陳 騫，萬(wàn)小平，肖永樂(lè)，唐健雪，趙世紀(jì)，高 榮

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

豬融合抗菌肽基因雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化重組畢赤酵母菌的構(gòu)建

陳 騫，萬(wàn)小平，肖永樂(lè)，唐健雪，趙世紀(jì)，高 榮*

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

為構(gòu)建高效表達(dá)的豬融合抗菌肽蛋白的重組酵母菌發(fā)酵表達(dá)體系，規(guī)?；a(chǎn)制備新型免疫分子防控動(dòng)物傳染病，本試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的pGAPZαA-P質(zhì)粒中克隆出已構(gòu)建好的豬融合抗菌肽CAMPs基因片段。通過(guò)Infusion技術(shù)，將CAMPs片段分別克隆入pPIC9K和pPICZαA真核表達(dá)質(zhì)粒中，并通過(guò)PCR以及測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重組質(zhì)粒。通過(guò)電轉(zhuǎn)化將線(xiàn)性化pPIC9K-CAMPs轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115基因組中，并篩選高拷貝菌株GS-PK-CAMPs。再將線(xiàn)性化pPICZαA-CAMPs轉(zhuǎn)入重組酵母GS-PK-CAMPs中，篩選出高拷貝菌株GS-PKZ-CAMPs。對(duì)重組酵母GS-PKZ-CAMPs進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后作轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究，檢測(cè)抗菌肽是否表達(dá)。最終結(jié)果顯示，成功獲得了GS-PKZ-CAMPs可誘導(dǎo)表達(dá)菌株，這給豬融合抗菌肽蛋白的大規(guī)模發(fā)酵制備和應(yīng)用于動(dòng)物傳染病的防治奠定了可靠的初步基礎(chǔ)。

豬抗菌肽；融合基因；共表達(dá)；雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；畢赤酵母

抗菌肽作為宿主防御肽，是機(jī)體天然的免疫保護(hù)屏障，不但具有良好的抗菌活性，還具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性與安全性[1]，因具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制，微生物對(duì)其產(chǎn)生耐藥性的概率極低[2]。國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果表明，抗菌肽不但能夠顯著提高動(dòng)物的抗病能力，有的還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[3]。因此，抗菌肽作為新型抗感染分子制劑來(lái)替代抗生素，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)Infusion方法將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的豬融合抗菌肽基因分別插入pPIC9K和pPICZαA質(zhì)粒，再將雙重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，并進(jìn)行高拷貝菌株的篩選，對(duì)其進(jìn)行初步的基因表達(dá)發(fā)酵研究，為今后高效生產(chǎn)制備抗菌肽奠定初步基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌、載體質(zhì)粒 畢赤酵母GS115及其表達(dá)載體pPIC9K、pPICZαA，購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen公司，大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，重組質(zhì)粒pGAPZαAP為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，含豬融合抗菌肽基因。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已構(gòu)建好的基因片段和載體酶切位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)2對(duì)Infusion引物，保證CAMPs基因的PCR產(chǎn)物與載體有15 bp的同源序列：

（1）CAMPs-KF：5憶-GCTGAAGCTTACGTAGAAT TCATGAGAAGTGTGAAAA-3憶；

CAMPs-KR：5憶-AAGGCGAATTAATTCGCGG CCGCTTTAAATAGCGGCCGCCTAA-3憶；

（2）CAMPs-ZF：5憶-AGAGAGGCTGAAGCTGAAT TCATGAGAAGTGTGAAAACCAGCAAG-3憶；

CAMPs-ZR：5憶-TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCG CCTAATGGTGATGGTGATGATGCTT-3憶。

以pGAPZαA-P為模板，使用以上2對(duì)引物克隆出CAMPs-K和CAMPs-Z基因片段。使用EcoR I和Not I雙酶切載體pPIC9K和pPICZαA。使用Infusion技術(shù)，將CAMPs-K插入pPIC9K質(zhì)粒中，將CAMPs-Z插入pPICZαA質(zhì)粒中。最終獲得重組質(zhì)粒pPIC9KCAMPs和 pPICZαA-CAMPs，使用特異性引物（CAMPs-KF和CAMPs-KR、CAMPs-ZF和CAMPs-ZR）以及通用引物（5憶AOX1、3憶AOX1）進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒再經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中。

1.3 重組酵母GS-PK-CAMPs的構(gòu)建 使用質(zhì)粒大提試劑盒大量提取重組質(zhì)粒pPIC9K-CAMPs，并使用Sal I將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9K-CAMPs線(xiàn)性化。參照畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)，制作畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。將獲得的線(xiàn)性化質(zhì)粒pPIC9K-CAMPs電轉(zhuǎn)化入制備好的畢赤酵母GS115感受態(tài)中，電轉(zhuǎn)化條件為：電壓1.5kV，電容25μF，電阻200Ω，電擊時(shí)間為10ms。待電轉(zhuǎn)化完成后，將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞均勻涂布于MD平板中，30℃恒溫培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。將轉(zhuǎn)化子挑選出置于含G418濃度梯度的YPD培養(yǎng)基中，進(jìn)行高拷貝菌株的篩選。挑選耐G418濃度最高的菌株，命名為GS-PK-CAMPs。

1.4 重組酵母GS-PKZ-CAMPs的構(gòu)建 使用質(zhì)粒大提試劑盒大量提取重組質(zhì)粒pPICZαA-CAMPs，并用Sac I將其線(xiàn)性化。后將線(xiàn)性化載體電轉(zhuǎn)入篩選出的GS-PK-CAMPs感受態(tài)中，感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化條件同1.3。涂布于含Zeocin濃度梯度及G418濃度為2.0mg/mL的YPD培養(yǎng)基中，進(jìn)行高拷貝菌株的篩選。挑選耐Zeocin濃度最高的菌株，命名為GS-PKZCAMPs。使用酵母基因組提取試劑盒提取GS-PKCAMPs酵母基因組，使用CAMPs-KF和CAMPs-KR兩對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行CAMPs基因的擴(kuò)增，驗(yàn)證CAMPs基因是否成功插入酵母基因組中。

1.5 重組酵母GS-PKZ-CAMPs的基因表達(dá)分析 將1.4中構(gòu)建的GS-PKZ-CAMPs通過(guò)BMGY擴(kuò)大培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為：30℃，220r/min，培養(yǎng)24h至OD為2～6，然后3 200 r/min，5 min離心，收集菌體，轉(zhuǎn)移至BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)，甲醇濃度為0.5%，30℃，220r/min誘導(dǎo)發(fā)酵24h后收集酵母菌體。使用Trizol混合細(xì)胞菌體后，用氯仿提取，離心后取上清，再用異戊醇提取，離心后取沉淀，經(jīng)乙醇漂洗，用DEPC水溶解RNA沉淀。使用TIANGEN公司的第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄得到重組畢赤酵母GS-PK-CAMPs總RNA的cDNA文庫(kù)。使用CAMPs-KF和CAMPs-KR兩對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行CAMPs基因的擴(kuò)增，驗(yàn)證CAMPs的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 CAMPs-K的目的基因片段大小為1 660 bp，CAMPs-Z的目的基因片段大小為1672bp，二者以pGAPZαA-P為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖1所示，PCR條帶大小約為1700 bp，與預(yù)期一致，證明CAMPs基因被成功克隆。圖2為重組質(zhì)粒pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs的PCR擴(kuò)增電泳圖譜。通用引物的PCR結(jié)果顯示：兩個(gè)質(zhì)粒在2100bp左右均有明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，證明CAMPs基因已被成功插入兩個(gè)載體。值得注意的是，通用引物的PCR在1000～1500bp處存在一條帶，經(jīng)Prime Premier軟件分析，為5憶AOX1引物在CAMPs片段距5憶端511bp處配對(duì)，與3憶AOX1引物形成一條長(zhǎng)度為1158bp的PCR產(chǎn)物。最終，結(jié)果經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，插入序列正確。將二者成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌，方便后續(xù)大量提取質(zhì)粒。

圖1CAMPs基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（1%瓊脂糖凝膠）

圖2pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（1%瓊脂糖凝膠）

圖3GS-PK-CAMPs高拷貝菌株的篩選（G418濃度梯度，mg/mL）

2.2 重組酵母GS-PK-CAMPs的構(gòu)建 通過(guò)大提質(zhì)粒試劑盒，獲得了濃度為1.27 μg/μL的重組質(zhì)粒pPIC9K-CAMPs，經(jīng)線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)，然后涂于MD培養(yǎng)基中，3d后出現(xiàn)了許多轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子用少量YPD培養(yǎng)基稀釋后涂于含G418濃度梯度的YPD平板上，3d后的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖3所示。最后成功篩選到了抗G418濃度為2.0mg/mL的菌株，并命名為GS-PK-CAMPs。

2.3 重組酵母GS-PKZ-CAMPs的構(gòu)建 通過(guò)大提質(zhì)粒試劑盒，獲得了濃度為1.12μg/μL的重組質(zhì)粒pPICZαA-CAMPs，經(jīng)線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)入GS-PK-CAMPs感受態(tài)中，涂于含G418和Zeocin濃度梯度的MD平板中，3d后的生長(zhǎng)情況如圖4所示。最后成功篩選到了抗Zeocin濃度為150μg/mL的菌株，并命名為GSPKZ-CAMPs。

圖4GS-PKZ-CAMPs高拷貝菌株的篩選（Zeocin濃度梯度，μg/mL）

2.4 重組酵母GS-PKZ-CAMPs的基因表達(dá)分析 重組酵母GS-PKZ-CAMPs經(jīng)過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，提取其總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后（電泳條帶見(jiàn)圖5）結(jié)果顯示：GS-PKZ-CAMPs轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)PCR產(chǎn)物在2 000 bp左右存在明顯條帶，同時(shí)1 000 bp左右的條帶也符合重組質(zhì)粒的通用引物PCR結(jié)果，證明轉(zhuǎn)錄組中存在有CAMPs基因，即CAMPs基因已被成功表達(dá)。

圖5GS-PKZ-CAMPscDNA文庫(kù)通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（1%瓊脂糖凝膠）

3 討論

本試驗(yàn)成功從實(shí)驗(yàn)室已有的材料中提取出了CAMPs基因片段，并且通過(guò)Infusion技術(shù)成功將其插入pPIC9K和pPICZαA質(zhì)粒中，獲得了重組質(zhì)粒pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs。為了獲得大量的豬融合抗菌肽蛋白以供后續(xù)研究甚至產(chǎn)業(yè)化使用，我們通過(guò)設(shè)計(jì)畢赤酵母pPIC9K和pPICZαA雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在體內(nèi)增加豬融合抗菌肽基因拷貝量，從而在一定程度上增加了其蛋白表達(dá)量。

該系統(tǒng)結(jié)合了抗性篩選和雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化兩個(gè)步驟：從抗性篩選方面討論，pPIC9K質(zhì)粒中含有的kana抗性在同源重組進(jìn)入酵母基因組后會(huì)賦予酵母遺傳霉素抗性，參照Invitrogen公司的pPIC9K質(zhì)粒產(chǎn)品說(shuō)明，單拷貝的kana抗性基因能夠賦予畢赤酵母約0.25 mg/mL的遺傳霉素抗性，由于 kana基因與pPIC9K質(zhì)粒的表達(dá)盒之間存在遺傳連鎖效應(yīng)，故而可從酵母對(duì)遺傳霉素的抗性水平來(lái)篩選高拷貝量的重組子。同時(shí)，類(lèi)似的遺傳連鎖效應(yīng)對(duì)于pPICZαA和Zeocin也適用。

pPIC9K質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Sal I線(xiàn)性化后，能夠重組入畢赤酵母 GS115基因組的 his4基因位點(diǎn)中，而pPICZαA質(zhì)粒經(jīng)Sac I線(xiàn)性化后，則能重組進(jìn)入畢赤酵母GS115基因組的AOX1基因位點(diǎn)中。雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)在于，后轉(zhuǎn)化的pPICZαA質(zhì)?？梢酝粗亟M插入pPIC9K的5憶AOX1中。從而達(dá)到增加豬融合抗菌肽基因的拷貝數(shù)的目的[4]。

本試驗(yàn)成功將構(gòu)建的兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，確定豬融合抗菌肽基因能夠正確表達(dá)，對(duì)于大量表達(dá)豬融合抗菌肽蛋白有著重要意義。同時(shí)，抗菌肽融合蛋白可誘導(dǎo)表達(dá)體系建立，給豬融合抗菌肽蛋白的大規(guī)模發(fā)酵制備和應(yīng)用于動(dòng)物傳染病的防治奠定了可靠的初步基礎(chǔ)。

[1]Andreu D，Rivas L.Animal antimicrobial peptides: an overview[J].Biopolymers，1999，47（6）：415-433.

[2]陳福，羅玉萍，龔熹，等.抗菌肽耐藥性研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（11）：1786-1790.

[3]Bals R，Wang X，Meegalla R L，et al.Mouse β-defensin 3 is an inducible antimicrobial peptide expressed in the epithelia of multiple organs[J].Infection and Immunity，1999，67（7）：3542-3547.

[4]王慧，竇文芳，張曉梅，等.應(yīng)用雙質(zhì)粒共表達(dá)體系提高融合蛋白GGH在畢赤酵母GS115中的表達(dá)量[J].生物工程學(xué)報(bào)，2011，27（7）：983-989.

Construction of Recombinant Pichia Pastoris Transformed With Dual Plasmids for Fusion Genes of Porcine Antimicrobial Peptides

CHEN Qian，WAN Xiaoping，XIAO Yongle，et al.
（Life Science College of Sichuan University，Key Laboratory for Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry Education，Key Laboratory for Animal Disease Prevention and Food Safety of Sichuan Province，Sichuan Chengdu 610064，China）

In order to construct high effective expression recombinant yeast to produce economically novel fusion porcine antimicrobial peptide in large scale for the control of animal diseases，the experiment was conducted to clone the fusion CAMPs genes from the recombinant pGAPZαA-P vector constructed early in our laboratory.Then the two fusion genes were respectively inserted into expression plasmid pPIC9K and pPICZαA by Infusion cloning technology.The recombinant plasmids，named as pPIC9K-CAMPs and pPICZα-A-CAMPs，were successfully constructed and confirmed by PCR and sequencing analysis.After that，the linearized pPIC9K-CAMPs was inserted into pichia pastoris GS115 by electroporation，and screened for highcopy strain named as GS-PK-CAMPs.Then linearized pPICZαA-CAMPs was inserted into recombinant yeast GS-PK-CAMPs and screened for high-copy strain named as GS-PKZ-CAMPs.Next，induced fermentation of GS-PKZ-CAMPs was carried out to detect the expression of CAMPs gene.The final result showed that the recombinant pichia GS-PKZ-CAMPs strains with dual plasmids transformation was successfully obtained，which lay the reliable basis for future production of fusion antimicrobial peptides to promote the control level of animal infectious diseases.

Porcine antimicrobial peptides；Fusion gene；Co-expression；Dual plasmids transformation；Pichia pastoris

S818.9

B

1001-8964（2016）12-0028-04

2016-06-20

陳 騫（1990-），男，廣西資源縣人，碩士研究生，研究方向：獸用抗菌肽相關(guān)研究和真核表達(dá)體系的構(gòu)建。

*通訊作者：高 榮（1966-），男，四川西昌人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物免疫學(xué)、動(dòng)物傳染病和微生物學(xué)、基因工程學(xué)等。