彭勇陳尚武馬會勤

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083；2. 中國農業(yè)大學園藝學院，北京100193）

黑果枸杞果實成熟發(fā)育過程表達譜差異分析

彭勇1陳尚武1馬會勤2

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083；2. 中國農業(yè)大學園藝學院，北京100193）

對黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）3個不同發(fā)育時期的果實進行轉錄組測序，分析對比黑果枸杞果實不同發(fā)育時期相關基因表達譜的變化。提取果實RNA進行Illumina高通量測序，利用GO、KEGG等公共數(shù)據(jù)庫進行功能注釋、分類，利用數(shù)字基因表達譜技術對比分析。結果顯示，KEGG pathway 富集分析表明亮氨酸生物合成途徑在變色期對比青果期有7個差異表達基因，黑熟期對比變色期有35個差異表達基因，且全部為上調表達。在糖酵解途徑中3個不可逆的反應步驟限速酶基因在黑熟期均為上調表達。對黑果枸杞亮氨酸合成和糖酵解涉及到的基因進行了功能和代謝通路的分析，為黑果枸杞種質資源探索提供理論基礎。

黑果枸杞；果實發(fā)育；基因表達譜；差異表達

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是在我國西北干旱鹽堿地生境廣泛分布的多年生灌木，是一種集鹽堿地綠化價值、防護林價值、藥食用價值等于一體的野生優(yōu)良水土保持植物。黑果枸杞果實中富含枸杞多糖［1，2］、色素［3，4］、類黃酮［5］、甜菜堿［6］、微量元素、脂肪酸、揮發(fā)油、維生素等多種成分，其果實提取物在抗氧化［7］、調節(jié)免疫力［8］、抗疲勞［9］、降血脂［10］、治療心血管系統(tǒng)疾病、抗動脈硬化［11］、抗衰老等方面均有明確作用。

除對黑果枸杞植物生理、產(chǎn)物成分等研究外，近年來研究者開始進行黑果枸杞遺傳基因的研究［12］，包括針對黑果枸杞灌木種群遺傳學［13］、序列擴增多態(tài)性（SRAP）［14］和微衛(wèi)星標記（SSR）［15］等，探究黑果枸杞在紫外線脅迫下轉錄組的變化［16］，以及對寧夏枸杞和黑枸杞花青素合成的轉錄組對比［17］等，以期在分子生物層面揭示其生理發(fā)育等過程的機制。

果實成熟發(fā)育過程是果實功能與品質形成的基礎，這個過程受到遺傳、基因表達和環(huán)境因素的影響［18-20］。隨著基因組測序技術和生物信息學的迅速發(fā)展，基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組學等技術手段被廣泛應用于果實發(fā)育與品質形成研究中，為理解果實成熟變化和利用基因資源控制品質形成提供了重要研究數(shù)據(jù)［21-24］。果實發(fā)育過程中，伴隨果實細胞生理和生化代謝的變化，糖分、氨基酸、色素、脂肪酸和芳香酯含量發(fā)生變化，以及其它次生代謝物、特色營養(yǎng)物質積累，從而產(chǎn)生不同的風味和功能特性［25］。由于我國目前黑果枸杞主要以野生和半野生分布生長于不同地區(qū)，果實品質存在一定差異。利用果實轉錄組學相關手段，展開黑果枸杞果實生長發(fā)育基因表達變化特性研究，對理解和指導我國不同生態(tài)條件下黑果枸杞發(fā)育特征和果實品質提高具有重要意義。

本研究利用RNA-seq技術在RNA水平對黑果枸杞果實座果后青果期、變色期、黑熟期3個不同生長和成熟時期進行基因表達組學分析，探討果實發(fā)育的相關基因功能表達差異，旨在為黑果枸杞品質形成和的基因調控及優(yōu)良株系選育提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）從花期座果后到成熟期果實，采自寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣南郊半干旱地域（年平均氣溫8.7℃，夏季各月平均氣溫在20℃以上，無霜期平均167 d，多年年平均降水量為201 mm），分級后選取早期結實成型的青色果實（早期，果實顏色為青綠色，簡稱青果期，S1），開始變色時期的果實（中期，果身大部分為青綠色、局部為淡紫色，簡稱變色期，S2）和完全成熟的果實（晚期，果實迅速膨大、通體呈黑紫色，簡稱黑熟期，S3）各3份，每份10 g，液氮速凍，于-80℃冰箱保存用于后續(xù)總RNA提取、RNA-seq樣品制備和測序分析。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞果實發(fā)育各時期總RNA的提取和測序 總RNA的提取采用改良的CTAB法［26］，對3個時期的黑果枸杞果實及其重復樣本提取總RNA。選取RNA濃度≥200 ng/mL，OD260/280比值為1.8-2.2的黑果枸杞果實總RNA樣品，送深圳華大基因研究院進行后續(xù)測序。

去除rRNA后質控合格的mRNA樣品按參考樣品（S1+S2+S3）和各果實時期S1-3樣品分別進行RNA-seq樣品制備、合并和測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)處理 對測序得到的原始序列去除接頭（adaptor）序列、低質量標簽（Tag）及長度過小和過大的Tag等數(shù)據(jù)，得到高質量讀長（clean reads）；進行數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質量評估；用短reads組裝軟件Trinity組裝；對測序結果進行飽和度和質控分析。篩選獲得的clean reads用于Unigene后續(xù)分析和GO、NR、NT Swiss-Prot和KO等數(shù)據(jù)庫注釋，并分別對注釋到每個庫以及所有注釋上的Unigene數(shù)目進行統(tǒng)計；去除其中的雜質數(shù)據(jù)，用SOAP2［27］（http://soap.genomics. org.cn/soapaligner.html）對黑果枸杞轉錄組數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)庫對比分析?；虮磉_量的計算使用 RPKM 法（Reads per kb per million reads）［28］，基因表達量符合P＜0.005，錯配率（FDR）≤0.001，且|log2（差異表達倍數(shù)）|＞1（即|log2ratio|＞1）的基因被定義為顯著差異表達的基因。差異基因檢測方法參考“The significance of digital gene expression profiles”［29］，并對差異表達基因進行COG分析和KEGG功能與代謝途徑分析。

2 結果

總轉錄組數(shù)據(jù)達到5.14 G，總clean read數(shù)51 393 116，以黑果枸杞果實發(fā)育總表達基因數(shù)據(jù)作為果實參考轉錄組，對黑果枸杞果實不同發(fā)育期的青果期（S1）、變色期（S2）和黑熟期（S3）的表達譜及相互間的差異進行分析。

2.1 測序質量評價

對黑果枸杞參考轉錄組和各時期果實測序飽和度的數(shù)據(jù)分析，顯示黑果枸杞發(fā)育的3個不同時期的樣品都呈現(xiàn)出在標簽數(shù)量較少時，檢測到的基因數(shù)目較少，基因數(shù)目隨著測序量的增加也急劇增加的模式。當S1的read數(shù)達到80×100 k時，read數(shù)接近不再上升，這表明此時樣本的測序量已經(jīng)基本覆蓋到細胞中基因組可表達的全部基因。圖1為S1樣品的測序隨機性統(tǒng)計分析的結果，表明黑果枸杞mRNA樣本在RNA-Seq實驗過程中，通過超聲方法片段化后的測序的read分布較均勻，為隨后的各項轉錄組差異分析提供了很好的保障。

圖1 黑果枸杞S1期果實轉錄組基因測序頻數(shù)與基因位置分布

圖2 黑果枸杞果實不同時期基因的功能分類

2.2 GO分類分析

通過Gene Ontology（GO）基因功能分類體系注釋分析黑果枸杞果實各發(fā)育期間差異表達基因在分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）、參與的生物過程（biological process）中的分布（圖2），可以反映果實基因表達所表征的代謝富集差異和相應生物學功能的變化。本研究中黑果枸杞果實大部分差異基因的功能集中在分子功能的結合和催化活性方面，細胞組件功能的細胞、細胞組件和細胞器上，在生物過程功能中主要參與細胞過程和代謝過程中。在生物過程中，基因差異數(shù)最多；在細胞組件和分子功能中，差異基因為前者的1/3-1/2；而在分子功能組中，差異表達基因數(shù)量更少。其中，與亮氨酸合成途徑有關的Unigene有14個，其中在S3/S1對比中差異表達基因為9個，S3/S2中為8個，S2/S1中無差異表達基因。

2.3 KEGG代謝途徑分析

通過KEGG代謝途徑富集分析（metabolic pathway enrichment analysis），在黑果枸杞果實中鑒定出次生代謝物合成代謝途徑（biosynthesis of secondary metabolites）基因為3 380個，占到注釋參與代謝途徑基因總數(shù)的12.9%（圖3）。在S2/S1、S3/S2和S3/S1中分別注釋到3 917、5 133和7 259個差異表達基因，說明黑果枸杞隨果實發(fā)育進程，代謝途徑所需基因數(shù)量與模式不斷變化。亮氨酸生物合成屬于基礎代謝物中重要的中間代謝物或前體，黑果枸杞果實成熟發(fā)育過程的亮氨酸生物合成代謝途徑基因表達變化，見圖4。S2/S1中亮氨酸生物合成代謝途徑僅有7個差異表達基因，其中3個上調基因，4個下調基因；S3/S2有35個差異表達基因，全部為上調基因，總體上（S3/S1）有39個差異表達基因，其中36個上調基因，3個下調基因，說明此代謝對黑果枸杞果實成熟與功能性物質轉化特別是花青素苷元類物質代謝，具有重要意義。

圖3 黑果枸杞不同代謝通路中基因占總注釋基因的百分比

S2/S1中，二羥基酸脫水酶（ilvD，EC：4.2.1.9）和酮醇酸還原異構酶（ilvC，EC：1.1.1.86）基因有顯著的下調；在S3/S1中，除支鏈氨基酸氨基轉移酶（ilvE，EC：26.6.1.42）外，所有基因有顯著的上調，其中3-異丙基蘋果酸脫氫酶（leuB，EC：1.1.1.85）出現(xiàn)非常顯著的上調，log2（差異表達倍數(shù)）達到15.6，乙酰羥酸合酶（ilvI，EC：2.2.1.6）和2-異丙基蘋果酸合酶（leuA，EC：2.3.3.13）的log2（差異表達倍數(shù)）分別為9.04和9.19。

糖酵解是為細胞生命活動提供部分能量及為其它代謝途徑提供中間產(chǎn)物的基礎代謝途徑。表1列出了黑果枸杞果實不同發(fā)育時期的糖酵解途徑關鍵酶基因轉錄的差異情況。在糖酵解途徑中，S2/S1有55個差異表達基因，其中上調表達22個，下調表達33個；S3/S1中，有207個差異表達基因，其中上調表達182個，下調表達25個，表明黑果枸杞果實成熟時，糖酵解的代謝重要性在明顯增強，尤其是糖酵解過程中3個不可逆的反應步驟限速酶己糖激酶（hexokinase，EC：2.7.1.1）、6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinas，EC：2.7.1.11）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，EC：2.7.1.40）的表達。在不同的果實發(fā)育階段，編碼上述3個酶的家族基因表達量都呈現(xiàn)出逐漸增高的規(guī)律，其中6-磷酸果糖激酶的Unigenes在青果期基本不表達或者表達量較少，而在果實完全成熟階段表達量急劇增加，其中Unigene4315_GQ在青果期和變色期未見表達，而完全成熟階段RPKM值為33.975；CL8764.Contig2_ GQ在3個時期的RPKM值分別為1.742、1.817和425.632，青果期與變色期無明顯差異，而黑熟期其表達量急劇增加；僅Unigene42339_GQ在變色期未見表達，相對青果期表現(xiàn)為下調表達，在黑熟期重新表現(xiàn)為上調表達。

3 討論

圖4 黑果枸杞不同時期亮氨酸代謝途徑基因表達量變化［30］

由于黑果枸杞基因組測序尚未完成，本研究中黑果枸杞轉錄組的注釋采用參考轉錄組以及對已有植物基因和蛋白資源的相對注釋，可注釋已知功能基因達59 537個，未知基因為25 431個，能夠總體反映出黑果枸杞果實發(fā)育成熟過程的基因轉錄譜特征。黑果枸杞果實中含有豐富的氨基酸，黑果枸杞果實中除色氨酸外，其他 7 種必需氨基酸含量較豐富，其中質量分數(shù)最高的是亮氨酸（Leu），為9.366g/kg（干重）［31］。探索黑果枸杞成熟過程中亮氨酸生物合成變化，有助于了解其氨基酸合成與積累情況，對選育更富有營養(yǎng)的品種具有重要作用。

表1 黑果枸杞果實不同發(fā)育階段糖酵解關鍵酶差異表達基因

L-亮氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，因其疏水脂質鏈都具有分支的甲基基團，又稱之為分支鏈氨基酸［32］，3種支鏈氨基酸的生物合成途徑是緊密相連的［33］。在丙酮酸合成L-亮氨酸的代謝途徑中，乙酰羥酸合酶（acetohydroxyacid synthase，AHAS）由ilvBN編碼，是合成途徑上的第一個關鍵酶［34］。在 L-亮氨酸生物合成中，第二個關鍵酶為異丙基蘋果酸合成酶（Isopropylmalatesynthetase，IPMS），IPMS 由leuA基因編碼，催化2-酮異戊酸生成異丙基蘋果酸［35］，IPMS受到 L-亮氨酸的反饋抑制和反饋阻遏。ilvC基因與ilvBN基因序列在基因組上相鄰共同形成一個操縱子，表達ilvBNC基因有利于L-亮氨酸生物合成前體物α-酮基異戊酸的生成［36］。這2個關鍵酶的基因，在S2/S1中僅有2-3倍的增加，而在S3/S1 中急劇增加了527倍和584倍，說明在果實初步成型期和果實開始變色期的果實，其亮氨酸的合成并不豐富，而在果實完全成熟階段，編碼亮氨酸合成的基因表達急劇增加，有利于亮氨酸的生物合成和積累。

在黑果枸杞轉錄組分析中，分析出萜類化合物骨架生物合成Unigene 216個，二萜類化合物的生物合成Unigene 147個，說明黑果枸杞的萜類合成能力較強。糖酵解產(chǎn)物3-磷酸甘油醛、丙酮酸及乙酰CoA是萜類物質合成的前體［37］，己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶基因表達的上調將為成熟果實中的萜類合成提供更多的碳源。6-磷酸果糖激酶的Unigene在果實發(fā)育前期，表達量較少或者不表達，而在果實成熟過程中表達量逐漸增加。糖酵解在果實發(fā)育后期的增加，除了代謝中間產(chǎn)物生成的增加同時也體現(xiàn)了果實成熟后期物質積累所需要能量的增加，果實通過加大糖酵解的反應獲得部分所需能量，糖分代謝對果實干物質形成具有重要意義。萜類化合物骨架生物合成后可以為N-聚糖生物合成途徑提供二磷酸多萜醇（dolichol diphosphate），在該途徑中糖基轉移酶催化單糖從糖供體轉移到糖受體分子，參與天然產(chǎn)物黃酮類生物合成路徑，為花青素花色苷合成提供糖苷配體。

高通量測序技術具有海量數(shù)據(jù)、可靠性高、實驗操作簡單、節(jié)約時間等優(yōu)點，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應用于生命科學、農業(yè)等領域［38］。此外，如何對測序獲得的海量數(shù)據(jù)進行有效分析，也對研究人員在專業(yè)性和生物信息學分析能力提出了更高的要求。亮氨酸生物合成代謝途徑，總體上有39個差異表達基因，其中36個上調基因，3個下調基因。編碼糖酵解過程中3個不可逆的反應步驟限速酶：己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的家族基因，其表達量在黑果枸杞果實發(fā)育階段呈現(xiàn)出逐漸增高的規(guī)律。

4 結論

在黑果枸杞果實中鑒定出次生代謝物合成代謝途徑基因3 380個。黑果枸杞果實成熟發(fā)育過程中

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（責任編輯 馬鑫）

Differential Expression Analysis of Gene Expression Profiles During Fruit Development and Ripening of Lycium ruthenicum

PENG Yong1CHEN Shang-wu1MA Hui-qin2
（1. College of Food Sciences and Nutrition Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083；2. College of Horticulture，China Agricultural University，Beijing 100193）

The purpose of this study was to sequence the transcriptome at 3 different developmental stages of Lycium ruthenicum Murr. fruit，as well as analyze and compare the variations of their gene expression profiles. The RNAs of the fruits were extracted，and sequenced by Illumina high-throughput，then the their functions were annotated and classified using public database such as GO，KEGG，etc.，further their genes were compared and analyzed by digital gene expression profiles. Enrichment analysis results by KEGG pathway showed that in the “l(fā)eucine biosynthesis pathway”，there were 7 genes differentially expressed in color changing vs early light green skin stage，while 35 differentially expressed genes in full ripening stage vs color changing stage，and all were up-regulated. The gene expressions of 3 rate-limiting enzymes in the non-reversible reactions of glycolysis all were up-regulated in the full ripening stage. Moreover，the functions and metabolic pathways of all genes involved in leucine biosynthesis and glycolysis of L. ruthenicum fruit were analyzed，aiming at providing the theoretical basis for exploring the germplasm of L. ruthenicum.

Lycium ruthenicum；fruit ripening；gene expression profile；differential expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.017

2016-02-28

彭勇，男，博士研究生，研究方向：植物產(chǎn)品生理功能；E-mail：yong@cau.edu.cn

馬會勤，女，博士，研究方向：葡萄栽培與分子生物學；E-mail：hqma@cau.edu.cn