎn)，Wu和陳寧等［8，9］都利用PB設(shè)計(jì)通過12次試驗(yàn)，從10種成分中快速篩選出主要影響發(fā)酵產(chǎn)酸的成分。目前國內(nèi)外許多研究都采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)不同微生物培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，均獲得較為理想的結(jié)果［10，11］。

碳源是影響微生物發(fā)酵的最主要因素之一，本研究發(fā)現(xiàn)膠體幾丁質(zhì)是誘導(dǎo)S68-CM5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶主要的碳源，這與大多數(shù)幾丁質(zhì)酶為誘導(dǎo)酶有關(guān)［12］，幾丁質(zhì)濃度在1.5%時(shí)酶活5.29 U/mL，膠體幾體質(zhì)濃度高的情況下酶活反而下降，可能是由于幾丁質(zhì)濃度高，黏稠度低利于酶產(chǎn)生。葡萄糖作為碳源時(shí)不利于幾丁質(zhì)酶分泌，與王海東［13］研究的SWCH-6菌株及楊紹青［14］研究的一株高溫紫鏈霉菌結(jié)果相似。常用氮源中牛肉膏和酵母膏對(duì)產(chǎn)酶有影響。

通過PB從7個(gè)因素篩選出3個(gè)影響產(chǎn)酶的主要因素，利用響應(yīng)面分析法Box-Behnken設(shè)計(jì)確定顯著因子最優(yōu)配比：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min。幾丁質(zhì)酶最適催化pH范圍較廣，一般在3.0-11.0之間，大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶最適催化在pH4.0-6.0的偏酸環(huán)境，在已有的研究中SWCH-6的最適pH值為5.0，本研究菌株S68-CM5的最佳pH值6.88，具有一般幾丁質(zhì)酶的特點(diǎn)。從產(chǎn)酶的歷程看，S68-CM5從48 h開始分泌幾丁質(zhì)酶，在60 h時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰，與以往文獻(xiàn)報(bào)道幾丁質(zhì)酶活力高峰一般出現(xiàn)在4-8 d相比［14，15］，產(chǎn)酶時(shí)間提前，提高了產(chǎn)酶效率。

目前，多種統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法已被成功地運(yùn)用于微生物培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化工作中，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定了誘變菌株S68-CM5培養(yǎng)基碳、氮源和最佳產(chǎn)酶條件，尋找合適的發(fā)酵工藝、探索使酶活穩(wěn)定的方法，從而推動(dòng)幾丁質(zhì)研究及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。下一步打算在此研究的基礎(chǔ)上對(duì)S68-CM5菌株進(jìn)行中試研究，利用20 L自控罐研究黏質(zhì)沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5發(fā)酵條件，探討誘導(dǎo)底物、底物濃度及添加時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響；優(yōu)化幾丁質(zhì)酶的提取和純化工藝，提高酶的收率。

4 結(jié)論

得到黏質(zhì)沙雷氏菌S68-CM5最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)1.5%，牛肉膏7 g/L，酵母膏2 g/L，葡萄糖8 g/L，氯化鈉 3.5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L；最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)155.82 r/min，培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量1%，裝液量50 mL/250 mL，優(yōu)化后產(chǎn)酶量達(dá)到7.131 U/mL。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimizing the Enzyme-producing Conditions of Chitinase-producing Strain S68-CM5

HU Ji-hua1CAO Xu1，2MENG Li-qiang1，2CHEN Jing-yu1JIANG Wei1，2LIU Yu-shuai1，2ZHANG Shu-mei1，2LI Jing1，2
（1. Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010；2. Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010）

In order to improve the capacity of Serratia marcescens strain S68-CM5 producing chitinase，the fermentation conditions of enzyme production were optimized. Using Plackett-Burman design and response surface method，the conditions of medium and fermentation were explored. The results showed that the optimal enzyme production medium：1.5% colloidal chitin，beef extract 7 g/L，yeast extract 2 g/L，glucose 8 g/L，NaCl 3.5 g/L，peptone 2 g/L，and hydrogen phosphate dehydrate potassium 3.5 g/L；the optimal culture conditions for enzyme production：pH6.88，temperature 27.32℃，shakers revolutions 155.82 r/min，incubation time 60 h，and inoculums size 1% liquid volume 50 mL/250 mL. After optimization，the enzyme production reached 7.131 U/mL，and 1.43 folds of that before optimization.

Serratia marcescens；medium optimization；response surface

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.027

2016-03-20

黑龍江省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項(xiàng)課題，黑龍江省科學(xué)院學(xué)科團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)（2014ws09）

胡基華，女，副研究員，研究方向：生物防治；E-mail：158631375@qq.com

李晶，女，研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物；E-mail：lijing0706@sohu.com