楊 芹, 陳海琴, 陳 思, 顧震南, 張 灝, 陳永泉, 陳 衛(wèi)

江南大學食品學院, 江蘇 無錫 214122

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高山被孢霉ω-3脂肪酸脫飽和酶基因在麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的表達

楊 芹, 陳海琴*, 陳 思, 顧震南, 張 灝, 陳永泉, 陳 衛(wèi)

江南大學食品學院, 江蘇 無錫 214122

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)具有快速、方便等特點，能表達對活細胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽，近年來被廣泛應用。以來自產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉多不飽和脂肪酸合成途徑中的關鍵膜結合酶——ω-3脂肪酸脫飽和酶為研究對象，構建了適宜體外表達ω-3脂肪酸脫飽和酶的表達載體pIVEX WG1.4-FADS15，并利用麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)實現(xiàn)了對該基因的高效表達。同時，通過在麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成過程中添加脂質(zhì)體的方法，將所表達的膜蛋白正確定位至脂質(zhì)體磷脂雙分子層，以便目標蛋白質(zhì)的正確折疊。研究結果顯示，在此實驗條件下目標蛋白質(zhì)的表達量達1.8 mg/mL，經(jīng)碘海醇密度梯度超速離心純化后，該蛋白質(zhì)的純度可以達到90%以上。研究結果為后續(xù)對該酶進行催化特性研究和蛋白質(zhì)晶體結構解析奠定了基礎。

高山被孢霉；ω-3脂肪酸脫飽和酶；麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)；脂質(zhì)體；蛋白純化

在產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)中，ω-3脂肪酸脫飽和酶是催化底物ω-6脂肪酸轉化為ω-3脂肪酸的關鍵酶，高山被孢霉菌體中ω-6脂肪酸的含量可達到總脂的30%左右，而ω-3脂肪酸僅占總脂的3%[1]。因此，加大對ω-3脂肪酸脫飽和酶的研究是提高高山被孢霉中ω-3脂肪酸產(chǎn)量的必需途徑。目前對ω-3脂肪酸脫飽和酶的研究主要集中在對其底物的催化特性上，有文獻表明，不同來源的ω-3脂肪酸脫飽和酶序列高度保守，但其底物偏好性卻存在著較大差異[2～10]。因此，全面考察ω-3脂肪酸脫飽和酶的催化特性并實現(xiàn)其蛋白質(zhì)晶體結構的解析對提高ω-3脂肪酸的產(chǎn)量具有重要的指導意義。

為獲得ω-3脂肪酸脫飽和酶的重組蛋白質(zhì)，研究者們嘗試了在不同的表達系統(tǒng)中重組表達不同菌株來源的ω-3脂肪酸脫飽和酶。2004年，Takahiro等[11]使用釀酒酵母異源表達了來自乳酸克魯維酵母Saccharomyceskluyveri的ω-3脂肪酸脫飽和酶基因，發(fā)現(xiàn)其催化底物為十八碳和二十碳的長鏈脂肪酸。將串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)的ω-3脂肪酸脫飽和酶在大豆種子中進行表達，發(fā)現(xiàn)可以使其ω-3/ω-6(ALA/AA)比值提高45倍[12]。2013年，Xue等[13]在3株卵菌Oomycetes中發(fā)現(xiàn)了能在直鏈脂肪酸17位碳上進行脫飽和反應的ω-3脂肪酸脫飽和酶，并將其在耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)中表達，結果顯示它們可以同時利用酰基輔酶A(Acyl-CoA)形式和磷脂形式的C18和C20的長鏈脂肪酸底物。雖然上述報道均考察了不同來源的ω-3脂肪酸脫飽和酶的蛋白質(zhì)功能，但其在細胞表達系統(tǒng)中表達量很低，無法進行定量檢測，亦無蛋白純化的研究報道，因此無法全面考察其酶學特性及催化活性。本實驗室使用畢赤酵母表達系統(tǒng)(Pichiapink expression system)對來源于高山被孢霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶進行了表達，雖對其實現(xiàn)了定量檢測，但表達量仍停留在微克級[14]。

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為一種開放的蛋白質(zhì)表達方式，其蛋白質(zhì)表達量可以達到毫克級別；而且由于該表達周期短、操作方便，近年來已被用來大量表達膜蛋白[15～17]。2005年，Ishihara等[18]使用自制的大腸桿菌無細胞抽提物合成了1 mg/mL的G蛋白耦聯(lián)受體蛋白質(zhì)；2008年，Goren等[19]首次使用麥胚無細胞蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)成功表達了人類硬脂酰脂肪酸脫飽和酶，表達量達到了1.6 mg/mL；2009年，Shimono等[20]用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)合成了跨膜蛋白質(zhì)細菌視紫紅素，表達量達5 mg/mL。

綜上，本文以麥胚無細胞蛋白質(zhì)轉錄翻譯耦聯(lián)系統(tǒng)為基礎，結合蛋白質(zhì)合成過程中脂質(zhì)體的添加，成功表達了來自高山被孢霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶基因，蛋白質(zhì)表達量達1.8 mg/mL，整個反應過程操作簡便、周期短。此方法為脂肪酸脫飽和酶類膜蛋白的表達提供了一種高效可行的方法，也為后續(xù)對該酶進行催化特性研究和蛋白質(zhì)晶體結構解析奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達載體pIVEX WG1.4購自Roche公司；質(zhì)粒pPinkα-FADS15由本實驗室自行構建[14]；克隆載體EscherichiacoliDH5α由本實驗室提供。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、蛋白質(zhì)分子量標準均購自TaKaRa公司；KOD Plus高保真DNA聚合酶購自ToYoBo公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自Fermentas公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；1 kb Plus DNA Ladder相對分子質(zhì)量標準購自中科泰瑞生物科技有限公司；核酸染料(Goldview)購自賽百盛基因技術有限公司；麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成試劑盒購自Roche公司；大豆脂質(zhì)提取物(soybean lipid extract)購自Avanti Polar Lipids公司；Accudenz購自Accurate Chemical and Scientific Corporation公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；DNA測序由北京華大基因有限公司完成。

PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司；超速離心機購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組表達載體的構建 以本實驗室構建保存的質(zhì)粒pPinkα-FADS15為模板，利用引物：F：5′-ATAAGAATGCGGCCGCATGGCACCCCCTCACGTTGTC-3′和R：5′-GGCGAGCTCCTAATGCTTGTAGAACACTACGTCTCCC-3′(下劃線為酶切位點)進行PCR擴增，克隆有NotⅠ和XhoⅠ的DNA片段連接至含有組氨酸親和標簽(His-tag)的表達載體pIVEX WG1.4中得到重組質(zhì)粒pIVEX WG1.4-FADS15(圖1,彩圖見封三圖版)，轉化至E.coliDH5α細胞，篩選陽性克隆，進行PCR驗證、酶切驗證及測序驗證。

圖1 重組質(zhì)粒pIVEX WG1.4-FADS15的構建Fig.1 Schematic map of recombinant plasmid pIVEX WG1.4-FADS15. (彩圖見封三圖版)

1.3.2 麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達ω-3脂肪酸脫飽和酶 將重組菌株E.coliDH5α/pIVEX WG1.4-FADS15劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基中(含100 μg/mL氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒，并在麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中表達，所用試劑盒為RTS 100 wheat germ CECF kit，各成分添加量見表1。

RTS 100 wheat germ CECF kit每個反應體積為50 μL，在900 r/min轉速下24℃反應16 h，反應結束后蛋白質(zhì)混合物儲存于-20℃。

取5 μL反應混合物，用50 μL -20℃預冷的丙酮于4℃沉淀10 min，后4℃ 13 000 g離心30 min，待沉淀中丙酮完全揮發(fā)后，加入20 μL SDS-PAGE上樣緩沖液(1×)，100℃煮10 min，分別進行SDS-PAGE和Western Blot檢測，具體操作參考《分子克隆實驗指南》文獻[21]。

表1 麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(CECF)組成

Table 1 The composition of wheat-germ continuous exchange cell-free (CECF) system.

反應液體積(μL)補給液體積(μL)麥胚裂解液15氨基酸80反應混合物15甲硫氨酸20氨基酸4補給混合物900甲硫氨酸1表達載體(含2μgDNA)5～15不含DNA和RNA酶的水補充體積到50μL

1.3.3 添加脂質(zhì)體條件下ω-3脂肪酸脫飽和酶的表達 取0.03 g大豆脂質(zhì)提取物，溶于5 mL三氯甲烷后，真空旋轉蒸發(fā)除去三氯甲烷，復溶于1 mL水合緩沖液(含有0.9% NaCl，5%葡萄糖，10%蔗糖)中，在55℃下孵育1 h，所得溶液于55℃超聲5～10 min，待溶液變澄清即為濃度30 mg/mL脂質(zhì)體，-80℃保存。

按照1.3.2的蛋白質(zhì)表達方案，在反應10.5 h處添加上述制備的脂質(zhì)體2 μL，繼續(xù)以相同參數(shù)反應至16 h后結束，取樣進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

1.3.4 ω-3脂肪酸脫飽和酶重組蛋白質(zhì)的純化[22]取45 μL 1.3.3反應后混合液，加入含25 mmol/L Hepes、pH 7.4、100 mmol/L NaCl和30%(V/V)甘油的緩沖液至體積為75 μL，再加入等體積的80% Accudenz [Accudenz溶解于含有25 mmol/L Hepes，100 mmol/L NaCl，pH 7.4和10%(V/V)甘油的緩沖液中]混合，隨后加入350 μL 30% Accudenz(同上)，最后用100 μL緩沖液(25 mmol/L Hepes、100 mmol/L NaCl，pH 7.4)覆蓋，17 000 g、4℃超速離心2 h，上清即為純化蛋白質(zhì)，取樣進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建

重組質(zhì)粒pIVEX WG1.4-FADS15在目的片段的5′和3′兩端分別添加了翻譯起始高效強化元件，使蛋白質(zhì)表達效率提高；5′端的His-tag親和標簽可用作Western Blot檢測。使用引物F和R對重組質(zhì)粒進行PCR驗證，得到1.2 kb單條帶；NotⅠ和XhoⅠ進行雙酶切驗證，得到3.3 kb和1.2 kb的雙條帶，與預期結果一致(圖2)，經(jīng)測序驗證，目標片段序列正確。

圖2 重組質(zhì)粒pIVEX WG1.4-FADS15的酶切鑒定Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasmid pIVEX WG1.4-FADS15. M：蛋白質(zhì)分子量標準；1：質(zhì)粒pIVEX WG1.4-FADS15；2：經(jīng)NotⅠ/XhoⅠ雙酶切后的pIVEX WG1.4-FADS15質(zhì)粒片段；3：質(zhì)粒pIVEX WG1.4-FADS15中目的基因FADS15的PCR擴增。

2.2 麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達ω-3脂肪酸脫飽和酶

麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達的ω-3脂肪酸脫飽和酶的SDS-PAGE及Western Blot結果如圖3所示。Western Blot選用Anti-His Antibody作為一抗，Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG作為二抗。蛋白質(zhì)樣品預先通過丙酮沉淀以除去多余的雜質(zhì)，使目的條帶更清晰可見。

從圖3中可以看出，相對于空白對照組，實驗組在分子量45 kDa附近有一明顯的條帶，并與目的條帶的理論分子質(zhì)量相符[14]；而且其表達量與葡萄糖醛酸酶(GUS)陽性對照(泳道1中66 kDa處)的表達量(>400 μg/mL)相當，由此確定麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以實現(xiàn)對ω-3脂肪酸脫飽和酶的表達。

圖3 麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達的ω-3脂肪 酸脫飽和酶的SDS-PAGE(A)和Western Blot 分析(B).Fig.3 SDS-PAGE(A) and Western Blot analysis(B) of ω-3 fatty acid desaturase expressed in the wheat germ cell-free protein expression system.注：M：蛋白質(zhì)分子量標準；1：葡萄糖醛酸酶陽性對照；2：FADS15；3：陰性對照。

2.3 添加脂質(zhì)體條件下ω-3脂肪酸脫飽和酶的表達

與多數(shù)脂肪酸脫飽和酶類似，ω-3脂肪酸脫飽和酶是一種膜整合蛋白質(zhì)，膜結構的存在能為其正確折疊提供合適的疏水環(huán)境[23]。本文嘗試了在麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)過程中添加脂質(zhì)體以使目標蛋白質(zhì)正確折疊。SDS-PAGE及Western Blot結果顯示添加脂質(zhì)體后目標蛋白質(zhì)表達量與不添加時目標蛋白質(zhì)表達量相當(圖4)。以BSA為標準樣品，經(jīng)Bradford測定蛋白質(zhì)濃度，并通過Quantity One軟件進行灰度掃描，確定目標蛋白質(zhì)濃度為1.8 mg/mL。說明該無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在此條件下可高效合成ω-3脂肪酸脫飽和酶，脂質(zhì)體的添加不會影響目標蛋白質(zhì)的表達量。

圖4 添加脂質(zhì)體后ω-3脂肪酸脫飽和酶在麥胚無 細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中表達情況的SDS-PAGE(A) 和Western Blot分析(B)Fig.4 The SDS-PAGE(A) and Western Blot analysis(B) of ω-3 fatty acid desaturase expressed in the wheat germ cell-free protein expression system in the presence of liposome.注：M：蛋白質(zhì)分子量標準; 1:ω-3脂肪酸脫飽和酶在不添加脂質(zhì)體的麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的表達；2:ω-3脂肪酸脫飽和酶在添加脂質(zhì)體的麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的表達。

2.4 ω-3脂肪酸脫飽和酶重組蛋白質(zhì)的純化

脂質(zhì)體與翻譯后的ω-3脂肪酸脫飽和酶結合形成脂質(zhì)體蛋白質(zhì)復合物(proteoliposome)，經(jīng)Accudenz密度梯度離心后，脂質(zhì)體蛋白質(zhì)復合物處于離心管上方約30%處，未結合脂質(zhì)體的重組蛋白質(zhì)則存在于離心管底部。SDS-PAGE和Western Blot結果分析顯示經(jīng)密度梯度離心純化后在45 kDa處有一明顯的目標蛋白質(zhì)條帶(圖5)，Quantity One軟件分析表明純化后的重組蛋白質(zhì)FADS15純度大于90%。

圖5 重組蛋白質(zhì)純化后的SDS-PAGE(A)和 Western Blot分析(B)Fig.5 SDS-PAGE(A) and Western Blot analysis(B) of the recombinant protein after purification.注：M：蛋白質(zhì)分子量標準；1：純化前的ω-3脂肪酸脫飽和酶；2：純化后的ω-3脂肪酸脫飽和酶。

3 討論

ω-3脂肪酸脫飽和酶作為催化ω-6脂肪酸生成ω-3脂肪酸的關鍵酶，近年來獲得較多關注。但由于在傳統(tǒng)的表達系統(tǒng)中ω-3脂肪酸脫飽和酶的過表達會使宿主細胞生長緩慢，甚至死亡。前期我們嘗試在畢赤酵母表達系統(tǒng)里表達ω-3脂肪酸脫飽和酶，實現(xiàn)了在 PichiaPinkTM酵母表達系統(tǒng)中pPinkα-HC-FADS15質(zhì)粒的重組表達，F(xiàn)ADS15基因能夠整合到畢赤酵母基因組并進行穩(wěn)定的遺傳表達。重組表達過程中畢赤酵母首先使用 BMGY培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，后使用BMMY培養(yǎng)基誘導 ω-3脂肪酸脫飽和酶表達，中途兩次添加0.5%甲醇誘導，48 h后收菌，得到目標蛋白質(zhì)表達量為0.13 mg/mL。因此蛋白質(zhì)表達量偏低，使得其相關研究主要局限在其底物偏好性等少數(shù)生理功能，無法全面考察其酶學特性及催化活性。本文使用麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，解除了細胞膜對蛋白質(zhì)合成的限制。膜結合蛋白質(zhì)在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中以兩種表達形式進行[24]。其一是在體系中不添加外源膜結構物質(zhì)，使得表達的蛋白質(zhì)以沉淀形式存在，隨后將其溶解于合適的去垢劑或脂質(zhì)體中形成可溶性的脂質(zhì)體蛋白質(zhì)復合物，進而實現(xiàn)目標蛋白的分離；另一種是在無細胞反應過程中添加脂質(zhì)體，使翻譯后的蛋白質(zhì)直接嵌入到脂質(zhì)體中重構得到脂質(zhì)體蛋白質(zhì)復合物。在本工作中我們同時考察了這兩種表達形式。但是實驗結果表明在不添加外源的脂質(zhì)體時，麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達出來的以沉淀形式存在的ω-3脂肪酸脫飽和酶，無法在與脂質(zhì)體或1%的Fos-Choline 16混合孵育之后被整合為可溶性蛋白質(zhì)。采用脂質(zhì)體或表面活性劑與反應后沉淀蛋白質(zhì)混合的實驗方案無法獲得可溶蛋白。

因此在上述實驗的基礎上，我們采取第二種方案，在麥胚無細胞蛋白質(zhì)合成體系中添加脂質(zhì)體以使目標蛋白質(zhì)正確折疊[25]，獲得可溶性目標膜蛋白。通過對脂質(zhì)體添加濃度及時間的優(yōu)化，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的可溶性表達，并確定在反應進行10.5 h 時添加終濃度為1.2 mg/mL的脂質(zhì)體為最佳條件。此時ω-3脂肪酸脫飽和酶表達量達到毫克級(1.8 mg/mL)，可溶蛋白質(zhì)表達量為0.23 mg/mL。經(jīng)進一步純化，每毫升反應液可得到57 μg純度大于90%的重組蛋白質(zhì)，這為ω-3脂肪酸脫飽和酶的催化特性研究和晶體結構分析提供了充足的原材料，同時也為脂肪酸脫飽和酶類膜蛋白的合成提供了一種簡便高效的表達方法。

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Expression of the ω-3 Fatty Acid Desaturase fromMortierellaalpinain Wheat-germ Cell-free Protein Expression System

YANG Qin, CHEN Hai-qin*, CHEN Si, GU Zhen-nan, ZHANG Hao, CHEN Yong-quan, CHEN Wei

SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,JiangsuWuxi214122,China

Cell-free protein expression system as a tool of rapid and convenient protein expression has been widely used in producing membrane proteins and antibacterial peptides that have certain toxicity to living cells. In this paper, the membrane-bound ω-3 fatty acid desaturase gene, which encoding the key enzyme involving in the polyunsaturated fatty acid biosynthesis pathways in the oleaginous fungiMortierellaalpina, was cloned into the in vitro expression vector pIVEX WG1.4, and expressed in the wheat-germ cell-free protein expression system. To get the correctly folded ω-3 fatty acid desaturase FADS15, liposomes that was able to relocate the expressed membrane protein into the phospholipid bilayer were also added in the process of cell-free protein synthesis, and the production of FADS15 reached 1.8 mg/mL, after accudenz density gradient centrifugation, the purity of FADS15 was higher than 90%. This research work paved the way for the further study of catalytic property and crystal structure analysis of this enzyme.

Mortierellaalpina; ω-3 fatty acid desaturase; wheat-germ cell-free protein expression system; liposome; protein purification

2016-05-12; 接受日期：2016-06-03

國家自然科學基金項目(21276108)資助。

楊芹，講師，主要從事脂質(zhì)研究。E-mail:qyang@jiangnan.edu.cn。*通信作者：陳海琴，教授，研究方向為微生物與分子生物學。E-mail: haiqinchen@jiangnan.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.07