李 梅, 劉金華, 樓兵干, 高其康，

(浙江大學(xué) a.農(nóng)生環(huán)分析測試中心; b.昆蟲科學(xué)研究所; c.生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058)

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植物鮮樣中游離氨基酸提取方法的比較

李 梅a, 劉金華b, 樓兵干c, 高其康a，b

(浙江大學(xué) a.農(nóng)生環(huán)分析測試中心; b.昆蟲科學(xué)研究所; c.生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058)

為了對比不同提取液、溫度、時間和純化試劑對植物鮮樣中各游離氨基酸提取效率的影響，以油菜鮮葉為例進行加標(biāo)回收試驗方法，通過氨基酸分析儀PF柱進行標(biāo)準(zhǔn)方法分析測定。結(jié)果表明：4種不同提取劑提取油菜鮮葉中游離氨基酸,水、0.1 mol/L鹽酸和5%磺基水楊酸的提取效果都優(yōu)于80%乙醇，以水提取后的顏色最為清亮,適于氨基酸分析儀直接分析；4 ℃時17種氨基酸平均回收率94.23%,高于80 ℃和100 ℃時的88.4%和87.4%，17種氨基酸平均回收率除纈氨酸外,其余氨基酸從1～24 h沒有顯著變化；80%乙醇優(yōu)于5%磺基水楊酸，但兩者整體回收率都較未純化前有所下降。采用優(yōu)化后的提取方法測定油菜幼苗的游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)能有效篩選出抗逆品種。

植物鮮樣； 游離氨基酸； 提??； 純化

0 引 言

植物中氨基酸主要有兩種存在形式，一種以游離態(tài)形式存在;另一種以結(jié)合態(tài)存在于肽和蛋白質(zhì)中[1]。關(guān)注植物中游離氨基酸含量變化,主要有以下兩個方面:①對食用口感影響重大的呈味氨基酸和有營養(yǎng)保健、藥用價值的非蛋白氨基酸,如牛磺酸、γ-氨基丁酸、茶氨酸等只以游離形式存在；②由于一般植物體內(nèi)游離氨基酸含量很低，在各種脅迫條件下，如干旱[2]、水分[3]、鹽分[4]及重金屬[5]等逆境時,游離氨基酸含量尤其脯氨酸會有顯著增加，故植物游離氨基酸含量變化是植物抗逆重要生理指標(biāo)[6]。

現(xiàn)今對植物游離氨基酸提取方法的研究中以干樣較多和較為成熟，而在科研實踐中植物抗逆生理指標(biāo)游離氨基酸的測定時，常選用鮮樣，這樣可避免因干燥過程所帶來的干擾，尤其一些在干燥過程中游離氨基酸會有很大變化的植物，如煙草[7-8]、茶葉[9]和菌菇類[10]。干樣通常經(jīng)高溫殺青、烘干和粉碎而成，高溫過程中蛋白質(zhì)變性，其蛋白酶的生物活性也喪失，鮮樣在研磨成勻漿過程中蛋白質(zhì)和一些酶類等極易被提出，易造成蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致游離氨基酸含量增加而產(chǎn)生誤差。由此可見，鮮樣和干樣在提取方法上應(yīng)有所區(qū)別。

影響植物中游離氨基酸的提取因素主要由提取劑，提取溫度、時間和純化試劑(主要去除蛋白質(zhì))構(gòu)成。Arnaiz[11]對比不同提取劑(70%甲醇和水)提取花椰菜葉片中游離氨基酸，發(fā)現(xiàn)在總量及個別氨基酸表現(xiàn)不一致。對青天葵[12]和鹿藥[13]等中草藥植物不同提取劑提取試驗表明，水提取效果優(yōu)于不同濃度乙醇。Carpenaruiz[14]對蕃茄葉片總游離氨基酸提取和測定，發(fā)現(xiàn)40 ℃時高于100 ℃。提取后以不同純化方法的試驗也表明純化效果也有所差別，路蘋[15]證實用5%磺基水楊酸優(yōu)于陽離子樹脂柱。以上均是植物干樣的方法研究，對于植物鮮樣其影響游離氨基酸各提取因素的方法鮮有報道，王均鑒等[16]以鮮樣為材料做了不同提取劑的對比研究，但對于其他影響因素尚未探討。本研究利用氨基酸分析儀，選取常用提取劑水、低濃度的鹽酸、磺基水楊酸和80%乙醇，及常用去除蛋白質(zhì)等分析雜質(zhì)的純化試劑磺基水楊酸和乙醇[17]，通過加標(biāo)回收試驗對比不同提取液、溫度、時間和純化試劑對植物鮮樣中各游離氨基酸提取的影響，探討適于植物鮮樣游離氨基酸的樣本提取方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

日立L- 8900型氨基酸分析儀(日本日立公司) ；天平(德國賽多利斯BS 323S)；恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司，DKS-12)；高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司， SCIENTZ-48)；離心機(艾本德5424R)；光照培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；純水儀(上海優(yōu)普UPR超純水系統(tǒng))。

檸檬酸、檸檬酸鋰、氯化鋰、氫氧化鋰(日本和光公司)；無水乙醇(優(yōu)級純，上海國藥)；丙二醇甲醚(進口分裝，上海國藥) ；醋酸鈉；茚三酮；苯甲醇；冰醋酸；磺基水楊酸(分析純、上海國藥) 。標(biāo)樣：Type H、Type B、Type AN-Ⅱ氨基酸混標(biāo)( 日本和光純)。

緩沖液和反應(yīng)液的配制：按照L-8900型氨基酸分析儀操作手冊上的配方進行配制。

印度梨形孢培養(yǎng)和油菜幼苗的印度梨形孢定殖參照陳佑源等的方法[18]。實驗選取經(jīng)病原菌侵染的印度梨形孢定殖和對照油菜苗葉片，用研磨儀打成勻漿，選擇不同游離氨基酸的提取方法進行提取。

1.2 色譜條件

色譜條件：柱子(#2522SCPF，4.6 mm×60 mm)，梯度洗脫，分離柱柱溫57 ℃，反應(yīng)柱柱溫135 ℃，緩沖液流速0.35 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min。分析方法：L89-PF4.6*60-2622.met，通道1: 檢測波長570 nm;通道2: 檢測波長440 nm，進樣量20 μL。

1.3 實驗步驟

(1) 提取劑對游離氨基酸回收率的影響。選取常用的游離氨基酸提取劑水，0.1 mol/L鹽酸，5%磺基水楊酸和80%乙醇。以4種提取劑對標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的回收率選擇出較佳提取劑。

油菜葉片勻漿若干份，每份0.15 g，一份直接用無離子水定容至1.5 mL，一份加入60 μL標(biāo)樣后再用水定容至1.5 mL，80 ℃水浴30 min后，9 000 r/min離心15 min，取上清液，0.45 μm的水相膜過濾待測。分別用0.1 mol/L的鹽酸，5%磺基水楊酸和80%乙醇代替上述中的水進行樣品制備。

(2) 提取溫度對游離氨基酸回收率的影響。根據(jù)上述實驗所選出的提取劑，進行不同溫度的提取實驗，依據(jù)回收率選出較佳處理劑。分別用4 ℃，24 h;80 ℃，30 min和100 ℃，30 min進行處理，步驟同上。

(3) 提取時間對游離氨基酸回收率的影響。根據(jù)上述實驗所選出的提取劑和溫度等參數(shù)，進行不同時間的提取實驗，依據(jù)回收率選出較佳處理劑。分別用1、3、6、12和24 h進行處理，步驟同上。

(4) 不同純化試劑對游離氨基酸回收率的影響。根據(jù)上述較佳提取劑、溫度和時間等因素，進行提取液純化試驗。選取兩種常用除蛋白試劑，磺基水楊酸和乙醇，純化試劑∶提取液= 1∶1(體積比)，經(jīng)4 ℃過夜后9 000 r/min離心15 min, 取上清液過0.45 μm的水相膜待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑對各游離氨基酸的回收率影響

本研究以4種常見的提取劑對植物鮮樣中游離氨基酸的提取效果進行了比較，在儀器線性范圍內(nèi)通過添加標(biāo)準(zhǔn)品，以回收率為指標(biāo)所測結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,①4種不同提取劑的整體回收率：酸性氨基酸>中性氨基酸>堿性氨基酸。②80%乙醇與其他3種提取劑相比，提取效果較差。絲氨酸、脯氨酸、胱氨酸和組氨酸回收率顯著低于其他3種提取劑，其中胱氨酸回收率不到40%，精氨酸的回收率偏高。③水、0.1 mol/L鹽酸和5%磺基水楊酸對各氨基酸的提取效果整體相當(dāng)，除了堿性氨基酸(賴氨酸、組氨酸和精氨酸)的回收率偏低外，其余氨基酸回收率均在80%以上。0.1 mol/L鹽酸對天冬氨酸回收率低于其他兩種提取劑，5%磺基水楊酸對纈氨酸回收率低于其他兩種提取劑，同時對胱氨酸回收率高于水和0.1 mol/L鹽酸。④4種提取液只有水提取的顏色清亮，適于氨基酸分析儀直接分析。80%乙醇提取液呈現(xiàn)綠色，這是由于乙醇將植物中的葉綠素溶解出來；0.1 mol/L鹽酸和5%磺基水楊酸提取液偏粉紅色，這是由于在酸性環(huán)境下葉綠素又轉(zhuǎn)化為花青素而呈紅色。色素[17]的存在一方面影響氨基酸含量的測定，另一方面使分析柱壓力升高；用活性炭脫色會吸附芳香族氨基酸而影響其測定。鑒于植物鮮樣組織中的色素比較容易被提出，故在此選擇水作為提取劑。同時有研究認(rèn)為，用化學(xué)溶劑提取法會在一定程度上誘導(dǎo)植物中有生物活性的成分發(fā)生熱降解[19-20]，而本方法中用水提取則可以很好地避免這一問題。

圖1 不同提取劑測定游離氨基酸的回收率(n=5)

2.2 提取溫度對游離氨基酸回收率的影響

以水作為提取劑,3個不同溫度提取效果回收率測定結(jié)果見圖2。從圖2可以看出：①用80 ℃和100 ℃提取時，其回收率除了賴氨酸、組氨酸和精氨酸回收率較低外，其余氨基酸回收率均在80%以上；谷氨酸的回收率100 ℃時低于80 ℃，胱氨酸的回收率100 ℃高于80 ℃，其余氨基酸兩種溫度提取回收率無顯著差異，可見溫度增加到一定程度后對氨基酸提取回收率提高沒有明顯作用。②4 ℃提取回收率，各氨基酸均在80%以上，與80 ℃和100 ℃相比，3種堿性氨基酸回收率增加顯著；酪氨酸回收率4 ℃時顯著高于80 ℃和100 ℃；說明低溫長時間浸提對于堿性和含苯環(huán)的氨基酸回收率的提高是有效的。③17種氨基酸按照出峰順序(酸性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸)，前8種氨基酸回收率除了谷氨酸和纈氨酸4 ℃與80 ℃和100 ℃有顯著性差異偏低外，其余6種氨基酸無明顯差異，且4 ℃除了丙氨酸和纈氨酸，其余6種氨基酸回收率均在90%以上；后9種氨基酸平均回收率除亮氨酸和苯丙氨酸各溫度無顯著差異，余下7種4 ℃時均顯著高于80 ℃和100 ℃。④4 ℃、80 ℃和100 ℃時，17種氨基酸平均回收率分別為94.23%、88.4%和87.4%。結(jié)果顯示，較低的溫度已經(jīng)能夠充分提取樣本中的游離氨基酸，而溫度過高反而不利于游離氨基酸的提取，這與Carpenaruiz[14]以植物干樣所測結(jié)果一致。

圖2 不同提取溫度測定游離氨基酸的回收率(n=5)

2.3 提取時間對游離氨基酸回收率的影響

以水為提取劑,在4 ℃時不同提取時間回收率測定結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出：①不同提取時間(1～24 h)下,除了1 h丙氨酸的回收率低于80%，其余均高于80%。不同提取時間下各氨基酸回收率幾乎沒有顯著變化，除了纈氨酸回收率在提取24 h比其他幾種處理偏低外。②提取時間為1、3、6、12和24 h時，17種氨基酸平均回收率分別為92.04%、91.35%、94.19%、91.95%和94.23%。不同提取時間結(jié)果表明，在4 ℃下1 h就可以比較充分地提取了其中的游離氨基酸，延長時間沒有發(fā)現(xiàn)游離氨基酸的量明顯增加，這與多數(shù)游離氨基酸易溶于水的性質(zhì)相關(guān)，而延長時間也沒有發(fā)現(xiàn)游離氨基酸的量下降的情況，這與氨基酸在4 ℃低溫下相對比較穩(wěn)定不會降解有關(guān)?？梢妼τ谥参秕r樣來說，用水提取游離氨基酸1～24 h都是可以的。

圖3 不同提取時間測定游離氨基酸的回收率(n=5)

2.4 不同純化試劑對游離氨基酸回收率的影響

用4 ℃水浸提后，分別用80%乙醇和5%磺基水楊酸純化，其添加標(biāo)樣回收率見圖4。由圖可見:①兩種純化方法與未純化相比，除谷氨酸和甘氨酸外，其余氨基酸平均回收率均有不同程度下降，這與一般純化過程對各氨基酸有不同程度的損失相關(guān)。在此分析主要由于有機溶劑，酸和堿常會使氨基酸發(fā)生脫氨作用或脫羧形成胺類，不是所有的胺類都能和茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，故回收率下降。②純化過程對17種氨基酸的影響如下：對脯氨酸影響最??；其中谷氨酸和甘氨酸未純化的回收率比5%磺基水楊酸要高，同時低于80%乙醇，其原因有待進一步查證；對余下14種氨基酸回收率都有顯著影響，以丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和精氨酸的回收率影響最大，其回收率極差值30%～47.5%。③兩種純化試劑以80%乙醇的純化損失較小。如80%乙醇純化時，胱氨酸和蛋氨酸的回收率高于5%磺基水楊酸純化。④17種氨基酸未純化的平均回收率94.23%，80%乙醇和5%磺基水楊酸純化后平均回收率分別為81.18% 和75.36%。分析未純化樣品時其分析柱壓未見明顯上升，對于含蛋白不多的植物鮮樣經(jīng)低溫研磨和低溫提取后，其蛋白雜質(zhì)對氨基酸分析影響有限，鑒于純化過程會造成游離氨基酸的損失，故植物鮮樣在無其他影響分析測定的因素外，可用水低溫提取后直接上樣分析測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

圖4 不同純化方法測定游離氨基酸的回收率(n=5)

2.5 油菜鮮樣中游離氨基酸的測定

根據(jù)上述分析，選用4 ℃水提取24 h對印度梨形孢定殖處理和對照油菜鮮樣中的游離氨基酸分析和測定，對比38種氨基酸標(biāo)樣圖譜如圖5所示(在此顯示第一通道圖譜，pro在第二通道檢測)。發(fā)現(xiàn)油菜中除了含有常見的蛋白氨基酸，還有5種非蛋白氨基酸，另檢出3種(圖5中1～3)因標(biāo)樣中沒有而未知的氨基酸，共定量檢出22種游離氨基酸。

圖5 油菜鮮樣游離氨基酸和38種標(biāo)樣圖譜

對處理和對照油菜鮮樣中游離氨基酸含量分析(見表1)表明。經(jīng)印度梨形孢定殖處理的油菜中脯氨酸含量明顯高于對照，是對照的12.7倍。用此方法制備的樣品，儀器運行期間壓力平穩(wěn)，峰形及分離度均較好，證實是一個切實可行的適于植物鮮樣中游離氨基酸的提取方法。

表1 油菜鮮樣游離氨基酸含量測定 μg/g

(1) 通過4種不同提取劑對油菜鮮葉中游離氨基酸的提取和測定，發(fā)現(xiàn)水、0.1 mol/L鹽酸和5%磺基水楊酸的提取效果都優(yōu)于80%乙醇， 其中80%乙醇、0.1 mol/L鹽酸和5%磺基水楊酸3種提取劑提取后的溶液會有色素干擾，只有用水提取后顏色最為清亮,適于氨基酸分析儀直接分析。

(2) 對水提取比較了不同溫度的提取效果，4 ℃時17種氨基酸平均回收率94.23%,高于80 ℃和100 ℃時的88.4%和87.4%，同時低溫提取能顯著提高堿性氨基酸的回收率。故用水提取采用4 ℃是較為合適的。

(3) 用4 ℃水提取不同時間，結(jié)果顯示除了纈氨酸在24 h的回收率有所下降，其余氨基酸平均回收率從1～24 h沒有顯著變化。

(4) 對比兩種不同純化試劑(除蛋白)純化效果，80%乙醇優(yōu)于5%磺基水楊酸，但兩者整體回收率都較未純化前有所下降。植物鮮樣經(jīng)低溫研磨和提取后，其蛋白雜質(zhì)對氨基酸分析影響有限，可用水4 ℃提取1～24 h后直接上樣分析。

(5) 經(jīng)印度梨形孢定殖的油菜葉片中脯氨酸的含量明顯高于對照，為印度梨形孢定殖的油菜為何能提高對病原菌的抗病性提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 于 泓, 牟世芬. 氨基酸分析方法的研究進展[J]. 分析化學(xué), 2005(3):398-404.

[2] Ahmed I M, Cao F B, Han Y,etal. Differential changes in grain ultrastructure, amylase, protein and amino acid profiles between Tibetan wild and cultivated barleys under drought and salinity alone and combined stress[J]. Food Chemistry,2013,141(3): 2743-2750.

[3] Chung I M, Kim J J, Lim J D,etal. Comparison of resveratrol, SOD activity, phenolic compounds and free amino acids in Rehmannia glutinosa under temperature and water stress[J]. Environmental and Experimental Botany,2006,56(1):44-53.

[4] Yan H, Hu X T, Li F S. Leaf photosynthesis, chlorophyll fluorescence, ion content and free amino acids in Caragana korshinskii Kom exposed to NaCl stress[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2012,34(6):2285-2295.

[5] Wen J F, Gong M, Liu Y,etal. Effect of hydrogen peroxide on growth and activity of some enzymes involved in proline metabolism of sweet corn seedlings under copper stress[J]. Scientia Horticulturae, 2013,164:366-371.

[6] Ashraf M, Foolad M R. Roles of glycine betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance[J]. Environmental and Experimental Botany, 2007,59(2):206-216.

[7] Hwang I G, Kim H Y, Woo K S,etal. Biological activities of Maillard reaction products (MRPs) in a sugar-amino acid model system[J]. Food Chemistry, 2011,126(1):221-227.

[8] Yoshida S, Kobayashi K. Role of amino acids in the formation of polycyclic aromatic amines during pyrolysis of tobacco[J]. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 2013,104:508-513.

[9] Kausar T, Akram K, Kwon J H. Comparative effects of irradiation, fumigation, and storage on the free amino acids and sugar contents of green, black and oolong teas[J]. Radiation Physics and Chemistry, 2013,86:96-101.

[10] Li X B, Feng T, Zhou F,etal. Effects of drying methods on the tasty compounds of Pleurotus eryngii[J]. Food Chemistry, 2015, 166(1):358-364.

[11] Arnaiz E, Bernal J, Martin M T,etal. Supercritical fluid extraction of free amino acids from broccoli leaves[J]. Jouranal of Chromatography A, 2012,1250:49-53.

[12] 吳月娜, 黃 松, 劉 梅, 等. 青天葵中總游離氨基酸的提取工藝研究[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2011(1):53-55.

[13] 朱玉婷, 劉俊渤, 唐珊珊, 等. 鹿藥游離氨基酸提取工藝[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013,35(6):679-683.

[14] Carpenaruiz R, Sopena A, Ramon A M. Extraction of Free Amino-Acids from Tomato Leaves[J]. Plant and Soil, 1989, 119(2): 251-254.

[15] 路 蘋, 張林生, 曹 讓, 等. 植物游離氨基酸測定中提取劑和純化方法的研究[J]. 氨基酸雜志, 1991(2):7-11.

[16] 王均鑒, 方建穎. 不同提取介質(zhì)對植物材料游離氨基酸測定的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1987(4):50-53.

[17] 劉榮森, 楊虹琦, 黃郁維, 等. 植物中游離氨基酸的提取、純化及分析方法[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2007(3):76-79.

[18] 陳佑源, 樓兵干, 高其康, 等. 印度梨形孢誘導(dǎo)油菜抗旱性機理的初步研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2013,21(3):272-281.

[19] Saunders J A, Rosentrater K A. Properties of solvent extracted low-oil corn distillers dried grains with solubles[J]. Biomass & Bioenergy, 2009,33(10):1486-1490.

[20] Vrhovsek U, Rigo A, Tonon D,etal. Quantitation of polyphenols in different apple varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004,52(21):6532-6538.

·名人名言·

大學(xué)的榮譽，不在它的校舍與人數(shù)，而在于它一代一代人的質(zhì)量。

——柯南特

Comparison of Methods for Free Amino Acid Extracted from Fresh Plant Samples

LIMeia,LIUJin-huab,LOUBing-ganc,GAOQi-kanga,b

(a. Analysis Center of Agrobiology and Environmental Sciences; b. Institute of Insect Sciences;c. Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

To study the influence of different extraction solvents, temperatures, treatment times and purification reagents on extraction efficiency of the free amino acid from fresh samples, taking rape fresh leaves as samples for standard recovery test, the contents of free amino acid from rape fresh leaves were measured. The test showed that the extraction efficiencies of water, 0.1 mol/L hydrochloric acid and 5% sulfosalicylic acid were all better than that of 80% ethanol. Especially, the color of the plant extract that extracted by water was most clean and suitable for the detection of free amino acids directly. The results of the extraction efficiency of water at different temperatures showed that the average recovery of 17 kinds of amino acid at 4 °C (94.23%) was higher than that at 80 °C (88.4%) and at 100 °C (87.4%). It indicated extraction at low temperature could significantly increase the recovery of basic amino acid. No significant changes in the average recoveries of 17 kinds of amino acid except valine were observed when extracted for different treatment times from 1 h to 24 h at 4 °C. The purification test for the plant extract that was extracted by water showed that the purification efficiency of 80% ethanol was better than that of 5% sulfosalicylic acid, but the recoveries were lower than that before purification. Therefore, the free amino acid extracted by water at 4 °C for 1 h to 24 h should be the optimized extraction method. Especially, using the optimized extraction method for determining free amino acid content, the disease-resistant rape varieties were efficiently selected from different rape varieties. The optimized extraction method was proved to be a simple, convenient and effective method for the detection of free amino acids from fresh plant sample.

fresh plant samples； free amino acids； extraction； purification

2015-06-05

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目(201216)

李 梅(1984-)，女，安徽六安人，實驗師，從事色譜類儀器分析測試。Tel.: 0571-88982237; E-mail:limei7251314@zju.edu.cn

高其康(1962-)，男， 浙江蕭山人，研究員，從事昆蟲生理生化與分子生物學(xué)研究。

Tel.: 0571-88982237; E-mail: qkgao@zju.edu.cn

Q 331

A

1006-7167(2016)04-0034-05