劉思樂 康勁翮 譚支良 王 征

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128)

?

不同培養(yǎng)方法對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞生長及角蛋白18表達(dá)量的影響

劉思樂1,2康勁翮1*譚支良1王 征2*

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128)

本試驗(yàn)旨在研究不同培養(yǎng)方法對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞生長及角蛋白18(CK18)表達(dá)量的影響。采集42日齡山羊的瘤胃上皮組織，分別采用酶消化法和組織塊法對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過光學(xué)顯微鏡觀察原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)階段的細(xì)胞形態(tài)，檢測第5代山羊瘤胃上皮細(xì)胞的生長曲線，并采用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：1)經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化獲得的原代培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞于2d開始貼壁生長，5d細(xì)胞開始明顯增多，10d細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大。2)經(jīng)組織塊法獲得的原代培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞于4d開始“爬出”組織塊，8d細(xì)胞開始明顯增多，14d細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大。3)經(jīng)免疫熒光染色顯示2種方法獲得的細(xì)胞胞漿內(nèi)CK18均呈陽性表達(dá)且細(xì)胞純度后者明顯高于前者。4)組織塊法獲得的細(xì)胞CK18表達(dá)量顯著高于酶消化法(P<0.05)。綜合得出，與酶消化法相比，應(yīng)用組織塊法可成功獲得純度更高的山羊瘤胃上皮細(xì)胞。

山羊；瘤胃；上皮細(xì)胞；原代培養(yǎng)；分離；CK18

瘤胃是反芻動(dòng)物消化代謝和營養(yǎng)物質(zhì)吸收最重要的場所。瘤胃壁由黏膜、黏膜下層、肌層、漿膜4層構(gòu)成。瘤胃上皮屬于復(fù)層上皮，由黏膜向漿膜面分為4層：角質(zhì)化細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、棘狀細(xì)胞層和基底層。瘤胃上皮有著重要的生理作用，如養(yǎng)分吸收與運(yùn)輸、揮發(fā)性脂肪酸代謝、對(duì)瘤胃壁的保護(hù)。因此，研究其生長發(fā)育及生理功能被人們所關(guān)注。

近年來，國內(nèi)外對(duì)瘤胃上皮研究越來越多，并將瘤胃上皮組織或者細(xì)胞應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的病因、病理、營養(yǎng)等的研究。例如：Stumpff等[1]在研究蘇云金桿菌毒素Cry1Ab對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞膜的電流的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮細(xì)胞暴露在高濃度蘇云金桿菌毒素Cry1Ab下時(shí)保持不變的活力，與缺乏特定的膜受體插入該病毒無關(guān)；Oba等[2]研究蔗糖、乳糖、玉米淀粉在瘤胃發(fā)酵中的影響以及瘤胃上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用糖類代替玉米淀粉會(huì)影響瘤胃發(fā)酵和代謝調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH，以及細(xì)胞內(nèi)的發(fā)酵酸吮現(xiàn)象，并且蔗糖比乳糖的效果更好；王佩等[3]研究枯草芽孢桿菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)β-防御素-1基因的表達(dá)。

但是對(duì)于瘤胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法比較還未見報(bào)道，大多采用酶消化法來分離獲得瘤胃上皮細(xì)胞[4-6]，應(yīng)用組織塊法較少，且二者比較試驗(yàn)研究未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以期建立獲得純度更高的瘤胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為研究反芻動(dòng)物瘤胃相關(guān)功能提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品和試劑

試驗(yàn)動(dòng)物為4只42日齡湘東黑山羊，體重為(5.9±0.8) kg。頸靜脈放血致死，取出內(nèi)臟組織，分離瘤胃，去掉內(nèi)容物后用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，然后進(jìn)行樣本采集。

胎牛血清、DMEM/F12、胰蛋白酶、青鏈霉素均購自Gibco公司；角蛋白18(CK18)上皮細(xì)胞特異性抗體(一抗)購自Abcam公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、免疫染色固定液、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液、抗熒光猝滅劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白質(zhì)上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)電泳緩沖液、Western blot轉(zhuǎn)膜液、Western blot洗滌液、Western blot一抗稀釋液、Western blot二抗稀釋液、BeyoECL plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)均購自碧云天生物技術(shù)研究所；慶大霉素和兩性霉素B購自BBI公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；熒光標(biāo)記驢抗鼠二抗[Dylight 488Affinipure donkey anti-mouse IgG(H+L)]購自Earthox公司；Tritonx-100、牛血清白蛋白(BSA)均購自Amresco公司；100mm培養(yǎng)皿購自Corning公司。

1.2 酶消化法分離培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞

取出瘤胃組織，去除內(nèi)容物，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，鈍性剝離瘤胃上皮。用含500μg/mL青鏈霉素、5μg/mL兩性霉素B和慶大霉素的洗滌液沖洗瘤胃上皮，并放入含500μg/mL青鏈霉素、5μg/mL兩性霉素B和慶大霉素的DMEM/F12中帶回細(xì)胞培養(yǎng)室。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗瘤胃上皮組織2～3次。將瘤胃上皮組織塊盡量剪碎(約1mm3，肉眼觀察呈糊狀)，再用PBS和DMEM/F12各洗滌1次。棄去上清液，往沉淀中加入3倍體積的消化液[0.25%胰蛋白酶∶0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)為1∶1]，37℃空氣浴振蕩消化5min。共消化5次，每次消化完成后1000r/min條件下離心5min。前2次消化后用移液槍吸走懸液，因?yàn)榍?次消化后的懸液中大多為角質(zhì)細(xì)胞。后3次消化完成后，將3次的消化液依次加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)液[含5%胎牛血清、1%青鏈霉素、0.1mg/mL慶大霉素、2.5μg/mL兩性霉素B、5ng/mL表皮生長因子(EGF)、1μg/mL胰島素(insulin)、1μg/mL原運(yùn)鐵蛋白(apo-transferrin)、3.4nmol/L亞硒酸鈉]重懸細(xì)胞。然后過濾，收集的濾液1000r/min條件下離心5min后，倒掉上清液，往沉淀中加入PBS重懸細(xì)胞，繼續(xù)1000r/min條件下離心5min。接種細(xì)胞后置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。

1.3 組織塊法培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞

將剪碎后的上皮組織用PBS和DMEM/F12各洗滌1次，吸出組織塊均勻地平鋪在培養(yǎng)皿底壁。將培養(yǎng)皿倒置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中2h。為防止組織塊懸浮，再加入2mL DMEM/F12完全培養(yǎng)液，正置于培養(yǎng)箱中。次日，往100mm培養(yǎng)皿中補(bǔ)足10mL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的85%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞(組織塊法需先將組織塊用槍頭輕輕撥動(dòng)，棄去組織塊)。在培養(yǎng)皿中加入1mL消化液，放入37℃培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞開始變圓時(shí)，迅速用含血清的培養(yǎng)基終止消化。將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，1000r/min條件下離心5min，棄去上清液，加入適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。為了去除成纖維細(xì)胞，運(yùn)用差速貼壁法將重懸后的細(xì)胞加入到新的培養(yǎng)皿中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，吸出培養(yǎng)基至另一新皿中，再放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。將經(jīng)過2次差速貼壁的細(xì)胞以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

采用徠卡DMI 3000B型倒置顯微鏡觀察原代和傳代培養(yǎng)所獲細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況。

1.6 細(xì)胞免疫熒光鑒定

小心傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次。吸干液體后加入免疫染色固定液(4%多聚甲醛)，室溫固定細(xì)胞10min。去除固定液，PBS洗滌細(xì)胞2次。然后用0.1% Tritonx-100透化細(xì)胞7～10min，透化完成后PBS清洗細(xì)胞。用5% BSA封閉，室溫孵育1～2h后，去除封閉液，加入一抗(抗體稀釋倍數(shù)1∶200)，于4℃冰箱中孵育過夜。此一抗是具上皮特異性的，并適合山羊樣品檢測。次日，PBS洗3次。避光室溫孵育二抗1h后，再PBS洗3次。然后加入DAPI染色液500μL，室溫染色1～3min后，PBS洗3次。最后加入500μL抗熒光猝滅劑，熒光顯微鏡觀察拍照。

細(xì)胞純度=發(fā)綠光的細(xì)胞數(shù)/發(fā)藍(lán)光的細(xì)胞數(shù)。

1.7 各代次細(xì)胞的生長活性檢測

2種不同培養(yǎng)法各取第5代處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種方法取4個(gè)平行。培養(yǎng)24h后，加CCK-8試劑培養(yǎng)4h后測定450nm吸光度值(OD450nm)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線圖。

1.8 Western blot技術(shù)檢測2種方法培養(yǎng)的細(xì)胞CK18表達(dá)量

當(dāng)細(xì)胞長滿至培養(yǎng)皿85%以上時(shí)，用PBS洗滌。加入400μL蛋白質(zhì)裂解液，冰上靜置30min，每隔10min漩渦振蕩30s。然后于4℃高速離心機(jī)中12000×g條件下離心5min，收集上清。吸取1μL上清液，用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，在樣品中加入上樣緩沖液(5×)，并稀釋成同一濃度。

先后配制10%分離膠和5%濃縮膠，采用恒壓濃縮膠80V、分離膠120V電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。然后采用200mA電轉(zhuǎn)1.5h。電轉(zhuǎn)完成后用5% BSA于振蕩器上封閉2h。加入一抗，于4℃冰箱中孵育過夜。次日，再加入二抗在振蕩器上孵育1h。最后在膜上滴加顯影液，顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

Western blot得到的條帶采用Gel-Pro Analyzer 4分析灰度值，再將灰度值用SAS 8.2軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05為無顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 酶消化法培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)

通過倒置光學(xué)顯微鏡對(duì)酶消化法培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察，原代培養(yǎng)2d的瘤胃上皮細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞零星的開始抱團(tuán)(圖1-A箭頭所示)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在5d，瘤胃上皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但是有成纖維細(xì)胞(圖1-B箭頭所示)。當(dāng)瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)至10d后，細(xì)胞大多呈鋪路石狀(圖1-C箭頭所示)，細(xì)胞匯合呈單層，細(xì)胞數(shù)量已達(dá)到最大值，即將鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞相比，第5代細(xì)胞的形態(tài)無明顯變化(圖1-D)。

2.2 組織塊法培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)

通過倒置光學(xué)顯微鏡對(duì)組織塊法培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察，原代培養(yǎng)4d的瘤胃上皮細(xì)胞開始慢慢“爬出”組織塊(圖2-A箭頭所示)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在8d過后，瘤胃上皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞抱團(tuán)生長(圖2-B箭頭所示)。當(dāng)瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)至14d后，細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，有的甚至長至多層(圖2-C箭頭所示)。傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞相比，第5代細(xì)胞的形態(tài)無明顯變化(圖2-D)。

2.3 山羊瘤胃上皮細(xì)胞鑒定

利用CK18抗體對(duì)第5代瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果顯示，DIPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖3-A、圖3-B箭頭所示)，細(xì)胞質(zhì)呈陽性表達(dá)(圖3-C、圖3-D箭頭所示)，陰性對(duì)照細(xì)胞無熒光(圖3-G、圖3-H)，說明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。酶消化法培養(yǎng)的陽性瘤胃上皮細(xì)胞達(dá)約92%(圖3-E)，組織塊法的陽性瘤胃上皮細(xì)胞達(dá)約98%(圖3-F)，證明組織塊法獲得的瘤胃上皮細(xì)胞純度更高。

2.4 山羊瘤胃上皮細(xì)胞生長曲線

如圖4所示，組織塊法和酶消化法的第5代瘤胃平滑肌細(xì)胞的生長曲線均呈典型的“S”型。細(xì)胞增殖過程經(jīng)歷了潛伏期、對(duì)數(shù)生長期和平臺(tái)期。1～2d為細(xì)胞潛伏期，細(xì)胞生長比較緩慢；培養(yǎng)2d后，細(xì)胞增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，7d后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞數(shù)量不再增加。符合體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長增至規(guī)律[7]。從生長曲線中可發(fā)現(xiàn)，組織塊法培養(yǎng)出的細(xì)胞增殖活性高于酶消化法。

2.5 2種培養(yǎng)方法獲得山羊瘤胃上皮細(xì)胞CK18表達(dá)量

如圖5所示，CK18在組織塊法分離出的細(xì)胞中表達(dá)量較高，顯著高于酶消化法(P<0.05)。

A:原代培養(yǎng)2d的瘤胃上皮細(xì)胞;B:原代培養(yǎng)5d的瘤胃上皮細(xì)胞;C:原代培養(yǎng)10d的瘤胃上皮細(xì)胞;D:第5代瘤胃上皮細(xì)胞。A: primary ruminal epithelium cells after cultured for 2d; B: primary ruminal epithelium cells after cultured for 5d; C: primary ruminal epithelium cells after cultured for 10d; D: P5ruminal epithelium cells.

A:原代培養(yǎng)4d的瘤胃上皮細(xì)胞;B:原代培養(yǎng)8d的瘤胃上皮細(xì)胞;C:原代培養(yǎng)14d的瘤胃上皮細(xì)胞;D:第5代瘤胃上皮細(xì)胞。A: primary ruminal epithelium cells after cultured for 4d; B: primary ruminal epithelium cells after cultured for 8d; C: primary ruminal epithelium cells after cultured for 14d; D: P5ruminal epithelium cells.

A、B:DAPI細(xì)胞核染色;C、D:CK18呈陽性表達(dá)的細(xì)胞質(zhì);E:A與C疊加;F:B與D疊加;G、H:陰性對(duì)照。A and B: DAPI nuclear staining; C and D: CK18positive expression cytoplasm; E: the merging of A and C; F: the merging of B and D; G and H: negative control.

圖4 山羊瘤胃上皮細(xì)胞生長曲線Fig.4 Growth curve of ruminal epithelial cells of goats

3 討 論

常用的細(xì)胞原代培養(yǎng)培養(yǎng)方法有酶消化法和組織塊法[8]。早在1980年，Gálfi等[9]首次培養(yǎng)牛的瘤胃上皮細(xì)胞時(shí)采用剪切瘤胃乳頭的方法，并應(yīng)用系列酶消化法對(duì)原代瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行分離及培養(yǎng)，成功建立了牛的瘤胃上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。但是該方法獲得的瘤胃上皮細(xì)胞純度不高，對(duì)試驗(yàn)研究有一定的限制作用。利用組織塊原代細(xì)胞是最簡單方便的方法。由于該方法未經(jīng)任何酶的處理，因此能夠獲得活性很高且增殖旺盛的細(xì)胞，這為建立細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)[10]。

*顯著差異 Significant difference (P<0.05)。

試驗(yàn)選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為適合于大部分上皮組織細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM/F12，此外本試驗(yàn)與其他山羊瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)最大的不同就是在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加EGF、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒，以利于細(xì)胞的生長，能在更短的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞至可試驗(yàn)狀態(tài)，以利于后期試驗(yàn)的開展。高玉花等[11]在培養(yǎng)禽類羊膜上皮細(xì)胞時(shí)添加了EGF，馬瑞麗等[12]在培養(yǎng)豬口腔黏膜上皮細(xì)胞時(shí)則是添加了一定濃度的胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒。

酶消化法在分離上皮細(xì)胞的過程中使用了0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，根據(jù)孫志洪等[13]的研究表明,上皮細(xì)胞在0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA的條件下消化可獲得理想的細(xì)胞分離效果以及細(xì)胞增殖活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同種類的上皮細(xì)胞所需消化的時(shí)間不同，獲得人的上皮細(xì)胞需要消化時(shí)間較長[14]，北京油雞的上皮細(xì)胞消化時(shí)間為5min[11]。本試驗(yàn)對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞的消化時(shí)間也是采用5min。前期以消化時(shí)間為變量做預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5min的消化時(shí)間能得到的山羊瘤胃上皮細(xì)胞活力最好，當(dāng)消化時(shí)間達(dá)到15min時(shí)，細(xì)胞貼壁生長效果不好。并且為了得到更純的瘤胃上皮細(xì)胞，不收集前2次的消化液，因?yàn)榍?次消化液中含較多的角質(zhì)細(xì)胞，只取后3次的消化液。

在分離培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞時(shí)，酶消化法與組織塊法相比，就細(xì)胞活性而言，后者分離培養(yǎng)出的細(xì)胞活性明顯要高于前者，沈晴昳[15]在研究不同原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞時(shí)也證實(shí)了這點(diǎn)。因?yàn)榻?jīng)長時(shí)間或者高濃度酶消化作用后大量細(xì)胞被滅活，甚至可破壞細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞表面通透性升高，活力下降，生長緩慢[15]。從細(xì)胞的純度方面，雖然組織塊法在培養(yǎng)原代山羊瘤胃細(xì)胞時(shí)會(huì)比酶消化法夾雜更多的成纖維細(xì)胞[16]，但是在傳第2代細(xì)胞時(shí)前者可以只將長有上皮細(xì)胞的區(qū)域刮下來，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，從而在第2代的上皮細(xì)胞中就基本只存在山羊瘤胃上皮細(xì)胞，使細(xì)胞純度大大提高。這與郝白露等[17]在研究改良的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法所得的結(jié)果相同。從獲得細(xì)胞的成功率方面，組織塊法成功率較高,其可能原因是酶消化法的消化程度不易掌握[17]。組織塊消化的快慢與組織塊的大小、振蕩頻率、膠原酶類型、酶活性及濃度等諸多因素有關(guān)[18]。從獲得細(xì)胞的快慢方面，酶消化法的培養(yǎng)周期相對(duì)較短[19]，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，并且比組織法原代培養(yǎng)時(shí)間短4～5d。

角蛋白存在于上皮細(xì)胞胞漿中構(gòu)成上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架，是上皮細(xì)胞中特異性的抗原，具有多種表型。本試驗(yàn)采用上皮特異性的CK18作為一抗，采用免疫熒光染色對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)獲得的瘤胃上皮細(xì)胞經(jīng)CK18免疫細(xì)胞熒光染色后，胞質(zhì)著色，呈陽性反應(yīng)，高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)呈綠色，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞，且組織塊分離出來的細(xì)胞純度較高[20]。這與周傳麗等[21]分離培養(yǎng)、鑒定仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞時(shí)，通過檢測CK18的表達(dá)鑒定上皮細(xì)胞是一致的。同時(shí)，李文清等[22]在鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，也是用CK18免疫細(xì)胞熒光染色鑒定上皮細(xì)胞。

由于原代細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不可避免地會(huì)參雜有成纖維細(xì)胞，利用成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間短于瘤胃上皮細(xì)胞這一特點(diǎn)[23]，在細(xì)胞消化后，運(yùn)用差速貼壁法將細(xì)胞先培養(yǎng)30min，去除部分成纖維細(xì)胞，吸出上清液至另一培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，再次靜置、貼壁。此步驟重復(fù)1次，提高瘤胃上皮細(xì)胞純度。利用此方法多次傳代后可使細(xì)胞達(dá)到較高的純度。隨著傳代次數(shù)的增加，瘤胃上皮細(xì)胞可排擠成纖維細(xì)胞的生長而優(yōu)勢增殖。

4 結(jié) 論

① 本研究通過組織塊法、酶消化法分離培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞，兩者都能成功培養(yǎng)出山羊瘤胃上皮細(xì)胞。組織塊法分離培養(yǎng)出來的細(xì)胞純度、生長活性和CK18表達(dá)量均更高。

② 當(dāng)需要用高純度、高活性的山羊瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，組織塊法是更安全、穩(wěn)妥的培養(yǎng)方法；當(dāng)需要快速獲得大量山羊瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，酶消化法是更適合的培養(yǎng)方法。

[1] STUMPFF F,BONDZIO A,EINSPANIER R,et al.Effects of theBacillusthuringiensistoxin Cry1Ab on membrane currents of isolated cells of the ruminal epithelium[J].Journal of Membrane Biology,2007,219(1/2/3):37-47.

[2] OBA M,MEWIS J L,ZHINING Z.Effects of ruminal doses of sucrose,lactose,and corn starch on ruminal fermentation and expression of genes in ruminal epithelial cells[J].Journal of Dairy Science,2015,98(1):586-594.

[3] 王佩,范燕茹,金鑫,等.枯草芽孢桿菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1表達(dá)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,46(5):760-767.

[4] SCHLAU N,GUAN L L,OBA M.The relationship between rumen acidosis resistance and expression of genes involved in regulation of intracellular pH and butyrate metabolism of ruminal epithelial cells in steers[J].Journal of Dairy Science,2012,95(10):5866-5875.

[5] 盧勁曄,盧煒,劉靜,等.IGF-1促進(jìn)山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,37(5):106-110.

[6] 郭立輝.VFA對(duì)亞急性瘤胃酸中毒肉牛瘤胃上皮細(xì)胞炎性信號(hào)通路的影響[D].碩士學(xué)位論文.長春:吉林大學(xué),2015.

[7] 成海建,臧坤,劉曉牧,等.不同培養(yǎng)方法對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞增殖分化的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2013,25(4):864-869.

[8] XU S W,FU J J,CHEN J W,et al.Development of an optimized protocol for primary culture of smooth muscle cells from rat thoracic aortas[J].Cytotechnology,2009,61(1/2):65-72.

[10] 詹康,左曉昕,貢笑笑,等.不同培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)及酪蛋白表達(dá)的差異[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(7):2241-2247.

[11] 高玉花,張文秀,吳芳春,等.北京油雞羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分化潛能的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,44(2):211-219.

[12] 馬瑞麗,張彥明,崔紅杰,等.新生仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,44(9):1445-1453.

[13] 孫志洪,張慶麗,賀志雄,等.山羊瘤胃上皮細(xì)胞和空腸黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)研究[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(3):602-610.

[14] LI H,NIEDERKORN J Y,NEELAM S,et al.Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,2005,46(3):900-907.

[15] 沈晴昳.不同原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的研究[J].天津醫(yī)藥,2011,39(2):139-141.

[16] 詹康,左曉昕,貢笑笑,等.雞胚小腸上皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(7):2150-2156.

[17] 郝白露,楊瑞峰,彭祥熾,等.改良的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法[J].中國計(jì)劃生育學(xué)雜志,2013,21(1):44-49.

[18] 段永芳,劉繼紅.家兔陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法對(duì)比研究[J].中國男科學(xué)雜志,2002,16(3):197-200.

[19] 何曉琳,李月紅,張祥宏,等.人正常食管鱗狀上皮不同原代培養(yǎng)方法的比較[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(6):681-687.

[20] 范燕茹,王佩,金鑫,等.中國馴鹿瘤胃上皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(11):8-10,15.

[21] 周傳麗,劉錚鑄,俞英,等.仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(21):4516-4524.

[22] 李文清,王加啟,南雪梅,等.奶牛乳腺上皮細(xì)胞的不同培養(yǎng)方法比較及激素和細(xì)胞因子對(duì)β-酪蛋白mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,26(9):2607-2614.

[23] DEHORITY B A,TIRABASSO P A.Effect of feeding frequency on bacterial and fungal concentrations,pH,and other parameters in the rumen[J].Journal of Animal Science,2001,79(11):2908-2912.

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Different Culture Methods on Growth and Keratin 18 Expression of Ruminal Epithelium Cells of Goats

LIU Sile1,2KANG Jinhe1*TAN Zhiliang1WANG Zheng2*

(1.KeyLaboratoryofAgro-EcologicalProcessesinSubtropicalRegion,InstituteofSubtropicalAgriculture,ChineseAcademyofSciences,KeyLaboratoryofAgro-EcologicalProcessesinSubtropical>RegionofHunanProvince,Changsha410125,China; 2.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)

This research aimed to study the effects of different culture methods on growth and keratin 18(CK18) expression of ruminal epithelium cells of goats. The test proceeded with ruminal epithelium cells of goats aged 42days, and the cells were cultured using the methods of enzyme digestion and tissue mass culture. The morphology of cells at the stages of primary culture and subculture was observed under the optical microscope, and the growth curve of the fifth generation of ruminal epithelium cells of goat was tested, meanwhile, ruminal epithelium cells were identified using cell immune fluorescence method. The results showed as follows: 1) the primary cultured ruminal epithelium cells of goats obtained by digestion of 0.25% trypsin and 0.02% ethylenediamine tetra-acetate began adherent growth on the 2nd day. There was a significant increase in cell number on the 5th day, and the cell number reached a maximum at the 10th day. 2) The primary cultured ruminal epithelium cells of goats obtained by tissue mass culture began ‘escape’ from the tissue mass on the 4th day. There was a significant increase in cell number on the 8th day, and the cell number reached a maximum at the 14th day. 3) The CK18in cytoplasm of cells obtained by the 2methods exhibited a positive reaction by immune fluorescence staining, and cell purity was higher in tissue mass culture method. 4) Tissue mass culture method expressed significantly higher CK18compared with enzyme method (P<0.05). In conclusion, ruminal epithelium cells of goats were successfully obtained with high purity using the method of tissue mass culture.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(4)：1225-1232]

goat； rumen； epithelium cell； primary culture； isolation； CK18

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.04.034

2015-11-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201826)；中央駐湘科研機(jī)構(gòu)技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)(2013TF3006)

劉思樂(1991—)，男，湖南長沙人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究。E-mail: 349162439@qq.com

*通信作者：康勁翮，助理研究員，E-mail: kangjh@isa.ac.cn；王 征，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: 1448367314@qq.com

S826

A

1006-267X(2016)04-1225-08

*Corresponding authors: KANG Jinhe, assistant researcher, E-mail: kangjh@isa.ac.cn；WANG Zheng， professor， E-mail: 1448367314@qq.com